运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白质及其生成和使用方法
【专利摘要】本发明提供了重组蛋白及其生成和使用方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的运铁蛋白。本发明还提供了能够表达所述重组蛋白的表达系统、质粒和细胞及其生产和使用方法。
【专利说明】运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白质及其生成和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年8月17日提交的美国临时申请n0.61/524，508的优先权权益，此文整体附此作参考。
发明领域
[0003]本发明涉及重组蛋白及其生成和使用方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素或其他抗血管生成蛋白的运铁蛋白。本发明还涉及能够表达所述重组蛋白的表达系统及其生产和使用方法。
[0004]发明背景
[0005]脉络膜新生血管(choroidal neovascularization, cnv)是指脉络膜血管系统的不受控生长，它会在诸如弹性假黄色瘤、血管样条纹症、组织胞浆菌病、点状内层脉络膜病变、湿性年龄相关黄斑变性(amd)等疾病中导致严重视觉丧失。湿性amd在玻璃疣(补体成分、脂质和载脂蛋白)淀积引起受限缺血性区域，造成低氧时发生。据信，低氧导致血管内皮生长因子(vegf)分泌增加，其活化脉络膜内皮细胞分泌基体金属蛋白酶(mmp)。金属蛋白酶降解细胞外基质，以此允许内皮细胞增殖及其向视网膜迁移。最后，mmp的作用造成新血管或cnv的形成，其能引起视网膜脱离和出血及由于血液和脂质泄漏所致的视网膜下损伤形成。在证实后，cnv是工业化国家的老年人群中视觉丧失的主要原因。
[0006]当前cnv的治疗限于患者群体的一部分，并且聚焦于抑制vegf在血管通透性过高(hyperpermeability)和新血管形成中的有害作用。然而，vegf还在诸如伤口愈合、光感受器存活和脉络膜毛细管床的维护等生理活动中起建设性的关键作用。当前，ranibizumab (lucentis?), aflibercept (eylea?)和 pegaptanib (macugen?)是仅有的两种目前为止批准用于治疗cnv的治疗剂。这些药剂抑制vegf。已经表明，在治疗cnv方面ranibizumab 一般比 pegaptanib 更有效。ranibizumab 与 vegf-a 所有的同种型(isoform)结合，并抑制vegf活性，包括血管通透性和生长。除两种提及的治疗剂外，还探索了贝伐珠单抗(avastin?) (ranibizumab的亲本全长抗体)作为针对cnv的标签外(off label)治疗。
[0007]尽管这些治疗在治疗cnv中获得成功，但在这些治疗上有固有的缺点，包括在活化的内皮细胞中缺乏凋亡和vegf相关生理活动诸如伤口愈合的潜在损害。另外，ranibizumab的使用导致全身性危险,包括人玻璃体内给药之后的血栓栓塞事件率增大。玻璃体内贝伐珠单抗还与缺血性发作、血压升高、脑血管事故和死亡相联系。另外，在cnv患者的临床试验中，对ranibizumab的响应率在cnv患者中只有约40%，而且来信数目增加(gain in number of letters)仅为 7.2。
[0008] 因此，需要新的和/或更有效的用于治疗cnv的治疗方法，其具有降低的副作用和/或更好的治疗功效。
[0009]发明概述
[0010]本发明的某些方面提供重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素或其他类似的抗血管生成蛋白的运铁蛋白。在某些实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此直接连接。在其他实施方案中，运铁蛋白和肿瘤抑素彼此通过接头共价连接。适用的接头对于本专业技术人员是众所周知的。
[0011 ] 本发明的其他方面提供质粒，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。通常，编码重组蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列。
[0012]本发明的再其他方面提供重组核酸分子，其包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。在某些实施方案中，核酸序列可操作连接到表达控制序列。
[0013]本发明的再其他方面提供用重组核酸分子转染并表达重组核酸分子的重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码重组蛋白的核酸序列，所述重组蛋白包含连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
[0014]本发明其他方面提供一种用于生成包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的方法，所述方法包括:
[0015]用重组核酸分子转染重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列；
[0016]在足以产生包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的条件下，培养转染的宿主细胞；并
[0017]将该重组蛋白以基 本上纯化的重组蛋白回收。
[0018]在某些实施方案中，重组蛋白包括直接连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
[0019]本发明的再其他方面提供一种用于治疗受试者中与脉络膜新生血管(chotoidalneovascularization, cnv)有关的临床状况的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的重组蛋白，该重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
[0020]在某些实施方案中，与cnv相联系的临床状况包括弹性假黄色瘤、血管样条纹症、组织胞浆菌病、点状内层脉络膜病变或湿性年龄相关黄斑变性(amd)。
[0021]本发明的成份还可以用来治疗诸如但是不限于癌症；癌症关联新血管化；角膜血管发生；增生性糖尿病性视网膜病变；新血管性(neovascular)青光眼；其他新血管性和血管性增生性眼病症；以及身体其它地方的其他新血管性和血管性增生性病症。
[0022]本发明的组合物可以利用对于本领域技术人员已知的任何方法给药，包括但是不限于玻璃体内、静脉内、脉络膜上、表面、眼周、皮下、肌肉内、视网膜下、眼球后、巩膜内等。
[0023]附图简述
[0024]图1是表示运铁蛋白-肿瘤抑素、贝伐珠单抗和肿瘤抑素的抗增殖活性的图；
[0025]图2是表示用不同浓度的肿瘤抑素、运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗蛋白对在脉络膜内皮细胞中观察到的内皮管形成的抑制的图；
