专利名称：一种检测胃炎相关标志物的芯片及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种用于检测胃炎相关的标志物的蛋白质芯片及相应的检测试剂盒。
背景技术：
慢性胃炎是常见病和多发病，一般有两个类型炎症病变比较表浅，局限在胃粘膜表面一层(不超过三分之一)者，称作慢性浅表性胃炎；而炎症病变波及胃粘膜的全层，并伴有胃腺体萎缩者，则为慢性萎缩性胃炎。胃镜普查证实，我国人群中慢性胃炎的发病率高达60％以上，萎缩性胃炎约占其中的20％。萎缩性胃炎常由慢性浅表性胃炎发展而来，是一种慢性进行性病变。萎缩性胃炎如果不经诊断和治疗，会引起痴呆、神经性疾病、心脏疾病等，增加胃癌和胃溃疡的发病几率。国内资料报道，萎缩性胃炎的胃癌发生率为2％-7％左右。
早期对萎缩性胃炎确诊的手段是胃镜检查及病理确诊。通过胃镜及病理检查，可以明确萎缩性胃炎的程度和是否处于胃癌前病变。目前也有通过传统elisa方法分析胃泌素17(gastrin-17)、胃蛋白酶原i(pepsinogen i)和胃蛋白酶原ii(pepsinogen ii)这三种血清标志物诊断萎缩性胃炎的方法，检测结果有助于诊断病人是否是胃炎、萎缩性胃炎以及胃炎发生的部位(胃窦、胃体)。这种血清学的检测是一种可替代胃镜检查及病理诊断的用于对胃痛和消化不良的病人进行初始诊断的非侵入性的方法。然而由于目前对这三个因子的检测是由3个elisa试剂盒完成的，而且三种elisa试剂盒对样品收集和处理的要求(是否禁食或因血清中gastrin-17含量太低而给以高蛋白剂刺激)、测试样品的预处理(56℃水浴或否)、样品稀释程度(从稀释2倍到200倍)、elisa反应时间(从2个小时到4.5小时)等等均不相同，并且在检测时背景干扰十分严重，给临床诊断带来不便。
综上，目前国内外尚无快速、灵敏的能解决上述问题以及能同时检测多个与胃病相关的标志物的检测用品。因此，本领域迫切需要开发快速、灵敏的能同时检测多个与胃病相关的标志物的产品，以便于临床应用。
发明内容
本产品的目的就是提供一种可快速灵敏地同时检测多个胃炎标志物的液相蛋白质芯片。
本发明的另一目的就是提供含有所述液相蛋白质芯片的试剂盒。
在本发明的第一方面，提供一种蛋白质芯片，所述的蛋白质芯片包括2种以上(如2-100种)不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗体，其中，所述的第一抗体为抗胃炎标志物的第一抗体，并且所述的第一抗体选自下组抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、或抗胃泌素-17抗体。
在本发明的另一优选例中，所述芯片中，抗胃蛋白酶原i抗体∶抗胃蛋白酶原ii抗体∶抗胃泌素-17抗体的摩尔比为(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，当存在所述抗体时。
在本发明的另一优选例中，所述的不同的微球是具有不同微球识别信号的微球。
在本发明的另一优选例中，所述的微球识别信号为荧光信号。
在本发明的另一优选例中，所述芯片中，每一种微球的数量为103-107个；较佳的为103-106个，更佳的103-105个。
在本发明的另一优选例中，所述的微球的平均直径为1-100微米。
在本发明的另一优选例中，所述芯片含有三种不同的微球，并且在三种微球上分别固定有抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、和抗胃泌素-17抗体，其中，每种微球的数量为103-107个，并且各第一抗体的数量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原i抗体，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原ii抗体，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗体。
在本发明的另一优选例中，所述的第一抗体还包括抗cea抗体、抗ca19-9抗体、抗ca242抗体、抗ca724抗体、或抗ca50抗体。
