本发明涉及糖尿病肾病检测标志物。
背景技术：
糖尿病肾病是糖尿病常见的并发症，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，临床特征为蛋白尿，渐进性肾功能损害，高血压，水肿，晚期出现严重肾功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一，目前常规检测方法难以早期发现糖尿病肾病。
技术实现要素：
本发明提供了糖尿病肾病检测标志物，将其用于检测糖尿病肾病，具有良好的特异性、灵敏度和准确率。
血液由于采样方便且能较好反映机体病理生理过程而成为疾病标志物的最好来源之一。但要寻找到特异性和准确性高，能用于临床检测的蛋白标志物，有一定难度。糖尿病肾病属于多因素相关疾病，很难寻找到单一的蛋白标志物。因此，本发明提供上述差异蛋白用于糖尿病肾病检测，采取该组合标志物的方式能提高检测的特异性和准确性，同时具有一定的客观性，优于单一疾病标志物。本发明上述12种血清差异蛋白组合可作为糖尿病肾病检测标志物，具有一定的客观性、特异性和准确性。需说明的是，本发明糖尿病肾病检测标志物的来源除血清外，糖尿病肾病检测标志物还可以来自尿样。
本发明提供糖尿病肾病检测标志物，所述糖尿病肾病检测标志物由12种蛋白组成：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。
本发明还提供一种分离血清或尿液中糖尿病肾病检测标志物的方法，所述糖尿病肾病检测标志物为权利要求1中所述的12种蛋白，采用蛋白质双向电泳方法分离血清或尿液中的糖尿病肾病检测标志物；双向电泳优化条件为：
1）第一向等电聚焦
24cm上样量120微克
水化50v12小时（20℃）主动水化
s1250v线性0.5小时除盐
s21000v线性2小时除盐
s310000v线性6小时升压
s410000v快速80000vhr聚胶
s5500v快速3小时保持；
在本条件下，每个样品重复3次，第一向等电聚焦结果良好，蛋白点分开良好。
2）第二向垂直电泳
采用恒压来跑胶，开始进样时选择低电压60v，待样品分胶液溴酚蓝浓缩成一条线之后，加大电压至200v，直到溴酚蓝指示剂跑到底部位置，停止跑胶。
本发明还提供一种糖尿病肾病检测试剂盒，所述试剂盒包括健康人的血清，在血清中，糖尿病肾病检测标志物的表达量在正常范围内；所述糖尿病肾病检测标志物由12种蛋白组成：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。
本发明还提供12种蛋白在作为糖尿病肾病检测标志物中的应用；所述12种蛋白为：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。
本发明还提供一种检测糖尿病肾病的蛋白芯片，所述蛋白芯片中的蛋白为：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。
本发明提供的一组血清差异蛋白可用于糖尿病肾病检测，用于糖尿病肾病检测时，较单一疾病标记物，提高了检测的特异性和准确性，同时具有一定的客观性。本发明采用蛋白质双向电泳方法，对电泳条件进行了优化，获得了清晰的蛋白电泳结果；通过对糖尿病肾病患者血清与健康对照血清的电泳结果进行比较分析，获得了二者血清差异蛋白12个，与对照相比，表达上调蛋白10个，表达下调蛋白2个。还可以在本发明的基础上进一步采用酶联免疫技术对这些蛋白进行逐个检测或采用蛋白芯片技术对这些蛋白进行同时检测，确定检测到的血清差异蛋白的浓度变化。与现有的检测方法相比，本发明的检测标志物特异性、灵敏度和准确性高，可作为糖尿病肾病诊断的依据。本发明的待检样本可以使用血清和尿液，采集更加方便；检测时用量为200ug-400ug，远小于应用其他方法的采血量。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为健康对照血清的双向电泳结果；
图2-5为糖尿病肾病患者血清的双向电泳结果；
图6为实验血清和健康对照血清的12种差异蛋白示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
本申请人通过对糖尿病肾病患者和健康人群的血清和尿液进行比较分析，发现：与健康人群的血清和尿液相比，在糖尿病肾病患者血清和尿液中存在12个血清差异蛋白：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原，其中10个表达蛋白上调，2个表达蛋白下调。本申请人将该组差异蛋白用于糖尿病肾病的早期检测中，发现具有良好的特异性、灵敏度和准确性。
实施例1
本发明的糖尿病肾病检测标志物为：
角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。
实施例2
本申请首先采用蛋白质双向电泳方法分离血清或尿液中的12种蛋白（即角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原），然后对双向电泳凝胶差异点进行扣点，做质谱分析，确定蛋白名称以及其大小，并对健康对照组和糖尿病肾病患者血清或尿液中蛋白质的含量进行比较分析。具体操作如下：
一、检测物是血清
1、准备健康对照血清：健康对照血清采集自健康人群，血清中的上述12种蛋白的表达量在规范的正常范围内。
健康对照血清在采集后分装，并且直接冷冻在-80℃的环境中，在使用的时候取出解冻使用。
2、采集糖尿病肾病患者的血清作为实验血清。采血量最低为5ml。
使用时，应用affinity2bluegel和proteina分别去除实验血清和健康对照血清中的白蛋白和igg，将未做处理的血清以及去除白蛋白和igg的血清各400μg与水化液混合。
水化液配方为：
尿素8m4.805g
chaps4%0.4g
dtt65mm0.098g（现加）
两性电解质0.2%（w/v）50ul（40%）（现加）