[0026]图3是表示bn大鼠cnv损伤大小的体内评估的柱状图；
[0027]图4是运铁蛋白-肿瘤抑素持续性基因表达构建体的图示。
[0028]发明详述
[0029]本发明的某些方面提供包含连接(亦即，附着)到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白。运铁蛋白可以直接或间接(例如，通过接头)连接到肿瘤抑素。本发明其他方面提供重组核酸分子，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。本发明的再其他方面提供用重组核酸分子转染并表达该重组核酸分子的重组宿主细胞，该重组核酸分子包括编码重组蛋白的核酸序列，该重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。本发明的再其他方面提供用于生成和使用重组蛋白的方法，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
[0030]肿瘤抑素已经表明在治疗cnv上是治疗有效的。不受任何理论束缚，据信肿瘤抑素具有通过引起凋亡从而使血管发生消退的能力，即一种在当前cnv治疗中缺乏的特性。
[0031]肿瘤抑素是一种内源性血管发生抑制剂，它最初从存在于基底膜中的胶原iv的c端非胶原域(ncl)获得。据信，肿瘤抑素通过结合ανβ3整联蛋白，阻止内皮细胞增生和另外通过诱使内皮细胞凋亡，起抑制血管形成作用。在不存在任何病理条件的情况下，在血管生成分子(诸如vegf)和抗血管生成分子(诸如肿瘤抑素)之间维持平衡。在低氧和缺血的过程中，在血管生成分子和抗血管生成分子之间的平衡据信被干扰，因此引起新血管化。与肿瘤抑素一样的血管发生抑制剂是人体对抗新血管化的固有机制的一部分。
[0032]肿瘤抑素比起ranibizumab和贝伐珠单抗具有许多优点，而且据信治疗上优于这些抗体。至今，肿瘤抑素受体，即ανβ 3整联蛋白，只在活化的内皮细胞上，而不在正常的血管上发现。因而，据信，肿瘤抑素提供一个在不影响诸如伤口愈合等生理过程情况下通往靶向活化的内皮细胞的途径。肿瘤抑素促进内皮细胞凋亡，并据信由肿瘤抑素所引起的凋亡可以造成增生血管的消退，并因而在恢复正常视觉中是有利的。因而，肿瘤抑素可以在没有任何明显的抗vegf治疗相关副作用的情况下，有效治疗新血管化并避免视觉丧失。
[0033]今人惊讶和意外的是，本发明人已经发现，肿瘤抑素在cnv中的疗效可以通过将肿瘤抑素连接到其他蛋白质而得到显著增强。在一个特定的实施方案中，肿瘤抑素连接到运铁蛋白，以便实现融合蛋白从视网膜色素上皮(rpe细胞)的极化分泌(polarizedsecretion)。当曝露于rpe单层时,与肿瘤抑素相比，该融合蛋白质优先向基底外侧分泌。用运铁蛋白-肿瘤抑素基因转染之后，与肿瘤抑素基因产物相比，所形成的运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质在极化的上皮细胞单层中更多向基底外侧方向分泌。在紧邻活化且新血管脉络膜内皮的细胞处，重组运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白的基底外侧分泌递送肿瘤抑素，以此提高肿瘤抑素的治疗活性。不受任何理论束缚，据信运铁蛋白-肿瘤抑素增强的基底外侧分泌在患有amd的患者的眼中是显著的，因为铁含量和运铁蛋白受体活性可能在这些患者的眼中升高。据信，消除铁的最容易取得的途径是通过脉络膜血管系统。该途径还导致升高的运铁蛋白(及因此重组运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白)向脉络膜的分泌。
[0034]基于上述内容，本发明人研究了一种新型运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白质(亦即，重组运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白)及其在抑制脉络膜内皮细胞的迁移、增殖，管形成上的效能。将这些活性与贝伐珠单抗的活性比较。另外，本发明人已经确定，本发明的重组蛋白以极化方式在完全确立的极化细胞模型(例如，madin-darby犬肾脏，亦即，mdck细胞)中分泌的能力。
[0035]正如在这里使用的，术语“运铁蛋白”包括治疗有效的运铁蛋白片段。在某些实施方案中，术语“运铁蛋白”是指至少具有可以结合整联蛋白的运铁蛋白肽片段的肽。或者，术语“运铁蛋白”通常是指具有整个运铁蛋白肽序列的至少5个氨基酸的肽。或者，术语“运铁蛋白”是指具有整个运铁蛋白肽序列的至少25%，通常至少50%，经常至少75%，更经常至少90%的肽，只要 该片段能够选择性与整联蛋白结合。因而，任何治疗有效的运铁蛋白片段都可以用于重组蛋白向新血管区域的靶向摄取和分泌(例如，向脉络膜分泌)。在某些实施方案中，治疗有效的运铁蛋白片段包括通常可以选择性与整联蛋白结合的运铁蛋白肽片段。
[0036]带有生物活性的运铁蛋白的某些片段对于本领域技术人员是已知的。应该认识到，本发明的范围包括全长的运铁蛋白和肿瘤抑素蛋白以及这些蛋白质中一个或两者的片段，只要这样的重组蛋白具有期望的生物活性。本领域技术人员可以容易地通过利用体外和体内实验，诸如这里公开的实验确定运铁蛋白和/或肿瘤抑素的特定片段是否具有期望的生物活性。因而，本发明的范围包括任何用于治疗新血管性病症的治疗性融合蛋白(亦即，重组肿瘤抑素-运铁蛋白蛋白)，其中肿瘤抑素和/或运铁蛋白可以独立是完整蛋白质或其片段。据信，重组蛋白通常比亲本蛋白质在治疗上更有效。本发明的组合物包括能够在相关细胞中表达重组蛋白的重组蛋白或核酸构建体。
[0037]系列i肽。运铁蛋白片段
[0038]这里讨论的是能够赋予基底外侧分泌的一些代表性运铁蛋白片段和用于鉴定和产生该运铁蛋白片段的方法。
[0039]分析了运铁蛋白蛋白质序列以及各种分泌性蛋白质的序列，并鉴定适宜产生能够基底外侧分泌/转运的新融合蛋白的运铁蛋白片段。诸如白介素6 (holtkamp et al.,clinexp immunol.，1998，112 (i)，34-43)、白介素 8 (同上)和血管内皮生长因子 a (vegf-a)(sonoda et al.，aging, 2010, 2 (i), 28-42)等各种基底外侧分泌性蛋白质的肽序列的分析导致此类蛋白质的n端氨基酸中令人惊讶的相似性的鉴定。据信，包括白介素6、白介素8和血管内皮生长因子a(vegf-a)的蛋白质是在基底外侧分泌的，并具有丰富的亮氨酸氨基酸。另外，二亮氨酸(dileucines)(亦即，“ll”)存在于这些蛋白质的n端附近。根据这些认识，本发明人已经鉴定以下运铁蛋白中可以负责运铁蛋白-肿瘤抑素基底外侧分泌的代表性肽:mrlavgall (seq id no:1) ；mrlavgallvc (seq id no:2) ;llvcavlglcl (seq id no:3) ；gallvcavlglcl(seq id no:4) ；llvcavlglclav(seq id no:5) ；gallvcavlglclav(seq idno:6);和mrlavgallvcllvcavlglclav (seq id no:7)。因而，在某些实施方案中，包括这些肽的任何肽或重组肽都适宜于实现运铁蛋白-肿瘤抑素的基底外侧分泌。这些肽(亦即，这里公开的运铁蛋白片段)在与肿瘤抑素或任何其他适用治疗性蛋白质融合时，都会导致治疗蛋白质的基底外侧分泌(例如，跨越视网膜色素上皮向脉络膜)。