在本发明的第二方面，提供一种多胃炎标志物并行检测的方法，所述方法包括以下步骤(a)将待测样品与权利要求1所述的蛋白质芯片混合，从而使待测样品中的胃炎标志物与第一抗体及微球形成“胃炎标志物-第一抗体-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的三元复合物与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有不同种的带有可检测信号的第二抗体，每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于蛋白质芯片中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该胃炎标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2，从而形成“第二抗体-胃炎标志物-第一抗体-微球”四元复合物；(c)检测四元复合物中不同微球的微球识别信号，从而确定待检测样品中各胃炎标志物的存在与否以及存在的量；附加条件是待测样品与蛋白质芯片和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行。
在本发明的另一优选例中，所述的可检测信号为藻红蛋白。
在本发明的另一优选例中，还包括步骤(d)将测定的可检测信号与对照或标准曲线进行比较，从而确定待检测样品中各胃炎标志物的存在与否，和/或数量。
在本发明的第三方面，提供一种用于检测多胃炎标志物的试剂盒，它包括以下组分(1)第一容器，以及装于该容器中的第一抗体溶液，所述的第一抗体溶液中含有权利要求1所述的蛋白质芯片。
在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(2)第二容器，以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有不同种的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该胃炎标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包括(3)标准品、或对照品。
在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中包括(1’)容器a，以及装于所述容器中的权利要求1所述的液相蛋白质芯片；(2’)容器b，以及装于所述容器中的带有可检测信号的不同种第二抗体，每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于液相蛋白质芯片中相应的第一抗体；(3’)容器c，以及装于容器内的杂交液(如10.1mm na2hpo4，138mm nacl，1.76mm kh2po4，2.7mm kcl，0.05％(v/v)tween-20，ph7.4)；(4’)容器d，以及装于容器内的杂交后洗液(如10.1mm na2hpo4，138mmnacl，1.76mm kh2po4，2.7mm kcl，0.02％(m/v)timerosal，1％(m/v)bsa，ph7.4)；(5’)容器e，以及装于容器内的对应于可检测信号的检测物质(如荧光染料)；(6’)阴性对照和阳性对照。
在本发明的第四方面，提供所述的蛋白质芯片的用途，用于制备诊断或辅助诊断胃炎的试剂盒；或用于制备体外检测样品中是否存在胃炎标志物的试剂盒。
在本发明的另一优选例中，所述的检测是定量检测。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了固定有第一抗体的微球的示意图，其中，25为第一微球，45为与微球25连接并固定的第一种第一抗体分子，27为第二微球，47为与微球27连接并固定的第二种第一抗体分子，第一微球25与第二微球27自身具有可区别的不同荧光信号。
图2显示了采用本发明的蛋白质芯片进行检测的示意图。其中，1代表带有第一抗体的微球，2代表胃炎标志物，3代表第二抗体，4代表可检测信号。
图3是g-17的标准曲线。
具体实施例方式
本发明人经过广泛的研究，将针对多种抗胃炎标志物的第一抗体分别固定在不同微球(beads)上，制得蛋白质芯片，并且本发明人根据各种胃炎标志物在血清中的浓度不同来设计抗胃炎标志物抗体在蛋白质芯片中的量，从而大大提高了胃炎相关标志物的检出量和准确率，最大限度降低了背景信号的产生。基于此完成了本发明。
如本文所用，术语“胃炎标志物”是指在胃炎的发生和进展过程中，由机体产生的，存在于体液(如血清)中，反映胃炎存在和进展的一类物质。代表性的胃炎标志物包括(但并不限于)胃泌素17(g-17)、胃蛋白酶原i(pg i)、胃蛋白酶原ii(pg ii)。
如本文所用，“捕获抗体”、“包被抗体”、“第一抗体”、与“一抗”可互换使用，都是指用于固定于微球上的、特异性抗一种相应的胃炎标志物的抗体，如抗胃泌素17抗体、抗胃蛋白酶i抗体、和抗胃蛋白酶原ii抗体。
