专利名称：一种与预测心脑血管病发生相关的蛋白标志物的集成检测方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质的检测技术，具体涉及与心脑血管病发生相关的蛋白标志物的检测技术。
背景技术：
心脑血管疾病是危害我国人民身体健康最主要的因素之一。随着高危人群的大量增加，快速准确地预测心脑血管病的发生以及判断心脑血管病的预后情况成为迫切需要解决的难题。以往认为通过血压、血糖、血脂以及吸烟等传统危险因素就可以评估心脑血管疾病的发病风险，如果只凭传统的危险因素进行评估可能会漏掉50％的急性冠脉综合症的患者。随着研究的深入，一些蛋白质作为新的危险因素和标志物成为研究的热点。现代检测技术的进步和蛋白质组学的发展，使从蛋白质标志物着手研究心脑血管病发生的预测工具成为可能。由于现有检测方法如免疫比浊法大部分只能检测单个指标，而单个指标的准确率较低，如果要评估多个指标必须反复作多次实验，不便于临床开展。高敏c反应蛋白(hs-crp)、同型半胱氨酸(hcy)、脂蛋白a(lp(a))、血栓前体蛋白(tpp)、d-二聚体(d-dimer)、纤维蛋白原(fig)、von willebrand因子(vwf)等被认为是能够预测冠心病、脑卒中的独立危险因素，要探讨这些蛋白标志物的临床应用价值，阐明其在心脑血管疾病事件预测中的综合作用，研究一种高度集成的蛋白质标志物检测技术，将多种指标的检测方法统一在一个平台之上，能够在较短的时间内简便、快捷、准确的获得多个甚至上百个指标的信息，为准确预测心脑血管事件提供全面的依据，及早发现心脑血管病的高危对象，及时进行有效干预，减少心脑血管疾病事件的发生，是一项具有极其重要价值的研究课题。
发明内容
本发明旨在提供一种与预测心脑血管病发生相关的蛋白标志物的集成检测技术，从而简便、快捷地分析人体内与心脑血管事件发生相关的蛋白标志物的变化，以及早发现心脑血管病的高危对象，及时进行有效干预，减少心脑血管事件的发生。
实现上述发明目的技术方案为一种与预测心脑血管病发生相关的蛋白标志物的集成检测方法，包括相关蛋白标志物的确定，捕捉抗体的制备，检测抗体的制备以及样品的测定，本发明一次检测同一样品中与心脑血管病相关的hs-crp、hcy、lp(a)、tpp、d-dimer、fig和vwf中的三种或三种以上蛋白标志物，具体步骤为(1)捕捉抗体的制备，将确定的三种或三种以上蛋白标志物的单抗包被在聚苯乙烯荧光微珠固体基质上，用羊抗鼠igg-生物素测定抗体的包被效率，(2)检测抗体的制备，另将上述三种或三种以上蛋白标志物另一不同抗原表位的单抗加入bac-s-nhs，进行生物素标记，纯化后测定抗体含量，计算生物素标记效率，(3)样品的测定[1]包被好抗体的蛋白标志物微珠悬液于96孔抽滤板的液相体系中，[2]抽滤板中分别加入血清样品或各种蛋白标志物不同浓度的抗原标准品，[3]加入生物素标记的蛋白标志物的检测抗体，[4]pe染色后液相蛋白芯片阅读仪检测。
下面结合附图进一步详述本发明。
图1与心脑血管病发生相关的蛋白标志物集成检测技术流程图；图2bio-plex液相蛋白芯片阅读仪检测包被了单抗的微珠的荧光值；图3过柱收集10管标记抗体穿流液的a280和a500检测；图4紫外-可见光分光光度计检测收集的第4、5管标记抗体a280和a500值；图5紫外分光光度计检测igg抗体浓度为1mg/ml时的a280值(e280)；图6生物素标准曲线。
1、与心脑血管病发生相关的蛋白质标志物的确定冠心病(心肌梗死、心绞痛)和脑卒中是主要的心脑血管疾病，而hs-crp、hcy、lp(a)、tpp、d-dimer、fig和vwf被认为是能够预测冠心病、脑卒中的独立危险因素。集成检测技术选择其中3种或3种以上的蛋白质作为检测标志物。