[0040]系列ii肽。能够结合整联蛋白的运铁蛋白肽:
[0041]令人惊讶和意外的是，本发明人还已经发现，运铁蛋白蛋白质除其预期的与运铁蛋白受体相互作用以外，还可以与ανβ3整联蛋白受体互相作用。本发明的重组运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质相信与作为肿瘤抑素受体的α νβ 3整联蛋白受体互相作用，另外，由于存在运铁蛋白，还与运铁蛋白受体相互作用。利用运铁蛋白-肿瘤抑素对ανβ3整联蛋白受体的计算机入玛(in silico docking),本发明人已经鉴定出运铁蛋白蛋白质内与整联蛋白受体互相作用的氨基酸。以下氨基酸是一些基于计算机入坞，相信与整联蛋白受体互相作用的代表性肽:
[0042]q(127)，n(129)，l(131)，n(148)，i (151)，g(152)，c(156)，l(158)，k(163)，
[0043]e (166)，k (167)，a (168);和
[0044] c (246)，t (250)，r (251)，d (259)，e (337)，i (342)，l (345)，t (349)，e (357)，[0045]k (359)，l (366)，e (370)，w (377)，c (396)，i (400)，n (402)，e (404)，
[0046]a (405)，d (406)，l (423)，v (424)，p (425)，e (429)。
[0047]根据这些互相作用的氨基酸，以下运铁蛋白的肽被设计成那些能够与整联蛋白受体互相作用的:gfqnlnigclkekava(seq id no:8) ；llctrdeiltekleffcineadlvpeny(seq id
no:9);运铁蛋白127_168 ;运铁蛋白125_17(| ;运铁蛋白246_259 ;运铁蛋白244_261 ;运铁蛋白337_429 ;和运铁蛋白335_431。正如在这里使用的，术语“运铁蛋白x_y”是指以氨基酸“x”为起点，以氨基酸“y”为终点的运铁蛋白氨基酸序列。
[0048]系列iii肽。能够结合到运铁蛋白受体的运铁蛋白片段
[0049]以下公开的是一些发现能够结合到运铁蛋白受体的代表性运铁蛋白片段。
[0050]据信，运铁蛋白中以下氨基酸与运铁蛋白受体互相作用。运铁蛋白161_169 ;h(368)，r(371), l(372), d(375), e(376), s(378), v(379) ；prkplekav(seq id no:10);运铁蛋白159-171 ;运铁蛋白;和运铁蛋白％eii。因而，运铁蛋白的这些片段也可以用于本发明的方法。
[0051]系列iv肽。带有抗血管生成和/或抗癌活性的肿瘤抑素片段
[0052]术语“肿瘤抑素”包括治疗有效的肿瘤抑素片段。具体地说，术语“肿瘤抑素”包括相对于在没有任何附加的肿瘤抑素肽的情况下利用运铁蛋白，能够增大运铁蛋白递送的肿瘤抑素肽部分或片段。因而，在某些实施方案中，术语“肿瘤抑素”是指至少具有相对于没有此类肽的运铁蛋白，可以增大运铁蛋白的治疗有效性的肿瘤抑素肽片段的肽。或者，术语“肿瘤抑素”是指具有整个肿瘤抑素肽序列的至少25%，通常至少50%，经常至少75%，和更经常至少90%的肽。某些带有生物活性(例如，抗血管生成活性)的肿瘤抑素片段对于本领域技术人员是已知的。应该认识到，本发明的范围(以及术语“肿瘤抑素”)包括全长肿瘤抑素蛋白质及其片段。
[0053]肿瘤抑素是一种结合到ανβ 3整联蛋白受体和抑制肿瘤生长的血管发生抑制剂。以前的缺失诱变研究(例如，见 eikesdal et al.，pnas, 2008，105 (39)，15040-15045 ；和 thevenard et al.，int.j.cancer, 2010,126,1055-1066)已经识别出带有抗血管生成活性的肿瘤抑素的以下氨基酸片段:肿瘤抑素74_98 ;肿瘤抑素185_2(13 ;和ysnsg(seq id no:11)。
[0054]本发明人还已经通过计算机蛋白质建模根据上述肽序列设计新型肽。在一个特定的实施方案中，在两点处用h(组氨酸)取代d(天冬氨酸)，如下所示:tmpflfcnvnhvcnfasrnhysywl(seq id no:12)
[0055]据信，用d代替h造成一个在h正电荷和其他蛋白质电荷之间有利的净静电相互作用。在某些其他实施方案中，疏水性残基丙氨酸(a)和亮氨酸(l)用精氨酸(r)(—种亲水性氨基酸)取代。这些修饰的肽中的一些包括:tmpflfcnvndvcnfssrndysywl(seq id no:13) ；tmpflfcnvndvcnfasrndysywr (seq id no:14) ；cnyysnsysffflrslnper (seq id no:15)；和 cnyysnsysfwlassnper(seq id no:16)。
[0056]精氨酸包含负责其极性的胍基。据信，用亲水性精氨酸取代疏水性残基依靠与该溶剂形成的额外氢键有助于改善该蛋白质的稳定性。另外，据信，在ph7.4时其胍基带正电荷的精氨酸将在表面上引入电荷，并提供在该蛋白质表面上额外相互作用的途径。上述这些天然序列或修饰片段中的任何一个都可以用来建立本发明的融合或重组蛋白。因此，应该认识到，术语“运铁蛋白”和“肿瘤抑素”包括那些修饰，其中一个或多个氨基酸残基用非野生型氨基酸(包括同系物氨基酸)取代。本领域技术人员阅读了本公开之后可以容易地确定适用的氨基酸取代。
[0057]正如上面讨论的，除运铁蛋白和肿瘤抑素的全长重组蛋白以外，本发明的范围包括其中运铁蛋白和/或肿瘤抑素的全长蛋白质中的一个或两者用上面公开的任何相应的部分肽取代的重组的蛋白质。
[0058]因此，本发明的范围包括重组蛋白，其中来自上述系列i或iii肽中公开的肽或运铁蛋白本身的与上述系列ii或iv肽中公开的肽或肿瘤抑素本身的肽/蛋白质的任何组合(例如，与任何治疗性蛋白质或诸如肿瘤抑素的肽或系列ii或iv肽的肽融合的系列i肽；和与序列i肽等融合的序列ii肽)。另外，系列i肽可以与任何新的治疗性大分子组合以靶向摄取/转运/分泌。
[0059]检查以下不拟作为限制的实施例，本发明的其它目标、优点和新型特征对本领域技术人员将变得显而易见。在这些实施例中，推断性地归结为实践的程序用现在时态描述，而已经在实验室进行的程序用过去时态描述。
实施例
[0060]材料和方法
[0061]实施例1