如本文所用，“检测抗体”、“第二抗体”、与“二抗”可互换使用，都是指特异性抗一种相应的胃炎标志物且对应于液相蛋白质芯片中相应的第一抗体的抗体。对于同一种胃炎标志物而言，相应的第一抗体和第二抗体是不同的，并且可同时结合于所述的胃炎标志物的不同表位。
如本文所用，所述的“微球识别信号”是指位于微球上的，用于区别不同的第一抗体的识别信号。为了方便起见，对于固定有同一种第一抗体的微球，微球识别信号优选是相同的。优选的，所述的微球识别信号是荧光信号，并且，对于固定有不同种第一抗体的微球，荧光的色彩是不同的，对于固定有同种第一抗体的微球，荧光的色彩优选是相同的。
如本文所用，所述的“可检测信号”是指与第二抗体上生物素结合用于显示第二抗体与相应的胃炎标志物发生结合的信号。在本发明的优选方式中，所述的可检测信号为链亲和素-藻红蛋白，其与抗体上标记的生物素结合，通过激光激发产生荧光信号。
基本原理本发明的基本原理是双抗夹心法。常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与带标记的二抗反应，洗涤，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。
对上述双抗夹心法进行改进的是将所述的一抗固定于携带特定可检测信号的微球上，制备液相蛋白质芯片，通过采用液相蛋白质芯片进行检测的原理是使单个微球通过检测通道，并使用两种激光同时对微球上的微球识别信号和可检测信号进行检测。一种激光激发的是微球上的微球识别信号，根据微球上的不同种识别信号，可以将微球分类，从而将各个不同的结合反应区分开来。另一种激光激发的是可检测信号，目的是确定微球上结合的可检测信号的数量，从而确定微球上结合的目的分子的数量。因此，通过两种激光的同时检测，可以确定被结合的检测物的种类和数量。
蛋白质芯片所述的蛋白质芯片包括2种以上(如2-50种)不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗体，其中，所述的第一抗体为抗胃炎标志物的第一抗体，并且所述的第一抗体选自下组抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、或抗胃泌素-17抗体。
本发明中，将第一抗体固定在微球上的详细操作程序可用常规方法，例如按照luminex公司的产品说明书或网站www.luminexcorp.com中所述的方法进行偶连，从而得到不同微球与相应一抗形成的偶连物。
所述的不同的微球是具有不同微球识别信号的微球，由于带有不同的微球识别信号，使不同微球之间可被区分。在本发明的优选方式中，所述的微球识别信号为荧光信号，并且，微球上的荧光信号因固定于微球上的相应的第一抗体的不同而不同。
本发明的蛋白质芯片中，所述的微球为采用聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯等材料制成的。并且，所述的微球的平均直径为1-100μm；更优选的，所述的微球的平均直径为2-80μm，最优选的，所述的微球的平均直径为2-50μm。
本发明的蛋白质芯片中，对采用的微球的数量没有特别的限制，在本发明的一种优选方式中，在一个反应体系中(如约100μl体系)，每一种固定有不同的第一抗体的微球的数量为103-107个；更优选的为103-106个，最优选的为104-105个。
为了更好地检测所述的胃炎标志物，本发明人根据胃炎标志物(如蛋白酶原i、胃蛋白酶原ii、胃泌素-17)在样品(如血清)中含量的不同，对采用的不同抗胃炎标志物的第一抗体的量进行独特设计，以保证能够从样品中精确地检出胃炎标志物，提高检出率。
在本发明的优选方式中，所述芯片中，抗胃蛋白酶原i抗体∶抗胃蛋白酶原ii抗体∶抗胃泌素-17抗体的摩尔比为(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，当存在所述抗体时。也即当所述的抗胃炎标志物的第一抗体为抗胃蛋白酶原i抗体、和抗胃蛋白酶原ii抗体时，它们在蛋白质芯片中的摩尔比例为(4-10)∶(4-12)。比如，在进行检测时，在96孔板的每个孔中(约100μl体系)，它们的含量分别为0.04-0.1μg/0.5-2.5×104个微球、和0.04-0.12μg/0.5-2.5×104个微球。
当所述的抗胃炎标志物的第一抗体为抗胃蛋白酶原i抗体、和抗胃泌素-17抗体时，它们在液相蛋白质芯片中的摩尔比例为(4-10)∶(6-15)。比如，在进行检测时，在96孔板的每个孔中，它们的含量分别为0.04-0.1μg/0.5-2.5×104个微球、和0.06-0.15μg/0.5-2.5×104个微球。