2、蛋白标志物集成检测技术的设计采用液相芯片体系将3种或3种以上的蛋白标志物单抗包被在不同色彩编号微珠上，将这些微珠悬浮于一个液相体系中，利用这个系统对同一个样品中的3种或3种以上蛋白标志物同时进行检测，具体检测步骤如下液相悬浮微珠法检测步骤2.1、多种蛋白标志物单抗的聚苯乙烯荧光微珠包被取300～700μl微珠，14000g离心4min，弃上清，加入240～560μl微珠洗涤缓冲液，震荡30s，50hz超声30s，14000g离心4min，弃上清，加入240～560μl微珠活化缓冲液，震荡30s，50hz超声30s，加入30～70μl edc和30～70μl s-nhs，1400转震荡20min，14000g离心4min，弃上清，加入500μl～1ml pbs洗涤，震荡30s，50hz超声30s，14000g离心4min，弃上清，加入300～700μl pbs重悬，分装成3～7管，每管分别加入3～7种蛋白标志物单抗各9μg，补充pbs至每管500μl终体积，4℃，1400转震荡过夜；14000g离心4min，弃上清，每管分别加入500μl pbs洗涤，加入250μl封闭缓冲液，1400转震荡20min，每管分别加入500μl储存缓冲液洗涤，16000g离心6min，弃上清，每管分别加入150μl储存缓冲液重悬，用羊抗鼠igg-生物素检测抗体的包被效率。
2.2、多种蛋白标志物单抗的生物素标记将3～7种蛋白标志物另一不同抗原表位的单抗分别稀释成1mg/ml，加入7.6μlbac-s-nhs(5mg/ml)，1400转震荡30min，将标记生物素的抗体过sephadex-g25柱纯化，依次收集10管穿流液，每管1ml，紫外分光光度计测定抗体含量(a280值)，测定igg抗体浓度为1mg/ml时的a280值(e280)，计算公式为蛋白(mg/ml)＝a280/e280；测定抗体标记的生物素含量(a500值)；计算3～7种蛋白标志物单抗的标记生物素与蛋白的比例(摩尔分子比)，表示抗体的生物素标记效率。
2.3、蛋白标志物抗原标准品的标准曲线建立和血清样品的检测各种蛋白标志物抗原标准品按400，200，100，50，25，10，5，0ng/l的浓度制作标准曲线。96孔板中每孔加入100μl包被好的微珠(1∶100稀释)，洗涤缓冲液洗涤20次，抽滤，加入100μl各梯度浓度的各种蛋白标志物抗原标准品，作3重复孔，其它孔加入100μl待测血清样品(1∶105稀释)，600转震荡1h；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体100μl(2μg)，600转震荡30min；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μl pe(1∶25稀释)，600转震荡10min；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μl分析缓冲液重悬；采用bio-plex液相蛋白芯片微珠阅读仪检测。
微珠洗涤缓冲液(bead wash buffer)；微珠活化缓冲液(bead activation buffer)；pbs，ph 7.4；封闭缓冲液(blocking buffer)；储存缓冲液(staining buffer)；上述溶液由bio-rad公司的微珠包被试剂盒内提供。
0.1m磷酸盐缓冲液(0.1m sodium phosphate buffer)；生物素化试剂(biotinylationreagent)；链霉蛋白酶(pronase)；由sigma公司的抗体生物素标记试剂盒内提供。
bio-plex液相蛋白芯片微珠阅读仪及随机配套的分析软件，各种蛋白标志物的单抗及抗原标准品购自biodesign公司，聚苯乙烯荧光微珠，微珠包被试剂盒购自bio-rad公司，抗体的生物素标记试剂盒购自sigma公司，本发明的蛋白标志物集成检测技术诊断冠心病的灵敏度和特异度明显优于单个指标检测的免疫比浊法(实验结果见表1)。