[0062]材料:transwell?滤器(0.4 μ m孔径)购自coming inc., ny。牛血清白蛋白购自 sigma aldrich (mo)。bd 基质胶基质生长因子还原性(matrigel matrix growth factorreduced)购自 bd biosciences (ca)。dna 梯，lipofectamie?: 2000 试剂和 dapi 染料购自invitrogen corporation (ca)。所用限制酶购自 new england biolabs (ma)。quikchange?位点定向诱变试剂盒购自agilent technologies (ca)。运铁蛋白基因、脉络膜内皮细胞(rf/6a)和rf/6a细胞培养基购自美国典型培养物保藏中心(american type culturecollection), va0 qiagen? 质粒 giga 试剂盒购自 qiagen inc.(ca)。talon? 金属亲和树脂(目录 #635502)购自 clonetech laboratories, inc.(ca)。bca? 蛋白质分析试剂盒，用以估计蛋白质含量，购自pierce biotechnology, inc.(il)(目录#23225)。现成凝胶，即来自 bio-rad laboratories, inc.(ca)的 10% ready gel tris-hcir 和来自 fisherscientinc (pa)的ez run?预染蛋白梯在sds page凝胶电泳过程中使用。bca?蛋白质分析试剂盒购自 thermo fisher scientific (il)。
[0063]质粒的构建:为了进行该项研究制备了四种不同的构建体，其包含以下cdna，即(a)肿瘤抑素；(b)肿瘤抑素-egfp ; (c)运铁蛋白-肿瘤抑素(见图4，它示意性显示运铁蛋白-肿瘤抑素持续性基因表达构建体。带有运铁蛋白的类似构建体对肿瘤抑素的长期表达是有用的)；和(d)运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp。全部引物购自integrateddnatechnologies inc.(ca)，用于该实验。利用正向引物(5’-cgatggatccgcaacctggacaacgagaggctt-3’)(seq idno:17)和反向引物(5’-cgatctcga gagtgtcttttcttcatgcacacc-3’)(seqid no:18)将肿瘤抑素cdna用pcr扩增，并以bamhl和xho i片段连接到载体psectag2b中。利用pegfp载体(clonetech laboratories,ca)作为模板并利用正向引物(5’-atcgataagctttgtgagcaagggcgaggagc-3’)(seq id no:19)和反向引物(5’-atcgatggatcccttgtacagctcgtccatgc-3’)(seq id no:20)将 egfp 作为 hind iii 和 bamhl 片段克隆到 psectag2b 载体中。
[0064]如下以igk分泌序列交换运铁蛋白，即首先用nhel及sfil消化我们的构建体以除去 igk 序列。利用正向引物(5，-agtcgctagcatgaggctcgccgtg ggagccc-3’ ) (seq id no:21)和反向引物(5，-agtcgcggccggctgg gccaggtctacggaaagtgcaggct-3’) (seq id no:22)(其分别包含限制位点nhel和sfil位点)扩增运铁蛋白，并克隆到线性化载体中。将运铁蛋白掺入包含肿瘤抑素和pegfp的psectag2b中。在该过程中除去psectag2b的igk基因部分。使用同一正向和反向引物将运铁蛋白掺入只包含肿瘤抑素的psectag2b载体中，以生成运铁蛋白-肿瘤抑素质粒。
[0065]利用大肠杆菌(e.coli)细菌的dh5a菌株增加全部质粒,并利用qiagen?质粒giga试剂盒扩增。在tae缓冲液中制备i %琼脂糖凝胶，并用以研究cdna构建体。利用geldoc xr?成像系统(bio-rad laboratories, inc.ca)拍摄照片。
[0066]蛋白质的生产和纯化:用于构造质粒的psectag2b载体(如上所述)具有六组氨酸标签，它可以帮助述化培养基中分泌的蛋白质。在arpe(人视网膜色素上皮)细胞中转染该质粒，以表达所建立的融合蛋白。将arpe细胞培养，直至达到80%汇合。利用lipofectamine? 2000试剂进行arpe细胞的暂态转染。talon?.金属亲和树脂用以纯化有组氨酸标签的蛋白质。bca?蛋白质分析试剂盒用以估计洗脱液的蛋白质含量。利用牛血清白蛋白(sigma aldrich, mo)制作蛋白质估计标准曲线。
[0067]arpe细胞的共聚焦显微术:在apre细胞中研究肿瘤抑素-egfp质粒，以观察egfp基因在该细胞中发挥功能。将arpe细胞培养，直至达到80%汇合。利用lipofectamine?2000试剂进行arpe细胞的暂态转染。对细胞核完成dapi (4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐)染色。没有用肿瘤抑素-egfp质粒转染且仅dapi染色的arpe细胞用作对照。
[0068]为了研究运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp和肿瘤抑素-egfp的内在化，使蛋白质脉络膜内皮细胞暴露于运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp和肿瘤抑素-egfp蛋白质达24小时。24小时后，将细胞用冷pbs ph7.4洗涤，然后用冷酸性缓冲液(ph5.0)洗涤，并利用4%低聚甲醛固定并用dapi染色。在nikon clsi?共聚焦显微镜下观察细胞。
[0069]运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp融合蛋白质的极化分泌:为了进行融合蛋白极化分泌的研究，选择mdck细胞系，因为它是一种充分了解的极化系统。mdck细胞具有向顶端或基底外侧表面递送膜蛋白质的路径。
[0070]将mdck细胞铺在transwell滤器上，并利用evom?电阻计(world percisioninstruments, ca)测量转移上皮电阻(trans epithelial electrical resistance, teer)。当teer大于300 ω时，如上所述用肿瘤抑素-egfp或运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp质粒转染细胞。转染24小时后，固定mdck细胞并利用dapi核染料染色。单独从基底外侧和顶侧两者收集该培养基，并利用bca?蛋白质分析试剂盒量化融合蛋白。
[0071]细胞增殖分析:用脉络膜内皮细胞(rf/6a)研究肿瘤抑素蛋白质和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质对在vegf165的作用下细胞增殖的作用。用mtt分析来估算细胞增殖。
[0072]在约20，000个细胞/孔的接种密度下将脉络膜内皮细胞(rf/6a，第9次传代)在96-孔板中分配，并容许粘附孔24小时。24小时后，用vegf165(r&d systems, mn)溶液在50ng/ml浓度下使细胞孵育。利用50ng/ml的vegf165诱导rf/6a细胞增殖。在96孔中，3孔保留作为对照，其只包含rf/6a细胞和50ng/ml的vegf165。其余各孔以不同的浓度包含贝伐珠单抗、肿瘤抑素或运铁蛋白-肿瘤抑素。
