一种多重mirna肿瘤标志物检测方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于癌症检测技术领域，尤其涉及一种多重mirna肿瘤标志物检测方法及其应用。
【背景技术】
[0002]对于癌症的防治来说，早期发现、早期诊断是关键。即在患者出现临床症状前或在癌症发生浸润前实现确诊，从而使患者得到及时治疗，进而改善预后，达到提高治愈率、降低死亡率的目的。
[0003]目前临床中肿瘤最常用的检查方法是影像学及血清标志物检验，但这些方法往往只能在肿瘤发展到一定的程度后才能检测出来。寻找新的肿瘤标志物并对其进行准确检测一直都是癌症治疗的关键前提步骤。肿瘤标志物在癌症的早期诊断、个体化治疗、预后判断等诸多方面都具有重要作用，较常见的肿瘤标志物有蛋白酶类、肿瘤特异性抗原、肿瘤代谢产物、激素、癌基因和抑癌基因及甲基化dna等。尽管越来越多的肿瘤标志物已经被发现并应用于癌症的普查、诊断和疗效的监控，但是它们的临床应用效果还存在着明显不足，而且目前肿瘤标志物的检测大多程序繁杂且灵敏度低，从而限制了其临床应用。
[0004]microrna (mirna)是一类内源性、长19至24个核苷酸的非编码单链rna分子。它主要通过碱基互补配对与指导蛋白质合成的信使rna(messager rna，mrna)相结合，导致其翻译受阻或降解，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。然而，除了与人类的许多正常的生理活动相关，mirna也与癌症的发生、发展存在千丝万缕的联系。由于mirna的变化早于基因和蛋白质的改变，也早于疾病症状的出现，由此检测mirna的动态变化，有可能为疾病的发生、发展提供线索，进而指导临床早期干预，有效控制疾病发展。不同肿瘤具有不同的mirna表达模式，通过mirna表达谱的分析，将有助于临床上对肿瘤进行诊断、分期及预后的估计。因此，mirna将成为肿瘤早期诊断及预后评估的新肿瘤标志物。
[0005]尽管mirna作为肿瘤标志物检测在癌症筛查和早期诊断中具有明显的优势，但是在我国广大的肺癌高危人群中却未能得到应用，其根本原因是缺乏一种低成本、高通量的多重mirna检测技术。mirna的超小尺寸与超低浓度使许多传统核酸检测技术对之“无可奈何”。例如:对于经典的实时焚光定量核酸扩增反应(real-time quantitative polymerasechain react1n，rt-qpcr)来说，目标mirna的超小尺寸导致要使用过短的寡核苷酸链引物，造成了解链温度(melting temperature, tm)的降低，影响了扩增的效率；其结果还可能会受mirna前体(mirna precursor, pre-mirna)的干扰。并且，目前还难以基于rt-qpcr开发出多重mirna检测技术，每增加i个目标mirna的检测即增加i个反应所需样本量，这对珍贵的临床肿瘤样本是不可接受的。mirna芯片技术因为可以实现快速、多重mirna检测而得到极大发展。但是mirna的超小尺寸使得芯片上核酸探针与目标mirna杂交的严格性降低；且杂交过程中产生的碱基错配或部分互补会引起结果的假阳性率升高。除此之外，以上技术在实际应用时还需要特殊的检测设备、复杂的操作程序和专门的结果读取方法，这无疑将造成使用成本的大幅度上升。
[0006]液相芯片，又称悬浮阵列、流式焚光技术，是基于美国luminex公司的xmap (fiexiblemult1-analyte profiling)技术开发的多功能生物芯片平台，是目前唯一得到美国食品和药品监督管理局(fda)批准用于临床的高通量、多重诊断技术。这种技术通过使用荧光染色编码5.6 μ m磁性聚苯乙烯微球可以同时对不同目标mirna进行检测，最多可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100种mirna。与固相芯片相比，因为核酸杂交反应是在悬浮溶液中进行，更有利于探针与目标mirna杂交，并能最大程度地避免固态芯片中探针之间的交叉反应。但是由于耗材昂贵与专利技术垄断，极高的使用成本阻碍了这一先进诊断技术在临床上的推广。
[0007]综上所述，尽管利用mirna肿瘤标志物检测进行肺癌筛查与早期诊断已经有了许多重要进展，但是目前这一策略仍只停留在实验室阶段，阻碍其成为临床应用的最大障碍是缺乏一种精确且廉价的多重mirna检测技术。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种多重mirna肿瘤标志物检测方法及其应用，旨在解决上述【背景技术】中的不足。
