本发明涉及生物
技术领域：
，具体地，公开了一种检测口腔癌的标志物及其试剂盒。
背景技术：
：dna复制起始蛋白作为目前公认的表征细胞增殖状态的标志物，已经被广泛用于宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌等各种癌症。williams最早将dna复制起始蛋白应用在尿液脱落细胞的检测，在92例宫颈癌脱落细胞涂片和57例组织切片中以mcm5、cdc6、pcna和ki67为检测对象，免疫荧光实验结果表明，恶变细胞中可以观察这几种蛋白在不同病理阶段的表达差异，其中mcm5与cdc6比pcna，ki67的敏感性更高。反映了dna复制起始蛋白比传统的细胞增殖标志物更为敏感，因此可以考虑将其用于口腔癌的研究。目前关于dna复制起始蛋白在口腔脱落细胞中的研究尚无报导。技术实现要素：本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种检测口腔癌的标志物。本发明的另一个目的是提供一种检测口腔癌的试剂盒。为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：一种检测口腔癌的标志物，由cdc6、cdt1、mcm2和cdc45四种dna复制起始蛋白组成。cdc6、cdt1、mcm2和cdc45四种dna复制起始蛋白在制备检测口腔癌试剂盒中的应用。一种检测口腔癌的试剂盒，该试剂盒以cdc6、cdt1、mcm2和cdc45四种dna复制起始蛋白作为检测靶标，根据以上四种dna复制起始蛋白的mrna表达量可以判断口腔癌或口腔癌的发展阶段。正常人、口腔炎症、癌前病变、口腔癌和术后阶段所述口腔癌的发展阶段是指细胞发展处于癌前病变、癌症期、癌症术后等。所述检测四种dna复制起始蛋白的mrna表达量时，用于构建标准品的引物序列如seqidno：1～10所示，用于扩增大于200bp的qrt-pcr引物序列如seqidno：11～20所示，用于扩增小于150bp的qrt-pcr引物序列如seqidno：21～30所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明旨在通过对正常人，口腔炎症、癌前病变、口腔癌和术后阶段的cdc6、cdt1、mcm2和cdc45mrna水平进行定量检测，同时结合临床诊断结果，判断这些肿瘤标志物作为口腔癌早期筛选的理想肿瘤标志物的可行性。探讨口腔脱落细胞中肿瘤标志物含量变化的机制，以及在预后判断上的临床价值。附图说明图1.cdc6(a)、cdt1(b)、mcm2(c)和cdc45(d)在正常组、炎症、癌前损伤、口腔癌和术后组的相对表达水平的箱式图，箱式部分代表50％的四分位数(25％以上，75％以下)，粗线代表相对表达的均值，小圆圈代表出离范围值。图2为dna复制起始蛋白mrna相对表达均值比较，a：cdc6；b：cdt1；c：mcm2；d：cdc45。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1一、研究对象：包括76例患病组患者和24例正常健康人作为对照组；患病组：2007～2008年在中山大学医学院附属第一医院口腔科就诊的患者中选取76例患者，其中炎症14例、癌前损伤(白斑)14例、口腔癌20例、术后28例(所有病例均手术扩大切除原发灶。炎症组多为牙周炎和口底蜂窝织炎，癌前损伤组为白斑和口腔良性肿瘤，口腔癌多为舌鳞癌、颊癌、颌骨癌、牙龈癌，患者临床诊断均由病理诊断证实为口腔鳞状细胞癌，全身检查无其他恶性肿瘤。患者年龄在31～75岁之间，平均55岁。按照口腔患病类型分为，舌、牙龈、颊、颌骨、口底。对照组：24例正常健康人作为正常对照组，他们均来自经口腔检查无牙周病、无炎症、无溃疡，全身检查无全身疾病的志愿者。二、cdc6、cdt1、mcm2和cdc45的mrna水平定量检测，具体方法如下：1、rna提取：受试者充分用清水漱口后，将漱口液用50ml离心管收集脱落细胞，4℃、8000g离心5min，弃上清，将管子倒置，使管中残余的水晾干，按细胞的浓度加入trizol，提取rna，详细步骤参考本领域常规提取方法。2、第一链合成：提取的rna逆转录为cdna，贮存于-20℃备用，具体步骤详见常规试剂盒说明书。3、荧光定量分析：由于要扩增的目的基因为真核生物，所以引物设计需要跨内含子设计。扩增的目的基因片段需要在标准品中克隆的基因片段之内，故每个基因各有一对构建标准品的引物和两对用于荧光定量的引物(表1，2，3)。