[0073]对于贝伐珠单抗使用这些浓度:1.5_500nm。在24小时结束时吸出培养基，并将200 μ i无血清新鲜培养基加到每个孔中。mtt试剂(sigma aldrich, mo)，亦即3- (4，5- 二甲基噻唑-2-基)-2，5- 二苯基溴化四钠)，(20 μ i溶解于pbsph7.4中的5mg/ml mtt)加到每个孔中，并在37°c孵育3小时。吸出培养基，并将所形成的甲腸(formazan)晶体溶解在200 μ i dmso中。加入dmso之后,该晶体溶解,并利用微板读板仪(microplate reader)在570nm测量颜色吸光度。在下一个实验中，在以下浓度:7.8_1000nm，用肿瘤抑素或运铁蛋白-肿瘤抑素代替贝伐珠单抗。遵循与上文所述相同的方法。在1.5-500nm浓度使用运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质(对于每个浓度，η = 3)。
[0074]管形成分析:在4°c融化基质爿交?过夜。为了进行管形成分析，将75ul融化的基质胶涂布在每一个孔的底部，制备48孔板。该孔板在37°c保持30分钟使基质胶聚合。将脉络膜内皮细胞转移到包含基质胶的48孔板。每个孔包含6xl03个细胞。三个孔保留作为对照，不掺入肿瘤抑素。其它的45个孔包含上文对增殖分析描述的浓度的肿瘤抑素蛋白质。该板在37°c保持18小时。利用光学显微镜分析管形成。使用同一方法进行运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗蛋白质实验。利用范围为0.15至500nm的浓度(对于每个浓度，η =3)。
[0075]细胞i千移分析:利用基质胶停入室(8 μ m孔径,becton dickinson,ma)进行体外细胞迁移分析。将0.5ml无血清培养基中的5x10s个细胞悬浮液加到基质胶室。孔用imllong/ml vegf溶液填充。该室在37°c在95%空气/5% co2培养箱中孵育24小时。该膜下表面上的细胞用苏木精和伊红染料染色。侵入细胞在nikon显微镜下以40倍放大倍数拍摄像片，并对于每个浓度，在三个膜的五个视野中计数。用同一方法进行运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗蛋白质实验。利用浓度为 0.15至500nm的范围(对于每个浓度，η = 3)。
[0076]分子入坦:使用accelery’ s 发现观测仪(discovery visualizer)v2.5.1.9167 (accelry' s, inc.ca)研究肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素对α v β 3整联蛋白受体的计算机入坞。用胶原iv的非胶原域(pdb#1li1)的晶体结构作为参照，开发肿瘤抑素的同源物模型。使用无铁人类血清运铁蛋白(pdb#2hav)的晶体结构作为参照，开发运铁蛋白用的同源物模型。制备该蛋白质并完成能量最小化。通过用肽键将肿瘤抑素融合到运铁蛋白的c端，建立运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白。为了肿瘤抑素与ανβ3整联蛋白入坞研究，利用肿瘤抑素的同源性模型作为配体，并入坞到ανβ 3整联蛋白的胞外域(pdb#1jv2)的晶体结构上。为了运铁蛋白-肿瘤抑素与ανβ 3整联蛋白入坞研究，使融合蛋白质入坞到α νβ 3整联蛋白受体(pdb#1jv2)。
[0077]凋亡分析:利用deadend色度tunel (tdt介导的dutp缺口末端标记)系统(promega corporation, wi)研究凋亡。将脉络膜内皮细胞(ixlo5个细胞/孔)铺在12孔板中盖玻片上，并容许粘附24小时。24小时后，使细胞暴露于不同浓度的贝伐珠单抗(1、10和ioonm)，肿瘤抑素(100、250和500nm)和运铁蛋白-肿瘤抑素(1、10和ioonm)蛋白质。蛋白质暴露24小时后，然后洗涤细胞，用4%低聚甲醛固定，并利用在磷酸盐缓冲液ph7.4中的0.2 % triton?: x-1oo溶液透化。细胞按照与deadend?色度tunel分析系统一起提供
的标准方案进一步染色。以40倍放大倍数在光学显微镜下研究细胞。
[0078]在踪角j那威大鼠(brown norway rat)矛口月永络膜平载片(natmount)中诱导cnv:
[0079]成年雄性掠色挪威大鼠(150_180g)购自harlan sprague dawley inc.(indianapolis, in, usa)。利用腹膜内注射 40_80mg/ml 氯胺酮和 10_12mg/kg 赛拉嗪(xylazine)混合物麻醉大鼠。如下进行激光烧伤诱导。局部给药1%托批卡胺(tropicamide)溶液使瞳孔放大。将盖玻片放在眼上和2.5%羟丙甲纤维素溶液滴注之后使底部可视化。利用 532nm 二极管激光(oculight glx ；index inc., mountain view, ca,usa)和狭缝灯(zeiss 狭缝灯 30sl ；carl zeiss meditec inc.，dublin, ca, usa)将八个与视神经同心的激光点(100mm，150mw，100ms)放入每个大鼠的右眼中。左眼用作每个动物的对照。通过在“气泡形成(bubble formation) ”终点确定布鲁赫(bruch)氏膜破损。从研究中排除施加激光后显示眼内出血的大鼠。激光烧伤诱导之后，容许cnv损伤发展14天。14天结束时，对大鼠玻璃体内施用下列治疗之一，(a)pbs ph7.4, (b)贝伐珠单抗、(c)肿瘤抑素蛋白质，和(d)运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质。治疗14天结束时,对大鼠实施安乐死,并摘出眼。
[0080]对于脉络膜平载片,利用腹膜内注射80mg/kg氯胺酮和10mg/kg赛拉嗪混合物麻醉大鼠。用10ml pbs (ph7.4)输注大鼠,接着用10ml4%低聚甲醒输注。最后,输注4ml50mg/ml异硫氰酸荧光 素(fitc)-右旋糖酐溶液(2xl06da)。然后，摘出眼，并制备平载片。用nikon ez-cl共聚焦显微镜利用488和568nm激发波长对平载片成像。利用imagej软件获得cnv区域。
[0081]结果
[0082]质粒构律:对分别为5813、6521、8550和7842个碱基对的肿瘤抑素、肿瘤抑素-egfp、运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp和运铁蛋白-肿瘤抑素质粒的1%琼脂糖凝胶拍摄照片(未示出)。对ikb dna梯以大小标记物运行。拍摄肿瘤抑素(28kda)和运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp(135kda)蛋白质的sds凝胶电泳图(未示出)。还拍摄电泳图以得到其插入psectag2b之后肿瘤抑素的碱基对测序结果。利用毛细管电泳(appliedbiosystems, ca)完成测序。在arpe细胞中研究肿瘤抑素-egfp基因表达，并拍摄图像(未示出)。还拍摄了表达肿瘤抑素-egfp蛋白质的arpe细胞的共聚焦显微镜照片(100x)(未示出)。进行dapi染色，以染色细胞核。用没有肿瘤抑素-egfp转染的arpe细胞作为对照，以消除任何背景荧光。