溴酚蓝0.001ul（1%溴酚蓝）
milliq水定容至10ml。
分装为1ml，-20℃保存。
3、通过蛋白质双向电泳方法，对实验血清和健康对照血清中的蛋白进行分离。本申请人对蛋白质双向电泳时的条件进行了优化：主要是对第一向等电聚焦程序和第二向中的恒压跑胶条件进行了优化，使之能够很好的分离上述12种蛋白，电泳结果清晰。具体电泳方法如下：
a.第一向等电聚焦
1)从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液（i）（不含dtt（二硫苏糖醇，分子式为c4h10o2s2，分子量为154.25），不含bio-lyte（两性电解质））一小管（1ml/管），置室温溶解。
水化上样缓冲液（i）的配方为：
尿素8m4.805g
chaps4%0.4g
dtt65mm0.098g（现加）
两性电解质0.2%（w/v）50ul（40%）（现加）
溴酚蓝0.001ul（1%溴酚蓝）
milliq水定容至10ml；
分装为1ml，-20℃保存。
2)在小管中加入0.01gdtt，bio-lyte4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3)从小管中取出400ul水化上样缓冲液（i），加入200ul样品（即处理后的实验血清蛋白或健康对照血清蛋白），充分混匀。
4)从冰箱中取-20℃冷冻保存的ipg预制胶条（17cmph4-7），室温中放置10分钟。
5)沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。
6)当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制ipg胶条上的保护层。
7)分清胶条的正负极，轻轻地将ipg胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，使得胶条的正极（标有）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
8)在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。
9)对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序：
第一向等电聚焦：
24cm上样量120微克
水化50v12小时（20℃）主动水化
s1250v线性0.5小时除盐
s21000v线性2小时除盐
s310000v线性6小时升压
s410000v快速80000vhr聚胶
s5500v快速3小时保持。
在本条件下，每个样品重复3次，第一向等电聚焦结果良好，蛋白点分开良好。
10)聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向sds-page电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存。
b.第二向sds-page电泳
1)配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用milliq水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。
2)待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的milliq水、乙醇或水饱和正丁醇，用milliq水冲洗。
3)从-20℃冰箱中取出的胶条，先于室温放置10分钟，使其溶解。
4)配制胶条平衡缓冲液i。
胶条平衡缓冲母液：
尿素6m36g
sds2%2g
this-hcl0.375mph8.825ml
甘油20 ml
milliq水定容到100ml；
分装成10管，每管10ml，-20℃冰箱保存。
胶条平衡缓冲液i：
胶条平衡缓冲母液10ml
dtt0.2g
充分混匀，现配现用。
5)在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用milliq水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6)将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液i。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
7)配制胶条平衡缓冲液ii：
胶条平衡缓冲母液10ml
碘乙酰胺0.24g。
充分混匀，现用现配。
8)第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液i。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液ii，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。
9)用滤纸吸去sds-page聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上。
10)将琼脂糖封胶液进行加热溶解。
11)将10×电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。
10×电泳缓冲液：
tris碱30g
甘氨酸144g
sds10g
milliq水1l；
混匀后，室温保存，用时稀释。
12)第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液ii。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。
13)将ipg胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。