本试验要检测的目的基因共4个，另外还有一个看家基因，不能在同一管中完成5色的检测，因此选用sybrgreeni这种荧光染料。pcr扩增产物长度在80～150bp最为合适(可以延长至300bp)。试验采用的是石蜡切片，有研究发现，石蜡包埋的组织中rna会片段化，还有不同程度的甲基化。为了研究石蜡包埋对rna的影响，故设计了两种pcr引物，一对用于扩增长片段(200～300bp)，一对用于扩增短片段(80～150bp)。sybrgreeni为双链小沟结合染料，没有序列特异性，所以对引物设计的要求较高，在扩增过程中产生的引物二聚体和非特异性扩增都会直接影响定量结果的准确性。故需要对扩增产物进行电泳和溶解曲线分析，确认pcr的特异性。采用sybrgreenipremixextaqkit(takara)检测目的基因(β-actin、cdc6、cdt1、mcm2和cdc45)，严格按照使用说明进行操作。取上述合成的cdna模板2μl，2×sybrgreenipremixextaq10μl，上下游引物各0.4μl，至终浓度为0.2μmol，用ddh2o补足体系为20μl。混匀后将管壁上液体稍离心到管底部。各反应管于美国bio-rad公司荧光定量pcr仪iqtm5进行扩增。95℃预变性10sec，进入循环94℃变性5sec，60℃退火延伸20sec，共45个循环，扩增完毕后，进行熔解曲线分析，从95℃到60℃共35℃，以0.5℃/sec的速率变化温度，连续监测荧光。每次试验中都设不含反转录酶的rt产物和无模板对照。为了得到线性的标准曲线，将质粒标准品梯度稀释后作为模板(1×102～107copies/μl)，在每次pcr扩增时都扩增标准品。表1用于构建标准品的引物序列表2用于扩增大于200bp的qrt-pcr引物表3用于扩增小于150bp的qrt-pcr引物4、统计学分析：自建立的标准曲线得出每个样品的确切拷贝数。为了消除rna的提取、逆转录和pcr反应的差异，以β-actin为内参，那么单细胞目的基因mrna表达水平用targetcopynumber/β-actincopynumber比值作为标准化的表达水平指标。每个样品重复至少两次，cdna模板来源于不同的逆转录反应。用one-wayanovatest和kruskal–wallishtest去分析癌前阶段和癌变阶段以后mrna表达的整体显著差异性。mann–whitneyutest用于分析组内两种病理阶段的显著性差异。一元线性回归用于分析不同基因的mrna表达与病理参数之间的相关性。roc(receiveroperatingcharacteristiccurves)用于医学诊断试验性能的评价。通过改变诊断界点，获得多对真阳性率(tpr)与假阳性率(fpr)值，以fpr为横坐标，tpr为纵坐标，绘制roc曲线，计算与比较roc曲线下面积，以此反映诊断试验的价值。即分析各不同的dna复制起始蛋白作为检测舌林状细胞癌的精确性。在roc曲线下的面积(areasunderthecurves，auc)代表了诊断准确性的高低，一般来说这一指标取值范围在0.5至1之间,完全无价值的诊断auc＝0.5，完全理想的诊断auc＝1。一般认为auc为0.5-0.7时，表示诊断价值较低；为0.7-0.9时，表示诊断准确性为中等；为0.9以上时表示诊断价值较高。p＜0.05认为差异具有显著性。以上的统计分析通过spss13.0软件进行。5、结果：目的基因的表达都是相对于看家基因β-actin的相对标准化的数值。这5个基因的线性相关性非常高达到r2>0.994。各目的基因的相对表达值和不同的病理参数如表4所示。表4临床病理参数及mrna相对表达值(n＝100)上表通过荧光定量pcr分析了在不同的样本中cdc6、cdt1、mcm2、cdc45的相对表达数值，所有数值均为相对于同一样品的β-actin的比值。6、cdc6荧光定量pcr结果分析：荧光定量pcr结果显示cdc6mrna的表达水平在正常与患病组中有整体上的显著性差异(p＝0.000；kruskal–wallistest)。在正常与癌前损伤、鳞状细胞癌和术后的cdc6的表达两两比较发现，正常组除了与癌前损伤和口腔癌之间有显著型差异外(p＝0.000,0.000；mann–whitneytest)，还与术后有显著性差异(p＝0.000)，表明cdc6在术后一段时间仍有较高表达。结果如图1a和表5所示。