[0083]确定运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质的内在化。暴露于运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质后，在rf/6a细胞中观察到强烈的egfp信号。细胞表面上的任何蛋白质预期都通过酸性缓冲液冲洗而除去。这是由于构成细胞膜的脂质磷脂的pka所致。磷酸根基团的最低的pka约为2，说明磷酸根基团不会处于h3po4的不带电状态就是在ph2带有单个负电荷(h2pcv)。在高于约2的ph，具有两个负电荷(ηρ04_2)的机率增大。因此，假定egfp信号是只由于内在化蛋白质造成。rf/6a细胞暴露于肿瘤抑素-egfp蛋白质的结果是没有可观察到的内在化。
[0084]运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp融合蛋白的极化分泌:
[0085]用mdck细胞研究运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质的基底外侧分泌。该实验拍摄的图像显示，运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质在该细胞的基底外侧分泌。在共聚焦显微镜下检查基底外侧时，看不到细胞边界。该可能是transwell滤器的多孔属性造成的，它不允许光反射回显微镜，而且还可阻挡到该细胞的光路。这可能是来自滤器基底外侧的细胞缺乏可见性的一个可能的理由。尽管从基底外侧看不到细胞，但dapi染色和来自分泌蛋白质的egfp信号在基底外侧清晰可见。在共聚焦显微镜下研究滤器顶侧时可以清晰观察到细胞。在该细胞基底外侧表面上观察到蛋白质分泌。这种情况至少可以通过两个途径说明。该蛋白质可能结合到该细胞表面的受体，或该蛋白质可能嵌入该滤器中(对于基底外侧分泌的蛋白质)。在基底外侧和顶端培养基中分泌的蛋白质的量化进一步确定运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质的分泌径路。
[0086]对从顶端和基底外侧培养基收集的运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质进行提纯。测定顶端和基底外侧培养基中的蛋白质含量。顶侧培养基包含23.17%，而基底外侧包含76.83%的运铁蛋白-肿瘤抑素-egfp蛋白质。在这两个培养基中分泌的总蛋白认为是100%。从在完成极化mdck细胞研究之后收集的顶端和基底外侧培养基，提纯肿瘤抑素-egfp蛋白质(对照)。该顶端培养基包含68.84%，而基底外侧包含31.16%的肿瘤抑素-egfp蛋白质。这些数据表明，具有运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白可以明显增大融合蛋白质的基底外侧分泌。不存在运铁蛋白时，肿瘤抑素更多在顶例分泌出8.84%)，相比之下，融合蛋白质中存在运铁蛋白时，只有23.17%在顶侧分泌。
[0087]细胞增殖分析:vegf165诱发的细胞增殖被肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的存在抑制。图1表示在肿瘤抑素、运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗蛋白质的作用下的细胞增殖。用mtt分析断定肿瘤抑素(.)，运铁蛋白-肿瘤抑素(λ )和贝伐珠单抗( )在受vegf(50ng/ml)刺激的脉络膜内皮细胞增殖上的抗增生活性。用mtt试剂治疗之后，利用uv-vis分光光度计测量吸光度。对于η = 3，数据表示为平均值土s.d.。正如该曲线图所表明的，与只用肿瘤抑素对比时，运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质在减少细胞增殖上高度有效。求出运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的ic5tl为5.97ημ。对于只用肿瘤抑素蛋白质，求出为185.7ημ。还对贝伐珠单抗测试对细胞增殖的抑制，并且发现其效能为ic5tl为
7.78ημ。
[0088]在抑制细胞增殖上，运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质比贝伐珠单抗更有效。与贝伐珠单抗相比，运铁蛋白-肿瘤抑素还能抑制数目更多的细胞，高于该蛋白质的ic5(l。在15.6nm的浓度，运铁蛋白-肿瘤抑素抑制作用差不多是84%，而贝伐珠单抗的抑制作用约为63%。
[0089]管形成分析:在肿瘤抑素、运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗的不同浓度下，拍摄管形成的代表性图像(未示出)。看来，管形成随着肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的浓度增大而减少。肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质两者都能抑制管形成，而在贝伐珠单抗的作用下对管形成没有明显的抑制作用。在利用运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白进行的管形成分析中，在125nm浓度下观察到基本上完全阻止管形成。图2表示所有三种测试蛋白质的s形曲线拟合图。18小时之后估算管形成。对于η = 3，数据表示为平均值土 s.d.。
[0090]侵入分析:侵入分析模拟体内基底膜，而细胞趋向于向诸如vegf等化学引诱物迁移。图像表明，在肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的作用下，侵入细胞的数目减少。随着肿瘤抑素蛋白质的浓度在该养基中增加，观察到侵入基质胶侵入室的细胞数目明显减少。还拍摄在肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素的作用下侵入膜的细胞图像(未示出)。用vegf(10ng/ml)作为化学引诱物，而且其表明在不存在肿瘤抑素或运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的情况下，膜的侵入相当严重。然而，vegf在诱导膜侵入中的作用在这两种蛋白质之任一种存在的情况下是降低的，尽管vegf存在。这表明，甚至在存在诸如vegf等刺激物的情况下，肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质在减少细胞迁移和侵入上的效能。
[0091]与只用肿瘤抑素蛋白质相比，运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质显著减少侵入。在15和125nm(p<0.05)的浓度，运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质的作用显著地不同于肿瘤抑素。然而，在250和500nm的较高浓度下，该差异基本上不显著。这表明，侵入倾向是饱和的(细胞不再是侵入性的，并且被吸引到vegf)，而在在更高的浓度不影响进一步侵入。该作用不同于在利用这两种蛋白质研究的细胞增殖和管形成中观察到的。与运铁蛋白-肿瘤抑素的