当所述的抗胃炎标志物的第一抗体为抗胃蛋白酶原ii抗体、和抗胃泌素-17抗体时，它们在液相蛋白质芯片中的摩尔比例为(4-12)∶(6-15)。比如，在进行检测时，在96孔板的每个孔中，它们的含量分别为0.04-0.12μg/1-2.5×104个微球、和0.06-0.15μg/0.5-2.5×104个微球。
当所述的抗胃炎标志物的第一抗体为抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、和抗胃泌素-17抗体时，它们在液相蛋白质芯片中的含量比例为(4-10)∶(4-12)∶(6-15)。比如，在进行检测时，在96孔板的每个孔中，它们的含量分另别为0.04-0.1μg/100μl、0.04-0.12μg/100μl、和0.06-0.15μg/100μl。
当然，本发明的蛋白质芯片中，所述的微球上还可固定各种抗胃病标志物的抗体，包括但不限于抗cea抗体、抗ca19-9抗体、抗ca242抗体、抗ca724抗体、抗ca50抗体(所述抗体均可购自sigma、biodesign、medix、或abcam)。
本发明的蛋白质芯片中，微球-第一抗体的结构可参见图1。其中25为第一微球，45为与微球25连接并固定的第一种第一抗体分子，27为第二微球，47为与微球27连接并固定的第二种第一抗体分子，第一微球25与第二微球27自身具有可区别的不同荧光信号。
在另一优选例中，本发明的芯片所用的微球是一种直径5.5微米，以不同荧光标记的微球。在每种微球(固相载体)均偶联了具有不同结合特异性的抗体分子。
在本发明的一种优选方式中，提供了一种蛋白质芯片，所述芯片含有三种不同的微球，并且在三种微球上分别固定有抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、和抗胃泌素-17抗体，其中，每种微球的数量为103-107个，并且各第一抗体的数量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原i抗体，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原ii抗体，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗体。
二抗以及二抗的标记本发明中，每一种第二抗体分别抗一种相应的胃炎标志物，且对应于相应的第一抗体。在本发明的优选方式中，由于每一种胃炎标志物抗原含有多个表位，因此其第二抗体不是唯一的，但第二抗体结合的抗原表位与相应的第一抗体结合的抗原表位是不同的。
在本发明的优选方式中，在利用第二抗体进行检测时，针对于96孔板的每一个孔(约100μl体系)，第二抗体(检测抗体)的含量如下抗pgi抗体750-1500ng；抗pgii抗体750-1500ng；抗g-17抗体750-1500ng。
本发明中，可选用多种可检测信号来标记所述的第二抗体。比如，所述的可检测信号选自fitc、cy3、cy5、藻蓝蛋白、alexa fluor dyes、bodipy dyes、俄勒冈绿染料(oregon green dyes)、得克萨斯红染料(texas red dye)，或若丹明(rhodamine)。
在本发明的一种优选方式中，二抗的生物素标记方法如下分别取针对不同胃炎标志物抗原的二抗纯化后加入生物素二甲基亚砜(dmso)溶液，避光反应，去除未反应的生物素，保存备用。
对应于可检测信号的检测物质为能够与可检测信号相结合并能够报告所述结合的分子(报告分子)。当采用生物素来标记第二抗体时，可采用链亲和素-藻红蛋白作为报告分子。
样品本发明中，可用所述的蛋白质芯片进行检测的样品包括任何提取自哺乳动物体内的体液样品或血液样品。在本发明的优选方式中，所述的样品为血液样品；更优选的，所述的样品为血清样品。
在本发明的优选方式中，样品为无菌静脉穿刺取得的血液经新鲜沉降和冷藏获得的血清，与临床常规采血操作一致。样品经过一次1∶5倍稀释，不需要特殊处理就可以在使用本发明人经过微球包被条件的优化，分析过程的优化以及检测抗体的优化的芯片检测时，保证3个因子在一张芯片内使用同样的分析条件完成同时检测和定量分析。
对照或标准为了消除假阳性和假阴性，宜在检测过程中设置对照。此外，为了获得定量结果，可以在检测过程中设置含已知浓度的多个胃炎标志物的标准品。对照或标准品的设置方法采用常规的方法。
在本发明的优选方式中，标准品的设置如下标准品i(g-17/pg i/pg ii8.5pmol/l，100ug/l，12ug/l)标准品ii(g-17/pg i/pg ii6.375pmol/l，75ug/l，9ug/l)标准品iii(g-17/pg i/pg ii4.25pmol/l，50ug/l，6ug/l)
