一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的lamp方法
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白质组学和分子生物学技术领域，具体涉及肿瘤标志物黏蛋白(mucin i)的 lamp 方法。
【背景技术】
[0002]2014年2月5号，世界卫生组织(who)发布世界癌症报告，报告显示全球癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势，发展中国家首当其冲，占全球新增病例的6成，年度死亡病例的7成。因此，肿瘤的早期诊断和预防对全世界人民身体保健以及医疗诊断起到举足轻重的作用。而肿瘤标志物是组织中可检测到的与肿瘤的发生、发展有关的物质，因此检测血液中肿瘤标志物的含量，在肿瘤的诊断、分类、预后和复发判断及指导临床治疗中起重要作用。
[0003]mucinl黏蛋白是一种糖蛋白，同时也被证实是一种肿瘤标志物，存在于大量恶性肿瘤中。它在人类表皮细胞肿瘤中是过度表达的，例如直结肠癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌，膀胱癌。而在正常组织中，它的表达量非常低。因此，灵敏的检测细胞表面的肿瘤标志物muc-1的表达量对早期癌症的检测是非常重要的。核酸适配体是从dna或rna文库中筛选出来的能够高特异性和高亲和性与目标蛋白特异性结合的单链寡核苷酸，同时与抗体相比，适配体与靶标分子结合的特异性和亲和力更强，同时具有合成简单快速，易于化学修饰和功能化，而且稳定性好等优点，已经广泛应用于疾病基础研宄及诊断治疗。目前，有一些报道利用mucin i aptamer检测mucinl黏蛋白及肿瘤细胞，例如利用焚光的mucin iaptamer打开方式检测细胞表面mucin 1，利用aptamer-au-ag纳米结构的表面增强拉曼效应检测人类乳腺癌，以及利用mucin i aptame结合阿奇霉素(dox)去治疗卵巢癌。这些技术显示了 mucin i适配体能特异性结合mucin i糖蛋白，然而，目前这些技术太复杂而且灵敏度低，如能量共振转移(fret)，表面增强拉曼(sers)及荧光技术。
[0004]综上所述，建立一种快速简便，廉价，灵敏度高的muc-1检测方法是非常重要的。
[0005]环介导等温基因扩增技术(loop-mediatedisothermal amplificat1n，以下简称lamp法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，lamp的优点包括(i)特异性强(2)等温且灵敏度高。lamp在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，同时与pcr相比，其检测下限很低，仅为几个拷贝。(3 )时间短，仅在ih内可把靶序列扩增至19倍。(4)产物易检测。(5)操作简便，因为反应不需昂贵的pcr仪和特殊试剂。同时，目前尚未有将lamp恒温实时荧光技术应用于快速检测肿瘤标志物muc-1的报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出一种高灵敏度特异性检测肿瘤标志物黏蛋白mucin i的lamp方法。
[0007]本发明提出的高灵敏度检测肿瘤标志物黏蛋白mucin i的lamp方法，包括lamp引物设计，检测肿瘤标志物黏蛋白mucin i的试剂盒设计，以及检测流程设计。
[0008]本发明首先设计lamp引物，以muc-1 aptamer作为lamp引物组中的f3引物，同时利用primer designer软件设计七组引物(b3，bip，fip)，分为外引物匕和f 3，内引物fip和内引物bip，其引物序列分别如下所示:
f3:5-cy5-gcagttgatcctttggataccctgg-3 (seq.1d.nol)
第i组
b3: agaaggtgaagttgaaggaagc (seq.1d.n02)
fip: ccgaggaggtcacaatagcgtctggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n03)
bip: ggcaccccaaaaccctcgtccggtttctttgtcccaaatgtg (seq.1d.n04)
第2组
b3:gggcatagaaggtgaagttga (seq.1d.n05)
fip: aggaggtcacaatagcgtctcctggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n06)
bip: gcaccccaaaaccctcgtctacgctaccggtttctttgtc (seq.1d.n07)
第3组
b3: agaaggtgaagttgaaggaagc (seq.1d.n08)
fip: gaggaggtcacaatagcgtctccggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n09)
bip: ggcaccccaaaaccctcgtccggtttctttgtcccaaatgtg (seq.1d.nolo)
第4组
b3:gaaggtgaagttgaaggaagc (seq.1d.noli)
fip: gaggaggtcacaatagcgtctccggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n012)
bip: gcaccccaaaaccctcgtctaccggtttctttgtccca (seq.1d.n013)
第5组
b3:gaaggtgaagttgaaggaagc (seq.1d.n014)
fip: gaggaggtcacaatagcgtctccggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n015)
bip: accccaaaaccctcgtctcttgaccggtttctttgtccca (seq.1d.n016)
第6组
b3: gaaggtgaagttgaaggaagc (seq.1d.n017)
fip: gaggaggtcacaatagcgtctccggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n018)
bip: gcaccccaaaaccctcgtctctaccggtttctttgtccca (seq.1d.n019)
第7组
b3:aggtgaagttgaaggaagcg (seq.1d.n020)
fip: aggaggtcacaatagcgtctcctggaacaagttcgtgccga (seq.1d.n021)
bip: ggcaccccaaaaccctcgtccggtttctttgtcccaaatgtg (seq.1d.n022)。
[0009]对上述lamp引物组进行筛选，得到最优的引物组为第五组，即seq.1d.nol (f3)、seq.1d.n014 (b3)、seq.1d.n015 (fip), seq.1d.n016 (bip)0
[0010]本发明设计了检测肿瘤标志物黏蛋白mucin i的试剂盒，该检测试剂盒包含:
(1)引物液:含有引物组，分别为浓度为48?52μm外引物f3，浓度为48?52 μμ外引物b3，浓度为48?52 μμ内引物fip，浓度为48?52 μμ内引物bip;
(2)反应液:含有12 mm dntp, 1xisothermal amplificat1n 反应缓冲液，150 mmmgscvk溶液，三者的体积比是7?9:4?6:2 ;
(3)dna聚合酶:浓度为7?9u/ μ i ;
(4)对照:阴性对照为不含f3的反应混合液。
[0011]其中，优选:引物液中含有浓度为50 μμ的外引物f3、浓度为50 μμ的外引物β3，浓度为50 μ m内引物fip、浓度为50 μ m内引物bip，dna聚合酶为bst dna聚合酶，浓度为8u/ μ i ;反应液中，12mm dntp: 10x isothermal amplificat1n 反应缓冲液:150mm mgso4的体积比为8:5:2。
[0012]本发明提出的lamp方法检测糖蛋白mucin i的原理为:利用mucin i aptamer具有合成简单，高亲和性和特异性结合mucin i糖蛋白的性质，将mucin i aptamerr作为lamp反应中的f3引物，进行lamp反应。
[0013]本发明提供的检测肿瘤标志物黏蛋白的lamp方法的操作流程如下:
(1)首先，利用磁珠的磁性分离和富集作用，将连接有链霉亲和素的磁珠与不同浓度的生物素化mucin i蛋白结合(即利用了生物素和链霉亲和素的特异性结合作用)，孵育(条件可为37，2h)，从而达到富集mucin i蛋白的目的；再通过磁性分离，去除未结合的生物素化mucin i糖蛋白；
(2)其次，加入50μ l封闭液(如为ρη=7.4的tris-醋酸缓冲液含0.1%胎牛血清蛋白)封闭上述磁珠(条件可为37°c，2h);
(3)然后，将适配体mucini aptamer与磁珠连接的生物素化muc-1蛋白进行孵育(可为37°c，2 h)，孵育后，再用封闭