专利名称：一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体涉及一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，同时还涉及采用该卵巢癌肿瘤标志物j1e4化学发光免疫检测试剂盒检测卵巢癌肿瘤标志物j1e4的方法。
背景技术：
卵巢癌发病隐匿，预后差，被形容为最为致命的癌症之一。卵巢癌的早期症状很不明显，初期症状是腹部疼痛或膨胀、肠胃消化不良，不易引起足够重视，一般卵巢癌患者发现时都到了晚期，因此治愈率极低。如果能在早期发现卵巢癌就可大大提高卵巢癌的治愈率，为了达到这一目的，人们进行了大量的研究工作。
ca125是一种诊断卵巢癌和监测其复发最敏感的指标之一，但ca125在患者发病早期往往检测不到，其临床应用有一定的局限性。鉴于此，国内外的专家学者都致力于寻找更为有效的标志物，以便能在早期确诊卵巢癌。人附睾分泌蛋白4 (human epididymis protein 4，he4)最早在人附睾上皮细胞中发现。1999年,schummer等发现he4的mrna在卵巢癌组织中高表达,而在正常组织中低表达或不表达。2003年，hellstrom等发现卵巢癌患者血清中he4含量也比正常人有明显增高，因此，j1e4作为一个卵巢癌新的标志物得到了更加深入的研究。hellstrom等证实，在特异性为100%的情况下，he4检测卵巢癌的灵敏度为60%，而ca125作为卵巢癌的标志物检测的灵敏度仅为13%，特别是he4检测早期卵巢癌的优势更加明显优于ca125。
发明内容
本发明的目的是提供一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒。本发明的目的还在于提供一种采用该卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒检测卵巢癌肿瘤标志物j1e4的方法。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒包括9f3抗体包被的微孔板、碱性磷酸酶标记的ioel抗体、分析缓冲液、底物工作液、发光底物、洗涤液、质控品。其中，所述9f3抗体包被的微孔板的制备方法为把9f3抗体用包被缓冲液稀释至0. i微克/微升，制得9f3抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50微升的9f3抗体包被液，于37°c包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100微升的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得9f3抗体包被的微孔板，密封于铝箔袋中，4°c保存备用。进一步的，所述包被缓冲液的制备方法为取浓度为0. 05mol/l、ph值为9. 6的碳酸盐缓冲液，向其中加入nan3，制得包被缓冲液，包被缓冲液中nan3的质量百分比浓度为0. 2%。
所述封板液的制备方法为向浓度为0. olmol/l、ph值为7. 4的pbs缓冲液中加入bsa (牛血清白蛋白)和nan3，制得封板液，制得的封板液中bsa的质量百分比浓度为1%，nan3的质量百分比浓度为0. 2%。所述碱性磷酸酶标记的ioel抗体的制备方法为取2毫克的碱性磷酸酶、4毫克的ioel抗体，然后加入pbs缓冲液中，搅拌下，再向pbs缓冲液中加入0. 05毫升的戊二醛，制得混合溶液，所述混合溶液的体积为0. 5毫升，继续在室温下搅拌15分钟，然后避光反应4小时，之后再向所述混合溶液中加入乙醇胺，乙醇胺的浓度为0. imol/l,室温搅拌2小时，4°c下pbs透析过夜，之后与等体积的甘油混合，然后加入nan3, nan3的加入量要使nan3的质量百分比浓度为0. 1%，制得碱性磷酸酶标记的ioel抗体，于4°c保存备用。所述分析缓冲液的制备方法为向浓度为0. olmol/l、ph值为8. 0的tris-hcl缓
冲液中加入bsa和nan3，搅拌均匀，制得分析缓冲液，所述分析缓冲液中bsa的质量百分比浓度为1%，nan3的质量百分比浓度为0. 2%。所述底物工作液的制备方法为取600微升二乙醇胺、100微升浓度为imol/l的naoh溶液、100微升浓度为imol/l的mgcl2溶液、100微升质量百分比浓度为10%的nan3溶液，混匀，高压蒸汽灭菌，制成底物缓冲液；量取800微升所述底物缓冲液，然后向底物缓冲液中加入200微升发光底物增强剂(发光底物增强剂为发光底物的配套使用产品，购自bio-rad公司)和50微升发光底物，然后于灭菌容器内混匀，制得底物工作液。所述发光底物选自amppd、cspd、cdp-star中的任一种。发光底物优选为csto。所述洗涤液的制备方法为在浓度为0. 01mol/l、ph值为7. 