标准品iv(g-17/pg i/pg ii2.125pmol/l，25ug/l，3ug/l)标准品v(g-17/pg i/pg ii0.708pmol/l，8.33ug/l，1ug/l)标准品vi(g-17/pg i/pg ii0pmol/l，0ug/l，0ug/l)结果中对应标准品检测出的荧光值为y轴，对应标准品的浓度为x轴，由仪器软件求得标准曲线。系统根据样品检测的荧光值由标准曲线计算出样品中检测标志物的浓度。
多胃炎标志物并行检测的方法本发明方法中，充分利用了一抗固定在不同流动微球的特点，将固定了一抗的微球溶液与样品、标准品或对照品，可检测信号标记的二抗溶液依次或同时一并加入反应容器中，从而发生以下反应①微球上的一抗与样品、标准品、或对照品中相应的抗原(即胃炎标志物抗原)结合，形成“胃炎标志物-第一抗体-微球”三元复合物，②二抗与样品、标准品、或对照品中相应的抗原(即胃炎标志物抗原)结合，最终形成“第二抗体-胃炎标志物-第一抗体-微球”四元复合物(包括微球交联的一抗-胃炎标志物抗原-可检测信号标记的二抗复合物或微球交联的一抗-标准品或对照品的抗原-可检测信号标记的二抗复合物)，反应过程中不须多余的步骤，在液相中即可通过液相芯片检测仪检测复合物的荧光，达到从反应到定性定量分析一步完成的效果，即一步法。
在液相芯片检测仪上，这些微球被微量液体传送系统排成单列，通过两束激光，一束判定微球的微球识别信号从而决定被测胃炎标志物的种类；另一束测定微球上结合的可检测信号，经数据处理得出被测胃炎标志物的含量。
本发明的蛋白质芯片的检测示意图见图2。其中，1代表带有第一抗体的微球，2代表胃炎标志物，3代表带有可与荧光检测信号相结合标记的第二抗体，4代表可与带有标记的第二抗体相结合的荧光检测物质。
待测样品与第一抗体溶液和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行。
在本发明的优选方式中，所述的多胃炎标志物并行检测的方法包括如下步骤
1.取待检人员外周血，分离血清；2.使用集成了不同结合特异性的液相蛋白质芯片对待检血清进行鉴定，具体如下(a)将制备好的液相蛋白质芯片加入96孔抽滤板中，将待检血清加入液相微球蛋白质芯片中，并加入适量的缓冲液，室温孵育30-60分钟；(b)抽滤弃上清，加入杂交后洗液洗去未结合的检测物；(c)向液相芯片中加入带标记的特异性抗不同胃炎标志物的第二抗体混合物，室温孵育15-30分钟；(d)向液相芯片中加入相应荧光染料，反应后以液相芯片检测仪进行检测。
3.试剂盒本发明的检测胃炎标志物的液相蛋白质芯片检测试剂盒的主要技术特征在于将液相蛋白质芯片技术与免疫学方法相结合，对与胃炎相关的多种标志物(如胃泌素17、胃蛋白酶i和胃蛋白酶原ii)进行联合标志物的定量分析。
本发明的用于检测多胃炎物的试剂盒包括以下组分第一容器，以及装于该容器中的权利要求1所述的液相蛋白质芯片。
在本发明的优选方式中，所述的试剂盒还包括第二容器，以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有不同种的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该胃炎标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
在本发明的另一优选例中，所述的试剂盒中还包括标准品、或对照品。
在本发明的一种优选方式中，所述的试剂盒包括一个容器a，以及装于所述容器中的上述的用于检测胃炎相关血清标志物的液相蛋白质芯片；更优选的，所述的试剂盒还至少包括一管杂交液，该杂交液用于液相蛋白质芯片与分析物的杂交；更优选的，所述的试剂盒还至少包括一管杂交后洗液，该杂交后洗液用于液相蛋白质芯片与分析物杂交后的洗涤；更优选的，所述的试剂盒还至少包括一管能与特定标记的抗体结合的荧光染料；更优选的，所述的试剂盒还至少包括一管阳性对照，该阳性对照用于在检测3个目的分析物时，对检测过程进行控制；更优选的，所述的试剂盒还至少包括一管阴性对照，该阴性对照用于在检测3个目的分析物时，对检测过程进行控制。
本发明的主要优点在于第一，可以同时对某一个体样品中与胃炎相关的多个血清标志物进行定量分析；并且，也可以同时对多个样品中与胃炎相关的多个血清标志物进行定量分析。
第二，由于对微球带有的第一抗体的量进行配比设计，从而使得不容易检出的胃炎标志物(如g-17)也可灵敏地被检测。并且，最大限度降低了不同分析物在杂交时存在的非特异性的结合，从而大大降低了背景信号的产生。同时也节省了大量时间与资金。