表1 液相芯片法与免疫比浊法比较对chd的诊断价值
脂蛋白(a)(lp(a))、纤维蛋白原(fig)、高敏c反应蛋白(hs-crp)联合检测对冠心病患者诊断的特异度(93.6％)高于单一指标的检测方法lp(a)(70.3％)、fig(75.7％)、hs-crp(86.5％)；联合检测对冠心病患者诊断的灵敏度(88.7％)高于单一指标的检测方法lp(a)(73.9％)、fig(56.5％)、hs-crp(63.0％)；该方法提高了对冠心病诊断的灵敏度和特异度，明显优于单个指标检测方法。
本发明建立了一种与预测心脑血管病发生相关的蛋白标志物的集成检测技术，不仅简便、快捷、而且显著提高了对心脑血管病发生预测的准确率。
具体实施例方式
冠心病诊断的3种相关蛋白标志物的集成检测方法1、研究对象待测血清样品采集2004年10月-2005年5月在本院住院，有胸闷、胸痛等症状，疑诊冠心病患者240例，排除肝肾功能不全、感染、肿瘤、免疫系统疾病、凝血功能障碍以及近期有大手术史、急性心肌梗死急性期、血清磷酸肌酸激酶(cpk)升高大于正常值2倍以上等可能影响hs-crp的情况后，共有100例符合标准纳入研究，其中男性59例，女性41例，年龄59±11岁，同时记录患者的高血压、糖尿病、高血脂、既往心肌梗死病史。所有患者均接受冠状动脉造影检查。冠心病组冠状动脉造影显示左主干、左前降支、左回旋支、右冠脉4支血管中至少1支直径狭窄程度≥50％，共53例；非冠心病组冠状动脉造影显示所有血管直径狭窄程度＜50％者归为对照组，共47例；患者均清晨空腹采血。
2、蛋白标志物的选择脂蛋白(a)、纤维蛋白原和高敏c反应蛋白作为冠心病诊断的集成检测技术的3种相关蛋白检测标志物；
3、液相悬浮微珠法(液相蛋白芯片法)检测方法3.1、捕获抗体的制备-3种蛋白标志物单抗的聚苯乙烯荧光微珠包被取300μl微珠，14000g离心4min，弃上清，加入240μl微珠洗涤缓冲液，震荡30s，50hz超声30s，14000g离心4min，弃上清，加入240μl微珠活化缓冲液，震荡30s，50hz超声30s，加入30μl edc和30μl s-nhs，1400转/分，震荡20min，14000g离心4min，弃上清，加入500μl pbs洗涤，震荡30s，50hz超声30s，14000g离心4min，弃上清，加入300μl pbs重悬，分装成3管，每管分别加入脂蛋白(a)、纤维蛋白原和高敏c反应蛋白的单抗7μg、12μg、9μg，补充pbs至每管500μl终体积，4℃，1400转/分，震荡过夜；14000g离心4min，弃上清，每管分别加入500μl pbs洗涤，加入250μl封闭缓冲液，1400转/分，震荡20min，每管分别加入500μl储存缓冲液洗涤，16000g离心6min，弃上清，每管分别加入150μl储存缓冲液重悬，用羊抗鼠igg-生物素检测抗体的包被效率，结果表明包被检测的荧光值为25500-26500fi，远远超过2000fi的的最低包被荧光值。见图2和表2。
表2 每100μl微珠分别包被不同量的3种单抗的最高平均荧光值
3.2、检测抗体的制备-3种蛋白标志物单抗的生物素标记将3种蛋白标志物另一不同抗原表位的单抗分别稀释成1mg/ml，加入7.6μlbac-s-nhs(5mg/ml)，1400转/分，震荡30min，将标记生物素的抗体过sephadex-g25柱纯化，依次收集10管穿流液，每管1ml，紫外-可见光分光光度计的a280检测蛋白含量，a500检测生物素标记效率，见图3；其中纯化的抗体主要集中在第4、5管，见图4；紫外分光光度计测定抗体含量(a280值)，测定igg抗体浓度为1mg/ml时的a280值(e280)，见图5；生物素标准曲线见图6；计算公式为蛋白(mg/ml)＝a280/e280；测定抗体标记的生物素含量(a500值)；计算3种蛋白标志物单抗的标记生物素与蛋白的比例(摩尔分子比)，表示抗体的生物素标记效率，结果表明每种抗体的生物素标记效率约为12，即每摩尔分子的抗体蛋白有12摩尔分子的生物素被标记上。