12.14nm相比，贝伐珠单抗呈现8.0nm的较低ic5tl值，并表明在细胞侵入中vegf的重要作用。
[0092]分子入坞:对入坞到αυβ 3整联蛋白受体的肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素用计算机产生分子模型。这两种不同入坞蛋白质的能量值表明，运铁蛋白-肿瘤抑素的入坞(相互作用能量为-130.43kcal/mol)在能量上比单独的肿瘤抑素入坞(相互作用能量为-113.28kcal/mol)更有利。
[0093]凋亡分析:拍摄了在肿瘤抑素、运铁蛋白-肿瘤抑素和贝伐珠单抗的作用下呈现凋亡的细胞的代表性图像(未示出)。在测试的所有三个浓度(分别为100、250和500nm和1、10和ioonm)，肿瘤抑素和运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质在脉络膜内皮细胞中诱导凋亡。贝伐珠单抗(1、10和ioonm浓度)没有诱生明显的凋亡，而且类似于在对照pbs中观察到的情况。 [0094]在棕色挪威大鼠和脉络膜平载片中诱导cnv:
[0095]发现运铁蛋白-肿瘤抑素在减少激光诱发的cnv损伤面积上比贝伐珠单抗和肿瘤抑素更有效(图3)。在脉络膜平载片中处理14天结束时，量化cnv损伤大小。cnv损伤
大小的定量比较示于图3 (*表示与用肿瘤抑素治疗对比时p < 0.05。1"表示与贝伐珠单抗对比时p <0.05。对于每一组中η = 42-48个损伤，数据表示为平均值土s.d.)。运铁蛋白-肿瘤抑素治疗的大鼠，与贝伐珠单抗和肿瘤抑素治疗的大鼠相比，损伤大小显著降低。
[0096]讨论
[0097]本发明的某些方面提供重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。本发明的重组蛋白(具体地说，运铁蛋白-肿瘤抑素重组(例如融合)蛋白)具有增强的与ανβ3整联蛋白的结合，并相对于单独的肿瘤抑素分别以高21、25和31倍的活性抑制内皮细胞增殖、迁移和管形成。另外，已经表明，在抑制脉络膜内皮细胞增殖和管形成方面，运铁蛋白-肿瘤抑素比贝伐珠单抗更有效。此外，运铁蛋白-肿瘤抑素重组蛋白对于在体内抑制cnv比只用运铁蛋白显示更高的效能。本发明其他方面提供能够产生重组蛋白的质粒表达系统，所述重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白(亦即，运铁蛋白-肿瘤抑素融合蛋白)。在某些实施方案中，本发明的质粒表达系统允许该蛋白质向汇合细胞单层的基底外侧优先分泌。
[0098]实验表明，运铁蛋白-肿瘤抑素的重组蛋白以分别比肿瘤抑素(ic5tl为185.7ημ)和贝伐珠单抗(ic5tl为7.78ημ))大31倍和1.3倍的效力抑制内皮细胞增殖(ic5tl为5.97nm)。不受任何理论束缚，据信运铁蛋白-肿瘤抑素比肿瘤抑素效能大31倍和比贝伐珠单抗活性好1.3倍是两个可能机制的结果。首先，据信，运铁蛋白改善肿瘤抑素至α νβ 3整联蛋白受体的结合效力。利用计算机建模，本发明人已经确定，运铁蛋白与ανβ3整联蛋白具有结合相互作用。计算机建模还显示，该融合蛋白比只用肿瘤抑素呈现更好的相互作用能量(-130.43kcal/mol对-113.28kcal/mol)。重组蛋白运铁蛋白-肿瘤抑素的改善活性的第二个可能的机制据信是融合蛋白质的内在化。观察到运铁蛋白-肿瘤抑素被脉络膜内皮细胞内在化。对于肿瘤抑素，该内在化不明显。
[0099]有可能运铁蛋白-肿瘤抑素也可以通过只在内在化之后被激活的路径起作用。诸如内皮他丁(endostatin)和血管他丁(angiostatin)等其他内源抗血管生成蛋白已经表现出与包含rgd的蛋白质诸如纤连蛋白和玻璃体结合蛋白(vitronectin)形成复合物。复合物形成对于这些抗血管生成蛋白的活性是重要的，而且发现这些蛋白质在缺乏纤连蛋白或玻璃体结合蛋白的小鼠中无活性。纤连蛋白由内皮细胞大量(约3.0 μ g/105个细胞/天)分泌，而且一旦内在化，包含r⑶的蛋白质诸如纤连蛋白在细胞的胞质中的积累导致凋亡。因而，有可能运铁蛋白融合至肿瘤抑素会增大包含rgd的蛋白质诸如纤连蛋白的胞质含量，以此诱导细胞凋亡。对于肿瘤抑素，这种可能性不明显，因为在实试验中它未显示出任何内在化的迹象。对于肿瘤抑素，其与ανβ 3整联蛋白的结合据信是作用的主机制。
[0100]再一次不受任何理论束缚，据信与单独的肿瘤抑素类似，运铁蛋白-肿瘤抑素的重组蛋白通过抑制蛋白质合成并诱导凋亡来抑制细胞增殖。本发明人已经观察到重组运铁蛋白-肿瘤抑素蛋白质比单独的肿瘤抑素更大的抗凋亡活性。贝伐珠单抗在脉络膜内皮细胞内没有施加任何观察到的凋亡活性。先前已有报告指出，对于贝伐珠单抗在角膜内皮细胞、视网膜神经节细胞和视网膜-rpe-脉络膜培养物中缺乏凋亡活性。
[0101]实验表明，运铁蛋白-肿瘤抑素的重组蛋白以比单独肿瘤抑素多25倍的效力抑制脉络膜内皮细胞中的管形成。据信，运铁蛋白-肿瘤抑素重组蛋白的内在化导致运铁蛋白-肿瘤抑素和纤连蛋白的复合物，它可能更强烈地结合至其他活化的内皮细胞并阻止管形成。贝伐珠单抗对脉络膜内皮细胞中的管形成未显示出任何显著的抑制作用。一般相信，管形成在胶原iv，viii，xv，xviii和层粘连蛋白8和10 (其存在于基底膜中)的作用下发生。这些组分往往促进内皮细胞的稳定性、粘着和迁移。诸如vegf等生长因子也存在于基底膜基质中。然而，vegf看来在管形成中不起重要的作用，因为管形成甚至在存在贝伐珠单抗的情况下也高效率发生，已知贝伐珠单抗通过中和胞外基质中的vegf而起作用。
[0102]据信，在血管发生的过程中，基底膜降解后，内皮细胞迁移到临时的基底膜样基质上。已知vegf在内皮细胞的迁移中起重要的作用，而且本发明人已经利用一个boyden室细胞迁移分析研究了该过程。该分析的目的之一是评定vegf对内皮细胞侵入基底膜的影响，所述内皮细胞进一步将形成血管。在10ng/ml vegf的作用下,使用重组蛋白运铁蛋白-肿瘤抑素时，比只用肿瘤抑素时，细胞迁移显著地降低。已经表明，肿瘤抑素抑制成簇粘附激酶(focal adhesion kinase, fak)磷酸化。缺乏fak激活最后导致对细胞迁移的抑制作用。据信，重组蛋白运铁蛋白-肿瘤抑素施加类似的影响，尽管以更大的程度。
[0103]将运铁蛋白融合到肿瘤抑素的另一个主要优点是，该融合蛋白质的优先基底外侧分泌。差不多75%的重组蛋白运铁蛋白-肿瘤抑素向细胞的基底外侧分泌，相比之下仅用肿瘤抑素蛋白质只有约35%。这提供在玻璃体内递药后具有靶向增生的脉络膜内皮细胞的能力的重组蛋白运铁蛋白-肿瘤抑素。玻璃体内递送治疗剂之后，rpe细胞由于这些细胞的紧密连接属性而充当治疗剂进一步移动的屏障。运铁蛋白-肿瘤抑素依靠其基底外侧分泌属性，比肿瘤抑素或贝伐珠单抗有利。玻璃体内施用的运铁蛋白-肿瘤抑素向脉络膜内皮细胞且在疾病部位附近放置肿瘤抑素。
[0104]体内研究表明，运铁蛋白-肿瘤抑素在抑制脉络膜新血管化上效能较高。与用贝伐珠单抗或肿瘤抑素治疗的大鼠对比，用运铁蛋白-肿瘤抑素治疗的bn大鼠眼中的损伤大小显著更低。