第三，本发明不仅对病人是否是胃炎、萎缩性胃炎以及胃炎发生的部位(胃窦、胃体)进行诊断，而且为更好防治萎缩性胃炎，以及降低胃癌和胃溃疡的发病几率创造了条件。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆实验室指南(new yorkcold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
抗体来源以下实施例中用到的抗体来源见表1。
表1
试剂配制以下实施例中用到的试剂见表2。
表2
实施例1芯片制备的方法(微球包被方法)(1)取约1.25×106个微球(购自bio-rad公司，如171-506027，直径5.5微米)，震荡、超声30秒→14000×g离心4min，弃上清，100μl的微球洗涤液重悬→1400rpm震荡、超声30s→14000×g离心4min，80μl的活化液重悬→加入各10μl的50mg/ml的edc和s-nhs，避光室温1400rpm震荡20min→加入150μl pbs缓冲液，1800rpm震荡15s，14000×g离心4min→加入250μlpbs缓冲液，1800rpm震荡15s，14000×g离心4min→100μl pbs缓冲液重悬→加入4μg对应的捕获抗体(抗pgi第一抗体)分别用pbs缓冲液将之补足至500μl；避光、4℃、1400rpm震荡过夜→14000×g离心4min，500μl的pbs缓冲液洗涤微球→14000×g离心4min，250μl封闭液；避光室温1400rpm封闭30min→14000×g离心4min，500μl的储存液洗涤微球→16000×g离心6min，用125μl的储存液重悬微球；避光并4℃保存。
同上述步骤，分别制备含抗pgii第一抗体、抗g-17第一抗体的微球，但是两种抗体的加入量分别是4.5ug和9ug。
(2)微球包被抗体效率检测在每管50μl的生物素标记羊抗鼠igg(浓度为2ug/ml)中加入1μl震荡过的微球→避光室温1400rpm，振荡孵育30min→14000g离心4min，用50μl1∶25稀释后的链亲和素-藻红蛋白重悬微球，避光室温孵育10min→14000g离心4min，用100μl/管的洗涤液重悬微球→转吸入96孔板，送入仪器检测→最后检测荧光值应超过10000。
实施例2检测抗体的生物素化(1)用30μl dmso溶解bca-sulfonhs(sigma)，并用0.1mol/l磷酸钠缓冲液定容为0.5ml，终浓度为10mg/ml→在1ml的10mg/ml的抗体(针对不同胃炎标志物，分别是pgi、pgii、g-17的第二抗体)溶液中加入38μl的bca-sulfonhs溶液→避光室温震荡30分钟→过sephadex g25柱分离纯化生物素化的抗体→用bac法测定回收后的抗体蛋白量。
(2)抗体生物素化效率检测取50μl标记好生物素的样品(标记好的pgi、pgii、g-17第二抗体)，加入5ul链酶蛋白酶，37℃水浴90分钟→将3.2ml抗生物素蛋白(avidin)与100ul 10mm的haba[2-(4-羟基苯偶氮基)苯甲酸，2-(4-hydroxyphenylazo)benzoic acid]混合，得到avidin-haba储液→将90ul的avidin-haba储液与10ul的酶处理后的样品或者浓度分别为30nmol/l、25nmol/l、20nmol/l、15nmol/l、10nmol/l、5nmol/l、2.5nmol/l、0nmol/l的d-生物素溶液混合→a500下(光程10mm)用pbs基线调零，测样品和各个浓度的d-生物素和avidin-haba储液的od值，做标准曲线，从而求得样品中的生物素的浓度→将生物素浓度/蛋白样品浓度＝生物素标记效率→生物素标记效率应大于5。
实施例3检测试剂盒的制备在本实施例中，制备一种用于检测胃炎标志物的试剂盒，所述的试剂盒包含以下组件(a)一个容器a，以及装于所述容器中分别偶联了pgi、pgii、g-17捕获抗体的微球混合液(实施例1中制备)。
(b)一个容器b，以及装于所述容器中生物素标记的pgi、pgii、g-17检测抗体的混合液(实施例2中制备)。
(c)一个容器c，以及装于容器c中的2×缓冲液a(10.1mm na2hpo4，138mmnacl，1.76mmkh2po4，2.7mmkcl，0.05％(v/v)tween-20，ph7.4)。
(d)一个容器d，以及装于容器d中的缓冲液b(10.1mm na2hpo4，138mmnacl，1.76mmkh2po4，2.7mmkcl，1％(m/v)bsa，0.02％(m/v)thimerosal，ph7.4)。
(e)一个容器e，以及装于容器e中的能与标记生物素的检测抗体结合的链亲和素-藻红蛋白。