[0009]本发明是这样实现的，一种多重mirna肿瘤标志物检测方法，包括以下步骤:
[0010](i)对临床血液样本进行前处理，获取包含有目标mirna的总rna样本溶液；
[0011](2)将样本溶液与等量dna-rna嵌合探针混合后，通过升温和降温退火的方式，使探针的rna部分与其目标mirna杂交，得到嵌合探针；
[0012](3)将5’端修饰氨基的dna捕捉序列与活化后的酶标板孔中的化学基团通过酰胺反应进行连接；
[0013](4)将步骤⑵中得到的嵌合探针加入到步骤(3)中已连接dna捕捉序列的酶标板孔中进行核酸链之间的杂交作用，形成酶标板-嵌合探针-mirna复合物；
[0014](5)往酶标板孔中加入核糖核酸酶降解双链rna中发生错配或部分互补的单链rna ；
[0015](6)通过化学发光法检测目标mirna量。
[0016]优选地，在步骤(i)中，所述前处理具体为:将血浆与血清样本用0.05m ph 7.4的tris-hcl缓冲液稀释至原体积的20倍，加入5u/ml蛋白酶k (proteinase k)与3% edta，在37°c消化2小时，添加5%至10% tween 20表面活性剂后混合30分钟，去除结合着mirna的蛋白质，释放mirna ;再加入10u/ml dna酶i，37°c反应i小时，得到包含有目标mirna的总 rna0
[0017]优选地，在步骤⑵中，所述dna-rna嵌合探针的种类数量由要检测的目标mirna数量决定；其中，所述dna-rna嵌合探针的rna部分与其对应的目标mirna完全互补且，5’端标记b1tin，所述dna-rna嵌合探针的dna部分与要连接在酶标板上的对应dna捕捉序列完全互补。
[0018]优选地，所述dna-rna嵌合探针的dna部分的序列为:
[0019]5 ’ -tacttctttactacaatttacaac-3’。
[0020]优选地，在步骤(3)中，所述酶标板为马来酸酐表面改性96/384孔酶标板；
[0021 ]所述 dna 捕捉序列为:5’ -gttgtaaattgtagtaaagaagta-3’。
[0022]优选地，在步骤(6)中，所述化学发光法具体为:加入200 μ g/ml的sa-hrp，该蛋白与探针上b1tin标记迅速结合；然后用pbs清洗三遍，然后添加thermo scientific公司的化学发光试剂，利用该蛋白上连接的hrp与试剂中的luminol-h2o2发生酶促反应，产生强烈的425nm荧光，荧光酶标仪检测其荧光强度值，做出荧光强度值与mirna量的标准曲线。
[0023]本发明进一步提供了上述检测方法在肿瘤的筛查与早期诊断方面的应用。
[0024]优选地，所述肿瘤为肺癌。
[0025]本发明克服现有技术的不足，提供一种多重mirna肿瘤标志物检测方法及其应用，本发明中，依据directpcr技术中的前处理方案，对生物细胞或临床肺癌样本(全血、血浆、血清)进行化学和生物学处理，降解掉蛋白质和dna成分，释放出其中的总rna，而无需进行rna的提取，简化了实验流程，缩短检测时间，而且能节省珍贵的临床肿瘤样本；然后，采用表面改性的96/384孔酶标板取代xmap液相芯片技术中的magplex-tag荧光标记磁珠，这种酶标板表面被有反应活性的基团所修饰，可以化学交联末端存在氨基或巯基的核酸链，使用过的酶标板经过适当处理和清洗后，可以被重复利用；然后，使用末端标记生物素(b1tin)的dna-rna嵌合探针，其设计原则来自xmap液相芯片技术，并全部由国内生物公司合成；rnase one核糖核酸酶被用来检查发生错配或部分互补的情况，通过其降解互补核酸双链中发生错配或部分互补的单链rna，最低可达一个碱基；最后，采用化学发光法测定目标mirna量。通过使用辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素(streptavidin-horseradishperoxidase，sa-hrp)与嵌合探针上的b1tin标记结合，辣根过氧化物酶(hrp)在增强型化学发光底物环境下发生酶促反应，产生强烈的荧光。通过荧光酶标仪测定每孔中产生的不同荧光强度值，可推算出相对应目标mirna量。
[0026]这种检测手段利用了 hrp酶的生物催化特性来快速放大检测信号，无需核酸扩增。根据本发明的设计方案，生物细胞及临床样本仅需一次处理，加入不同嵌合探针后；一块