4的pbs缓冲液中加入吐温20和nan3，搅拌均匀，制得洗涤液，所述洗涤液中吐温20的质量百分比浓度为0. 05%,nan3的质量百分比浓度为0. 2%。所述质控品为he4标准品。在制备9f3抗体包被的微孔板时，微孔板可以选择24孔、48孔或96孔板，优选是96孔板。一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测方法，采用双抗体夹心法，包括以下步骤(i)将待测样品与具有浓度梯度的he4标准品溶液分别加入9f3抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能与j1e4结合的碱性磷酸酶标记的10e1抗体，之后加入发光底物，进行检测，得到检测结果；(2)根据测定的具有浓度梯度的he4标准品溶液的发光强度值做标准曲线；(3)以测定的待测样品的发光强度值和标准曲线的发光强度值做比较，得出待测样品中he4的含量。其中，所述待测样品为人体血清。化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay, clia)是将高灵敏度的化学发光测定技术和高选择性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、蛋白质、维生素、药物等的检测分析技术。是继酶免、放免、荧光、时间分辨荧光分析之后发展起来的一项免疫测定技术。化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzymeimmunoassay, cleia)属于酶免疫分析,只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免疫分析完全相同，以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，用发光信号测定仪进行发光测定。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测方法，以购买的重组he4蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体，对获得的单克隆抗体分别做配对测试、亲和力测试、交叉反应测试，得到两株杂交瘤细胞株ioel和9f3，杂交瘤细胞株ioel和9f3分泌的抗体能配对使用并且具有高特异性和高亲和力，ioel抗体的亲和力常数达到10_nm/l，9f3抗体的亲和力常数达到10_12m/l，ioel抗体和9f3抗体分别可以与he4不同的抗原决定簇结合，通过用碱性磷酸酶(alp)标记的ioel抗体作为检测抗体，以未标记的9f3抗体作为捕获抗体包被在固相载体上，建立了检测的双抗体夹心法，实现了卵巢癌肿瘤标志物he4的化学发光免疫分析检测，为卵巢癌的早期诊断、疗效观察及预后判断提供了一种可靠的检测方法。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒 常好的线性范围，其线性范围为0. 5纳克/毫升 1200纳克/毫升，检测限为0. 2纳克/毫升。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物j1e4化学发光免疫检测试剂盒的批间精密度< 8%，批内精密度< 5%。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对卵巢癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义。
图i为本发明实施例i购买的重组he4蛋白的sds-page电泳图；图2为本发明实施例2得到的双对数标准曲线图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。实施例i本实施例提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，包括9f3抗体包被的微孔板、碱性磷酸酶标记的ioel抗体、分析缓冲液、底物工作液、发光底物、洗涤液、质控品。9f3抗体包被的微孔板的制备方法为把9f3抗体用包被缓冲液稀释至0. i微克/微升，制得9f3抗体包被液，然后向微孔板的每个孔中分别加入50微升的9f3抗体包被液，于37°c包被2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板三次，然后再向微孔板的每个孔中分别加入100微升的封板液，于室温封闭2小时，然后用生理盐水冲洗微孔板两次，冷冻干燥，制得9f3抗体包被的微孔板，密封于铝箔袋中，4°c保存备用。其中，包被缓冲液的制备方法为取浓度为0. 05mol/l、ph值为9. 6的碳酸盐缓冲液，向其中加入nan3，制得包被缓冲液，包被缓冲液中nan3的质量百分比浓度为0. 2%。封板液的制备方法为向浓度为0. 01mol/l、ph值为7. 