(f)一套6个容器，以及装于容器中的一系列不同浓度的pgi、pgii、g-17标准品(浓度在7.5-15ug/ml)混合液。
(g)一块96孔抽滤板以及4块用于孵育时封板用的封板膜。
实施例4血清的检测(1)检测方法1、将抗体偶联微球在振荡器上1400rpm震荡30秒；2、将微球按1∶100稀释；3、将抗体偶联微球按50μl/孔的量加入96孔板中，真空抽干；4、加入100μl/孔的缓冲液a洗涤微球，重复该步骤；5、分别加入100μl/孔样品(已用1×缓冲液a 1∶5稀释)、标准品(不用稀释)，贴上封板膜；6、将板放置在平板摇床上，1100rpm避光振荡1min，然后600rpm避光室温孵育60min；7、真空抽滤，加入100μl/孔的1×缓冲液a，洗涤3次；8、加入100μl/孔的生物素标记二抗，将板放在平板摇床上，1100rpm避光振荡1min，600rpm避光室温孵育30min。
9、真空抽滤，加入100μl/孔的1×缓冲液a，洗涤3次；10、加入50μl/孔链亲和素-藻红蛋白(已用缓冲液b 1∶12.5稀释)，将板放在平板摇床上，1100rpm振荡1min，400rpm避光室温孵育10min；11、真空抽滤，加入100μl/孔的1×缓冲液a，洗涤3次；12、加入125μl/孔的缓冲液b重悬微球，将板放在平板摇床上，1100rpm避光振荡1min。
13、将板送入仪器检测。
(2)检测结果采用本方法对70余人份血清进行检测，结果如表1、表2所示。
表3为检测仪读取的检测数据。
表4为根据检测仪读取的检测数据换算获得的各标志物的相对浓度。
表3和表4的结果显示三种胃炎标志物的测定浓度精确。
并且，本发明人将采用本发明的方法测得的全部样品的检测结果与受试者的胃镜检验报告比较，结果完全一致。
表3
*well列各代号表示各种样品在96孔板上对应的孔号；description列中，n1-n5表示阴性对照，p1-p5表示阳性对照，1-50表示受试者样品；检测结果中，比如，731.0(113)，表示检测仪读取了113个微球，读到的荧光值为731.0。
表4
*type列中es1-es6表示六个标准品，x1-59代表未知样品；well列各代号表示各种样品在96孔板上对应的孔号；description列中，n1-n5表示阴性对照，p1-p5表示阳性对照，1-49表示受试者样品；后面3个obs conc表示该胃炎标志物通过标准曲线求得的浓度(g-17浓度单位pmol/l，pg-i浓度单位ug/l，pg-ii浓度单位μg/l)。oor＜表示检测后换算出的浓度远远超出标准曲线范围。表4是将荧光值在标准曲线中进行换算求得的浓度，做excel表输出整合而成。
图3为g-17的标准曲线，g-17标准品的浓度为0，0.126，0.252，0.503，1.062，2.125，4.25，8.5pmol/l，结果中对应标准品检测出的荧光值为y轴，对应标准品的浓度为x轴，由仪器软件求得标准曲线。系统根据样品检测的荧光值由标准曲线计算出样品中检测标志物的浓度。
实施例5采用本发明的蛋白质芯片与医院检测的结果比较根据实施例1和实施例2的方法制备蛋白质芯片和生物素标记的第二抗体等，并且根据实施例4所述的方法，本发明人又检测了多个样品。这些样品由山东大学齐鲁医院临床基础研究室提供，由胃镜检测确认是胃炎阳性样本。
胃泌素17、胃蛋白酶i和胃蛋白酶原ii的部分检测结果如表5、表6、表7所示。
当胃蛋白酶原i低于5μg/l时，表明有中度或者严重的胃体黏膜处胃炎或者胃体萎缩，是需要做进一步胃窦胃镜的标志，因为其低含量表明这些病人得胃癌的风险更大。
当结果中胃蛋白酶原i/ii的比值低于2.5时，该病患罹患胃体萎缩症的可能性大大提升。
在幽门螺杆菌抗体阳性的病人血清中，胃泌素-17的值小于5pmol/l说明其在胃窦处有中度或者重度的胃炎以及胃萎缩。
测得的胃泌素-17的浓度见表5；测得的胃蛋白酶原i的浓度见表6；测得的胃蛋白酶原ii的浓度见表7。
表5 表6
表7
*表5、表6、表7中，type列中es1-es6表示六个标准品，x1-29代表未知样品；well列各代号表示各种样品在96孔板上对应的孔号；obs conc表示该胃炎标志物通过标准曲线求得的浓度(g-17浓度单位pmol/l，pg-i浓度单位ug/l，pg-ii浓度单位μg/l)。oor＜表示检测后换算出的浓度远远超出标准曲线范围。
本发明人将采用本发明的蛋白质芯片测定的这些结果与医院的临床检测结果相比较，发现获得的结果完全相符。