3.3 3种蛋白标志物抗原标准品的标准曲线建立和血清样品的检测3种蛋白标志物抗原标准品按400，200，100，50，25，10，5，0ng/l的浓度制作标准曲线，96孔板中每孔加入100μl包被好的微珠(1∶100稀释)，洗涤缓冲液洗涤2次，抽滤，加入100μl各梯度浓度的3种蛋白标志物抗原标准品，作3重复孔，其它孔加入100μl患者清晨空腹采血的血清样品(1∶105稀释)，600转/分，震荡1h；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入生物素标记的检测抗体100μl(2μg)，600转/分，震荡30min；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入50μl链霉亲和素标记的pe荧光素(1∶25稀释)染色，600转/分，震荡10min；抽滤，洗涤缓冲液洗涤3次，加入125μl分析缓冲液重悬；采用bio-plex液相蛋白芯片微珠阅读仪检测。
检测结果液相芯片法检测血浆中脂蛋白a、纤维蛋白原和高敏c反应蛋白值
续上表
续上表
注冠心病判断标准依据冠脉造影的结果；1表示是冠心病；0表示不是冠心病。
各种检测物参数的阳性界限分别为lp(a)≥300mg/l、fig≥4.0g/l、hs-crp≥4.5mg/l；以冠脉造影的结果为标准，本发明的蛋白标志物集成检测技术诊断冠心病的灵敏度为88.7％；特异度为93.6％。
权利要求
1.一种与预测心脑血管病发生相关的蛋白标志物的集成检测方法，包括相关蛋白标志物的确定，捕捉抗体的制备，检测抗体的制备以及样品的测定，本发明的特征在于(1)检测样品采用的相关蛋白标志物为与心脑血管病相关的hs-crp、hcy、脂蛋白(a)、tpp、d-二聚体、纤维蛋白原和vwf中的三种或三种以上蛋白标志物；(2)捕捉抗体的制备，将确定的三种或三种以上蛋白标志物的单抗包被在聚苯乙烯荧光微珠固体基质上，用羊抗鼠igg-生物素测定抗体的包被效率；(3)检测抗体的制备，另将上述三种或三种以上蛋白标志物另一不同抗原表位的单抗加入bac-s-nhs，进行生物素标记，纯化后测定抗体含量，计算生物素标记效率；(4)样品的测定[1]包被好抗体的蛋白标志物微珠悬液于96孔抽滤板的液相体系中，[2]抽滤板中分别加入血清样品或蛋白标志物不同浓度的抗原标准品，[3]加入生物素标记的蛋白标志物的检测抗体，[4]pe染色后液相蛋白芯片阅读仪检测。
全文摘要
本发明涉及与心脑血管病发生相关的蛋白标志物的检测技术。集成检测技术是指对同一样品一次检测多种与心脑血管病发生相关的蛋白标志物，本发明采用液相芯片法，在聚苯乙烯荧光微珠上包被心脑血管病事件相关蛋白质标志物的相应抗体，用来捕捉被测液体中对应的蛋白标志物，并利用各蛋白标志物的检测抗体来测定样品中各蛋白标志物的浓度，集成检测能在较短的时间内准确的获得多个指标的信息，与单一指标的免疫比浊法比较，灵敏度在80％以上，特异度在90％以上，因此集成检测可以为准确预测心脑血管病的发生提供全面的依据，明显提高对心脑血管病发生预测的准确率。
文档编号g01n33/68gk1773283sq20051003236
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月11日 优先权日2005年11月11日
发明者袁洪, 闾宏伟, 黄志军 申请人:袁洪, 闾宏伟, 黄志军