另外cdc6的平均表达水平在炎症与癌前损伤之间无显著性差异(p＝0.054)，而炎症与口腔癌之间的差异性显著(p＝0.007)。值得注意的是cdc6的表达在癌前损伤和口腔癌的表达示有显著性差异(p＝0.028)，也就是说通过cdc6可以有效地将癌前损伤与口腔癌区分开来。然而在炎症和术后(p＝0.078)，癌前损伤和术后(p＝0.303)，口腔癌和术后组(p＝0.428)的比较发现cdc6mrna的表达并没有显著性差异(p＝0.311)，以上的结果表明cdc6mrna表达水平随着舌鳞癌的发展进程是上调的。7、cdt1荧光定量结果分析：cdt1mrna的表达水平在正常与患病组中的mrna表达水平没有显著性差异的(p＝0.077；kruskal–wallistest)(图1b，表5)。另外,在正常组分别与炎症、癌前损伤、术后进行差异显著性比较，cdt1在这三组之间表达没有显著性差异(p＝0.918,0.442,0.270，mann–whitneytest)。cdt1正常对照与口腔癌组之间比较差异显著(p＝0.001)。另外炎症与口腔癌，术后与口腔癌之间也有显著性差异(p＝0.008，0.007)。其余各组两两比较都没有显著性差异。从以上结果我们发现cdt1作为检测脱落细胞的肿瘤标志物仅能将相对低表达的正常组、炎症组、术后组与相对高表达的口腔癌组区分开，而对于其他组之间则不能有效的区别开来。8、mcm2荧光定量结果分析：比较mcm2在临床病理不同分类的表达情况发现(图1c，表5)，正常对照组与口腔患病组及术后组在整体上有显著性差异(p＝0.000；kruskal–wallistest)。分别将正常组与炎症、癌前损伤、口腔癌和术后组进行差异显著性比较，发现正常组与炎症和术后组之间没有显著性差异(p＝0.108，0.681>0.05；mann–whitneytest)，而在正常组与癌前损伤组及口腔癌组之间有显著性差异(p＝0.002，0.000)mcm2的表达水平随着口腔病变程度的升高而升高。炎症与癌前损伤、口腔癌组、术后之间也有显著性差异(p＝0.007，0.000，0.029)，mcm2可以将炎症与癌前损伤，癌，与术后区别开来，炎症组的表达高于正常组和术后，说明在炎症阶段细胞增殖速度加快，而术后，由于切除了癌变部位，口腔粘膜上皮的增生得到控制，故术后mcm2的表达显著下调到正常水平，使得术后与口腔癌组之间产生显著性差异(p＝0.000)，正常组与术后组之间没有显著性差异。然而当我们将癌前损伤组分别与口腔癌组、术后组比较时，可观察到显著性差异(分别为p＝0.018和p＝0.002)。表明mcm2可以有效地将癌前损伤和口腔癌阶段区别开，并在术后mcm2显著下调。以上数据揭示了mcm2mrna的相对表达水平可作为将癌前病变至口腔癌阶段恶性程度的判断标准，另外对于预后的判别有一定的临床参考价值。9、cdc45荧光定量结果分析：cdc45的表达水平在正常对照组与口腔患病组及术后组在整体上有显著性差异(p＝0.000，kruskal–wallistest)，结果如图1d，表5所示。正常组分别与炎症、癌前损伤和口腔癌组相比都有显著性差异(分别为p＝0.003,0.001和0.000；mann–whitneytest)。这个结果显示用cdc45可以把正常组与口腔炎症，癌前损伤以及口腔鳞癌区别开来。炎症组分别与癌前损伤组和口腔癌组比较结果显示，在这三个阶段，cdc45的表达呈逐渐上调的趋势，但是两两之间不构成显著性差异(p＝0.198，0.085)。术后组与正常组、癌前损伤组与癌变组分析结果显示，cdc45术后mrna的表达与正常的表达无显著性差异(p＝0.34)，而与癌前损伤(p＝0.004)，口腔癌(p＝0.000)有显著性差异。提示cdc45与术后口腔上皮细胞的增殖状态有关。但是cdc45并不能把癌前损伤和口腔癌区别开来(p＝0.304)。