4的pbs缓冲液中加入bsa和nan3，制得封板液，制得的封板液中bsa的质量百分比浓度为l%，nan3的质量百分比浓度为 0. 2%。碱性磷酸酶标记的ioel抗体的制备方法为取2毫克的碱性磷酸酶、4毫克的ioel抗体，然后加入pbs缓冲液中，搅拌下，再向pbs缓冲液中加入0. 05毫升的戊二醛，制得混合溶液，混合溶液的体积为0. 5毫升，继续在室温下搅拌15分钟，然后避光反应4小时，之后再向混合溶液中加入乙醇胺，乙醇胺的浓度为0. imol/l，室温搅拌2小时，4°c下pbs透析过夜，之后与等体积的甘油混合，然后再加入nan3, nan3的加入量要使nan3的质量百分比浓度达到0. 1%，制得碱性磷酸酶标记的ioel抗体，于4°c保存备用。分析缓冲液的制备方法为向浓度为0. olmol/l、ph值为8. 0的tris-hcl缓冲液中加入bsa和nan3,搅拌均匀，制得分析缓冲液，分析缓冲液中bsa的质量百分比浓度为1%，nan3的质量百分比浓度为0. 2%。底物工作液的制备方法为取600微升二乙醇胺、100微升浓度为imol/l的naoh溶液、100微升浓度为imol/l的mgcl2溶液、100微升质量百分比浓度为10%的nan3溶液，混匀，高压蒸汽灭菌，制成底物缓冲液；量取800微升底物缓冲液，然后向底物缓冲液中加a 200微升发光底物增强剂(该发光底物增强剂为发光底物csro的配套销售产品，购自bio-rad公司)和50微升csro (购自bio-rad公司)，然后于灭菌容器内混匀，制得底物工 作液。发光底物为csro (购自bio-rad公司)。洗涤液的制备方法为在浓度为0. 01mol/l、ph值为7. 4的pbs缓冲液中加入吐温20和nan3，搅拌均匀，制得洗涤液，洗涤液中吐温20的质量百分比浓度为0. 05%, nan3的质量百分比浓度为0. 2%。质控品为he4标准品。其中，9f3抗体和10e1抗体的制备过程为(i)小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体a、抗体细胞株的建立用常规方法对balb/c小鼠进行免疫，初次免疫将100微克重组抗原he4蛋白(购自abnova公司，重组he4蛋白的sds-page电泳图见图i所示)与弗氏完全佐剂充分乳化后，腹腔或皮下多点注射，以后每隔两周将50微克重组he4蛋白与弗氏不完全佐剂混合后注射，共免疫四次。细胞融合前三天加强免疫一次。从第二次免疫开始，每次免疫后的第七天尾静脉采集小鼠血，采用间接elisa方法检测血清效价达到1:50000以上的小鼠，取出小鼠的脾脏，制成脾细胞悬液。在peg的融合作用下与sp2/0细胞融合，并在hat选择培养基上筛选单克隆。经过2-3次融合与3-5轮的筛选，共得到26株分泌抗he4抗体的单克隆杂交瘤细胞株。b、抗体配对用elisa方法做抗体配对测试，结果显示，10e1和9f3，3a2和4e7配对良好。(2)单克隆抗体的鉴定亚型分类用sigma公司的鼠单抗亚型分类试剂盒通过elisa法确定单克隆抗体的亚型。结果显示，10e1和3a2为iggl型，9f3和4e7为igg2a型。亲和力的测定以间接elisa法进行相对亲和力测定。用i微克/毫升的he4包被载体板，以抗体浓度为横坐标，将抗体做系列稀释，以带有hrp (辣根过氧化物酶)羊抗鼠抗体显色，以酶标仪检测的od值为纵坐标，以曲线上趋于平坦的od值为100%，查出其od值为50%点的抗体浓度，此浓度值越低抗体的亲和力就越高。经测定值换算，10e1达到10_nm/l，9f3 达至ij 1(t12m/l，3a2 达到 1(t9m/l，4e7 达到 1(t10m/l。特异性分析将所得到的单克隆抗体与系列的和he4近似的无关蛋白质，以及不含he4的人血清做测试分析，结果显示ioel和9f3均没有和无关抗原的交叉反应，而3a2和4e7有交叉反应。(3)小鼠腹水制备单克隆抗体以500微升弗氏不完全佐剂致敏一只balb/c小鼠，致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞悬液，细胞数为ix 107，10天后采集小鼠腹水，12000转高速离心，收集上清，用proteina进行纯化,制得9f3抗体和ioel抗体，brodford法测定抗体浓度,加入蛋白保护齐u，于_70°c保存。实施例2本实施例提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测方法，采用本发明实施例i提供的试剂盒，包括以下步骤(i)向pbs缓冲液中加入bsa，配制成bsa质量百分比浓度为1%的bsa的pbs缓 冲液，用该缓冲液稀释购买的重组蛋白，制成具有系列浓度梯度的重组he4蛋白标准品溶液；(2)分别取50微升待测样品人体血清和50微升具有系列浓度梯度的重组he4蛋白标准品溶液，加入9f3抗体包被的微孔板的不同孔中，之后加入alp标记的ioel抗体工作液(i :2000) 50微升，之后加入发光底物csro，震荡均匀，37°c温育i小时，用洗涤液洗5次，在吸水纸上控干，再加入底物工作液和分析缓冲液各50微升，室温避光反应10分钟后，在发光仪上测定发光强度。把不同浓度的he4标准品的浓度值(浓度单位为纳克/毫升)和测得的发光强度(单位为rlu)数据做双对数处理，绘制出双对数标准曲线，得到的双对数标准曲线见图2所示，其中横坐标为he4浓度对数值，纵坐标为发光强度对数值。待测样品人体血清中he4的浓度可按双对数标准曲线计算得出。从测得的双对数标准曲线图2可以看出，试剂盒有着非常好的线性范围，线性范围为0. 5纳克/毫升 1200纳克/毫升，检测限为0. 2纳克/毫升。