14)将放有胶条的sds-page凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。
15)用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。
16)放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。
17)在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。
18)在电泳槽加入1×电泳缓冲液后，接通电源，采用恒压来跑胶，开始进样时为低电压60v，待样品分胶液溴酚蓝浓缩成一条线之后，加大电压200v，直到溴酚蓝指示剂跑到底部位置，停止跑胶。整个跑胶时间大概是6个小时。待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。
19)电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。
20)进行染色：采用的是碧云天银染试剂盒。按照试剂盒的方法进行染色，操作时尽量避免手接触到胶面，以免蛋白的污染。
4、质谱分析：
对双向电泳凝胶差异点进行扣点，做质谱分析，确定蛋白名称以及其大小，并对健康对照组和实验血清中蛋白质的含量进行比较。
5、对电泳和质谱结果进行分析：
由电泳结果和质谱分析结果发现，实验血清和健康对照血清中存在12个差异蛋白：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4和cd5抗原。上述12种差异蛋白的表达量发生了变化：相对于健康对照血清来说，实验血清中：角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1和cd5抗原这10种差异蛋白表达量上调，且结合珠蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4表达量下调。具体见表1和图1-6。
图1为健康对照血清的双向电泳结果；
图2-5为糖尿病肾病患者血清的双向电泳结果；
图6为实验血清和健康对照血清的12种差异蛋白示意图；其中，12表示：血小板因子4前体；16表示：性激素结合球蛋白前体；19表示：cd5抗原；22表示：角蛋白6l；26表示：c反应蛋白；37表示：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4；49表示：免疫球蛋白重链viiiregionhil；54表示：补体成分c4；73表示：载脂蛋白e；86表示：结合珠蛋白；99表示：c反应蛋白前体剪接异构体1；102表示：角蛋白19。
表1糖尿病肾病患者与健康对照的血清差异蛋白
二、检测物是尿液
1、准备健康对照尿液：健康对照尿液采集自健康人群，尿液中的上述12种蛋白的表达量在规范的正常范围内。
2、采集实验尿液；
尿液标本采集需在2小时内用完，如果不能则冷藏在4℃冰箱保存，一共只能保存6小时；
尿蛋白的沉淀：分别取5ml的尿液，20%tca/丙酮沉淀法沉淀尿液蛋白，真空干燥后悬于200微升ief缓冲液（上海玉博生物科技有限公司，产品编号：amrescom243）中。
3、将上述处理过的尿液样本以ph值为4-7的线性ipg干胶条进行蛋白质双向电泳实验，对双向电泳凝胶差异点进行扣点，做质谱分析，对电泳和质谱结果进行分析。具体操作步骤与血清的操作步骤相同。
现有的糖尿病肾病仅是检测一个或者几个蛋白指标缺乏特异性，所以诊断不明确，尤其是早期糖尿病的误诊率比较高。本发明用于检测糖尿病肾病的蛋白标志物有12种，特异性比原来检测单一标志物增高，可达到89.8%；灵敏度也可达90%以上。
应用本发明的检测方法对165位糖尿病肾病患者进行检测，当角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1和cd5抗原这10种差异蛋白表达量上调，且结合珠蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4表达量下调时，判断患有糖尿病肾病，结果检出147位，临床符合率（准确率）达到89%以上。
将应用本发明的方法检测到的患有糖尿病肾病的待检血清用下述方法中的一种进行进一步的检测，可以进一步提高检测的特异性、灵敏度和准确性：
（1）用酶联免疫试剂盒(上海药巢生物工程有限公司)酶联免疫技术对12个血清差异蛋白进行逐个检测，能进一步确定检测到的血清差异蛋白的浓度变化大小。
（2）将12种差异蛋白按照本领域的已知方法制备成蛋白芯片，采用蛋白芯片技术对12个血清差异蛋白进行同时检测，确定检测到的血清差异蛋白的浓度变化。
实施例3
本发明的糖尿病肾病检测试剂盒：
1、采集2-3个健康人群的血清，血清中的上述12种蛋白的表达量在规范的正常范围内。采集后冷冻在-80℃的环境中。作为标准阴性血清；
2、准备电泳时所用的溶液（若有改进的地方，此处写明即可，与实施例2中对应）；
3、准备标准板：将图1和图6打印，作为标准板。检测后，根据标准板或标准阴性血清的电泳结果进行判断即可。
本发明的检测试剂盒的检测方法按照实施例2进行（省略对差异点进行质谱分析的步骤）。
检测结果判断依据：当角蛋白19，结合珠蛋白，载脂蛋白e，c反应蛋白，血小板因子4前体，性激素结合球蛋白前体，免疫球蛋白重链viiiregionhil，补体成分c4，角蛋白6l，c反应蛋白前体剪接异构体1和cd5抗原这10种差异蛋白表达量上调，且结合珠蛋白和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶wnk4表达量下调时，判断患有糖尿病肾病。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。