表5为dna复制起始蛋白的在各组的差异显著性比较(p<0.05)characteristiccdc6cdt1mcm2cdc45kruskal–wallis0.0000.0770.0000.000normal-inflammation0.1260.9180.1080.003normal-lesion0.0000.4420.0020.001normal-oscc0.0000.0010.0000.000normal-surgery0.0000.2700.6810.340inflammation-lesion0.0070.2900.0070.198inflammation-oscc0.0000.0080.0000.085inflammation-surgery0.0290.2700.0290.117lesion-oscc0.0780.0840.0180.304lesion-surgery0.3030.4350.0020.004oscc-surgery0.4280.0070.0000.000对各组基因相对表达进行均值分析，结果如图2所示：cdc6、cdt1、mcm2、cdc45在正常，炎症、癌前损伤、癌变、阶段表达均呈上升趋势，在术后，除cdc6稍高与癌前损伤，其它3个基因均降低到趋于正常水平。表6描述了目的基因表达与临床病理参数之间的联系。相关性分析表明cdc6(r＝0.305,p＝0.000)有显著性相关性，而cdt1(r＝0.101,p＝0.200),mcm2(r＝0.082，p＝0.307)和cdc45(r＝0.067，p＝0.413)均没有相关性。一元线性回归分析在两两之间表达的相关性，结果显示在cdc6和mcm2之间(r＝0.206,p＝0.035)，cdt1和cdc45(r＝0.596,p＝0.000)之间有显著相关性，结果如图2a，2b所示。但是在其它的两两比较之间没有相关性。表6病理参数与cdc6、cdt1、mcm2和cdc45之间的相关性本研究采用qrt-pcr方法检测了口腔病变患者脱落细胞中dna复制起始蛋白mrna的含量，同时与正常对照进行比较，发现口腔鳞癌患者脱落细胞dna复制起始蛋白含量显著高于正常对照组，在统计学上有极显著性差异。提示该方法可以有效地将正常口腔脱落细胞及癌变脱落细胞有效的区分开来。癌前病变是指口腔粘膜白斑、红斑、扁平苔癣；乳头状瘤和粘膜下纤维性病变等。口腔粘膜白斑是who认定的口腔癌前病变，其癌变率为7％～15％，非均质型白斑可达15％～40％。这些病变并非都会癌变，但临床上许多癌前病变表现无明显症状，要经历长时间，变为恶性癌细胞，因此问题是如何确定这些病损的转归，那么就需定期检查，一经发现恶变可立即采取治疗，这样可增加口腔癌治愈的可能性。许多学者开始致力于口腔白斑癌变标志物的研究，可以有效地将癌前与癌变阶段区别开，这对于口腔癌的早期治愈至关重要。这也是本研究的主要目的。经统计学结果发现，mcm2和cdc6在区分癌前病变阶段的表达均显著低于癌变阶段脱落细胞中相应基因的表达，这对于区别癌前病变和癌变有着积极的作用。我们的先前的发现表明cdc6也是一个敏感的检测异常增生和恶变细胞的标志物。它随着细胞周期的进行在核与细胞质之间穿梭。但是相对于mcm来说，cdc6是一个相对低丰度，不稳定的蛋白，cdc6并不适用于癌症的大量筛查。而cdt1和cdc45虽然在癌前病变阶段的表达低于癌变阶段，但是在统计学上不构成显著性差异，所以不建议作为区别这两个阶段的标志物。另外，如何准确预测口腔鳞癌患者治疗的预后，研究与预后相关的临床指标，有助于临床医师对患者的治疗提供一定的临床参考价值。目前临床上对于口腔鳞癌原发病灶、复发病灶以及转移病灶的诊断主要依靠临床医师的临床经验，同时结合临床辅助检查，最终需要通过病理活检方法实现。而这些检查通常是要等到肿瘤长到一定程度，临床上表现出来时才能够发现对于那些部位隐蔽，或者手术治疗后采用组织瓣修复局部缺损的病变，往往不能够早期发现局部复发。我们的检测结果提示口腔鳞癌，癌前损伤，和术后不同阶段脱落细胞dna复制起始蛋白含量，只有cdc6在术后一段时间仍有较高表达，推测cdc6的高表达不能作为预后的标志基因。其原因尚待进一步的研究。另外，cdt1、mcm2和cdc45在术后均低表达，与癌变阶段有显著性的差异，与正常对照组之间无差异显著性。以上结果说明这三个dna复制起始蛋白检测对于判断口腔鳞癌患者的预后，尤其是对于判断口腔鳞癌患者治疗后肿瘤复发的风险具有一定的辅助参考价值。其确切结论尚有待于将来进一步的跟踪随访。综上所述，通过qrt-pcr技术检测脱落细胞中dna复制起始蛋白mrna变化，可以监测口腔鳞癌的早期病变，并为预后提供有用的信息。另外脱落细胞学技术在口腔癌作为一种简便快速、非侵入性和相对无痛苦的检查方法，容易为患者所接受，适用于口腔病变的人群普查、肿瘤诊断和疗效监测等方面。随着各种新技术的发展以及临床医学与实验医学的紧密结合，必然会有更多的新技术应用于其中，将会有力地促进口腔癌的诊断与治疗。当前第1页1 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