权利要求
1.一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括9f3抗体包被的微孔板、碱性磷酸酶标记的ioei抗体、分析缓冲液、底物工作液、发光底物、洗涤液、质控品。
2.根据权利要求i所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述分析缓冲液的制备方法为向浓度为o. 01mol/l、ph值为8. o的tris-hcl缓冲液中加入bsa和nan3，搅拌均匀，制得分析缓冲液，所述分析缓冲液中bsa的质量百分比浓度为1%，nan3的质量百分比浓度为o. 2%。
3.根据权利要求i所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述底物工作液的制备方法为取600微升二乙醇胺、100微升浓度为imol/l的naoh溶液、100微升浓度为imol/l的mgcl2溶液、100微升质量百分比浓度为10%的nan3溶液，混匀，高压蒸汽灭菌，制成底物缓冲液；量取800微升所述底物缓冲液，然后向底物缓冲液中加入200微升发光底物增强剂和50微升发光底物，然后于灭菌容器内混匀，制得底物工作液。
4.根据权利要求i或3所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物选自amph)、cspd、cdp-star中的任一种。
5.根据权利要求4所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述发光底物为csro。
6.根据权利要求i所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的制备方法为在浓度为o. 01mol/l、ph值为7. 4的pbs缓冲液中加入吐温20和nan3，搅拌均匀，制得洗涤液，所述洗涤液中吐温20的质量百分比浓度为o. 05%, nan3的质量百分比浓度为o. 2%。
7.根据权利要求i所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述质控品为he4标准品。
8.一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测方法，其特征在于，采用双抗体夹心法，包括以下步骤 (1)将待测样品与具有浓度梯度的he4标准品溶液分别加入9f3抗体包被的微孔板的不同孔中，然后再向孔中加入能与he4结合的碱性磷酸酶标记的ioel抗体，之后加入发光底物，进行检测，得到检测结果； (2)根据测定的具有浓度梯度的he4标准品溶液的发光强度值做标准曲线； (3)以测定的待测样品的发光强度值和标准曲线的发光强度值做比较，得出待测样品中he4的含量。
9.根据权利要求8所述的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测方法，其特征在于，所述待测样品为人体血清。
全文摘要
本发明涉及生物和医学检测技术领域，具体公开了一种卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，同时还公开了采用该卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒检测卵巢癌肿瘤标志物he4的方法。该卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒包括9f3抗体包被的微孔板、碱性磷酸酶标记的10e1抗体、分析缓冲液、底物工作液、发光底物、洗涤液、质控品。本发明提供的卵巢癌肿瘤标志物he4化学发光免疫检测试剂盒，线性范围为0.5纳克/毫升～1200纳克/毫升，检测限为0.2纳克/毫升，可用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断，对卵巢癌肿瘤的治疗和预防具有重要意义。
文档编号g01n33/577gk102735846sq201210198739
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者王嘎, 程自卿 申请人:河南生生医疗器械有限公司