在时间上，采用本发明的蛋白质芯片在测定这些结果时仅需要1.5小时时间，并且一次检测就获得了准确的结果；而医院采用elisa方法进行检测时，由于三个因子分别检测，累计消耗时间为10.5个小时，并且医院在检测时，有的样品因有背景干扰，需要反复验证。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种蛋白质芯片，其特征在于，所述的蛋白质芯片包括2种以上不同的微球，所述的微球上固定有不同的第一抗体，其中，所述的第一抗体为抗胃炎标志物的第一抗体，并且所述的第一抗体选自下组抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、或抗胃泌素-17抗体。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片中，抗胃蛋白酶原i抗体∶抗胃蛋白酶原ii抗体∶抗胃泌素-17抗体的摩尔比为(4-10)∶(4-12)∶(6-15)，当存在所述抗体时。
3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的不同的微球是具有不同微球识别信号的微球。
4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片中，每一种微球的数量为103-107个。
5.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述芯片含有三种不同的微球，并且在三种微球上分别固定有抗胃蛋白酶原i抗体、抗胃蛋白酶原ii抗体、和抗胃泌素-17抗体，其中，每种微球的数量为103-107个，并且各第一抗体的数量如下0.04-0.10微克抗胃蛋白酶原i抗体，0.04-0.12微克抗胃蛋白酶原ii抗体，0.06-0.15微克抗胃泌素-17抗体。
6.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述的第一抗体还包括抗cea抗体、抗ca19-9抗体、抗ca242抗体、抗ca724抗体、或抗ca50抗体。
7.一种多胃炎标志物并行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤(a)将待测样品与权利要求1所述的蛋白质芯片混合，从而使待测样品中的胃炎标志物与第一抗体及微球形成“胃炎标志物-第一抗体-微球”三元复合物；(b)将步骤(a)形成的三元复合物与第二抗体溶液混合，其中所述的第二抗体溶液含有不同种的带有可检测信号的第二抗体，每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于蛋白质芯片中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该胃炎标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2，从而形成“第二抗体-胃炎标志物-第一抗体-微球”四元复合物；(c)检测四元复合物中不同微球的微球识别信号，从而确定待检测样品中各胃炎标志物的存在与否以及存在的量；附加条件是待测样品与蛋白质芯片和第二抗体溶液的混合，可依次进行，也可同时进行。
8.一种用于检测多胃炎标志物的试剂盒，其特征在于，它包括以下组分(1)第一容器，以及装于该容器中的第一抗体溶液，所述的第一抗体溶液中含有权利要求1所述的蛋白质芯片。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，还包括(2)第二容器，以及装于该容器中的第二抗体溶液，其中所述的第二抗体溶液含有不同种的带有可检测信号的第二抗体，所述的每一种第二抗体分别抗一种胃炎标志物且对应于第一抗体溶液中相应的第一抗体，而且对应的第二抗体与第一抗体可同时结合于该胃炎标志物且第一抗体与第二抗体的摩尔比为1∶0.1-1∶2。
10.权利要求1所述的蛋白质芯片的用途，其特征在于，用于制备诊断或辅助诊断胃炎的试剂盒；或用于制备体外检测样品中是否存在胃炎标志物的试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白质芯片，所述的蛋白质芯片包括2种以上不同的微球，所述的微球上固定有不同的抗胃炎标志物的第一抗体。本发明还公开了一种多胃炎标志物并行检测的方法。本发明还公开了一种含有所述蛋白质芯片的试剂盒。本发明的蛋白质芯片对微球上带有的第一抗体的量进行配比设计，从而使得不容易检出的胃炎标志物也可灵敏地被检测，并且最大限度降低了不同分析物在杂交时存在的非特异性的结合，从而大大降低了背景信号的产生。
文档编号g01n33/544gk101063684sq20061002597
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者赵芹, 何笑恬, 洪巍, 黄承 申请人:上海华冠生物芯片有限公司