[0105]这些结果表明，运铁蛋白-肿瘤抑素是一种比贝伐珠单抗好的治疗剂，因为除别的以外，(a)运铁蛋白-肿瘤抑素是一种比贝伐珠单抗好的细胞增殖抑制剂，(b)运铁蛋白-肿瘤抑素导致脉络膜内皮细胞凋亡，这是贝伐珠单抗所缺乏的，(c)运铁蛋白-肿瘤抑素抑制管形成，而贝伐珠单抗在抑制管形成上不起作用。与只用肿瘤抑素相比，在用以评定新血管化的全部体外分析中，运铁蛋白-肿瘤抑素施加>=20倍的效力。更显著地，与贝伐珠单抗和肿瘤抑素对比，运铁蛋白-肿瘤抑素在体内减少激光诱发的cnv上更有效。
[0106]实施例2
[0107]tf-t蛋白的牛产和提纯:用以构造质粒的psectag2b载体具有六组氨酸标签，它有助于在该培养基中分泌的蛋白质的提纯。将arpe细胞(第24次传代)在12孔板中培养，直到80%汇合。扩增的tf-t (运铁蛋白-肿瘤抑素)质粒(在psectag2b载体中克隆)在dmem/f12培养基中稀释，并与lipofectamine式剂混合。该质粒和lipofectamine复合物加到每个包含细胞和培养基的孔中。通过往返摇动孔，温和地搅拌复合物。细胞在37°c在5% co2的培养箱中孵育24小时。24小时结束时，收集培养基并提纯。用talon?.盒属亲和树脂提纯融合蛋白。从细胞收集的培养基与树脂混合，并在室温温和地搅动孵育20分钟。利用50mm磷酸钠、300mm氯化钠和150mm咪唑的水溶液(ph7.0)洗脱结合到树脂的蛋白质。随后，通过针对没有咪唑的类似缓冲液渗析(利用2000mwc0透析包)从该蛋白质溶液清除咪唑。bca?蛋白质分析试剂盒用来估计蛋白质含量。如上所述，对三个单独的批进行提纯，并利用sds凝胶电泳(page)，荧光分光术和圆二色性，评定再现性。
[0108]为了进行凝胶电泳，将5μ g蛋白质与4倍加载染料混合并煮沸5分钟。样本在4-20 %梯度sds-page凝胶(bio-rad，hercules, ca)上运行。使用远-uv光谱区域(190-250nm)中圆二色性(⑶)来研究tf-t和肿瘤抑素二级结构。在aviv62型ds分光旋光计(aviv biomedical，inc.，nj)上获得⑶光谱。蛋白质容液转移进imm路径长度石英室，并放入恒温皿架(cell holder)。利用2nm带宽以0.25nm间隔收集数据。在5mm磷酸盐缓冲液ph7.4中制备100m肿瘤抑素和tf-t溶液。通过在280nm激发蛋白质完成荧光光谱学。从300_400nm波长收集放射光谱。在spectramax m5微板读板仪(moleculardevices,llc)上进行实验。
[0109]肿瘤抑素和tf-t蛋白的表征:利用sds凝胶电泳(page)、大小排阻层析(sec)、圆二色性和动态光散射进行tf-t的表征。为了进行凝胶电泳，把5 μ g蛋白质与4倍装入染料混合并煮沸5分钟。样本在4-20%梯度sds-page凝胶(bio-rad, hercules, ca)上运行。利用agilent sec-3柱(1.d.7.8mm和长度300mm)进行sec。注入样本流速为iml/分钟。注入的样品体积为25 μ i。sec用的流动相是磷酸盐缓冲盐水(pbs)ρη7.4。
[0110] 使用在远-uv光谱区域的⑶来研究tf-t和肿瘤抑素二级结构。在aviv62型ds分光旋光计(aviv biomedical，inc.，nj)上获得⑶光谱。蛋白质溶液转移到imm通道长度石英室并放入恒温皿架中。利用2nm带宽以0.25nm间隔收集数据。用malvern纳米分级器(nanosizer)估算lmg/ml肿瘤抑素和tf-t溶液的颗粒大小。
[0111]肿瘤抑素和tf-t融合蛋白的分泌:为了进行蛋白质分泌研究，选择rpe细胞单层，以估算tf-t的分泌样式。首先，对细胞表征其电阻、紧密连接形成和核染色样式。将rpe细胞铺在 transwell 滤器上，并利用evom? 电阻计(worldprecision instruments, ca)测量跨上皮电阻(teer)。当teer > 200 ω.cm2时，还用zo-1染色确定紧密连接形成。在室温加入10%甲醛(0.5ml在顶侧和1.5ml在基底外侧)，将带有teer > 200 ω.cm2的细胞的滤器固定30分钟。通过加入包含5%山羊血清的0.1% trioton xloo (0.5ml在顶侧)于室温对细胞进一步透化i小时。将稀释至1:100稀释液的zol —抗(0.5ml在顶侧)加到细胞上并在室温孵育i小时。将经fitc标记的二抗(0.5ml在顶侧)(稀释至1:100稀释液)加到细胞上并在室温孵育i小时。细胞用sμg/ml dapi (4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)孵育5分钟，以染色细胞核。用锋利的刀片切出滤器，并转移到玻璃载玻片上，通过加入supermount封固介质(biogenex, ca)固定,并在共聚焦显微镜下目测。
[0112]为了估算分泌样式，细胞用200 μ g肿瘤抑素或tf-t蛋白质在顶侧孵育。转染24小时之后，从基底外侧和顶侧单独收集培养基，并利用talon金属亲和树脂提纯。利用bca?.蛋白质分析试剂盒量化肿瘤抑素和tf-t蛋白质。
[0113]tf-t蛋白质的稳定性:对tf-t蛋白质评定其在(a)ph4.0和8.0缓冲液中，(b)三(羟甲基)氨基甲烷 (tris)和磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(ph7.0)，和(c)范围为iomm至250mm氯化钠的离子强度(ph7.0)中的稳定性。蛋白质溶液暴露于上述条件48小时，并利用圆二色性和荧光光谱学评定稳定性。在圆二色性和荧光光谱学外用sds page评定ph稳定性。
[0114]在cnv i秀发的棕色挪威大鼠中的早期时间点效能研究:
[0115]成年雄性掠色挪威(bn)大鼠(150_180gm)购自harlan sprague dawley inc.(indianapolis, in, usa)。利用腹膜内注射40-80mg/ml氯胺酮和10_12mg/kg赛拉嗪混合物麻醉大鼠。正如在实施例1所描述，进行激光烧伤的诱导。激光烧伤诱导后，容许cnv损伤发展7天。7天结束时，对大鼠玻璃体内施用以下治疗之一，(a)pbs ph7.4，(b)贝伐珠单抗或(c)tf-t蛋白质。利用荧光素血管造影术监测治疗之前和之后cnv损伤的发展。为了进行荧光素血管造影术，麻醉大鼠，用局部给药i %托吡卡胺溶液使瞳孔放大，并通过尾静脉给大鼠施用200 μ 11%突光素钠。利用genesis df底部照相机(kowa optimed inc, ca)立即监测自损伤的泄漏。利用imagej软件获得cnv区域。
[0116]结果
[0117]tf-t蛋白质的牛产和提钝:在制各和测试的三枇tf-t中得到iookdatf-t蛋白质的单一条带。用所描述的方法产生的tf-t具有类似的荧光和圆二色性谱。
[0118]肿瘤抑素和tf-t蛋白质的表征:sds page中iookda和28kda的单一条带和在sec的单峰显示tf-t和肿瘤抑素的纯度。tf-t的颗粒大小为8.0nm,多分散性指数(polydispersity index, pdi)为 0.414。肿瘤抑素的颗粒大小为 3.9mn，pdi 为 0.359。tf-t圆二色性谱的⑶扫描表明，tf-t具有大多数β -片层和转角(约60% )，也伴有α -螺环(约32%)的存在。肿瘤抑素的结构也富含β片层和转角(约50%)。然而，肿瘤抑素具有较少的α-螺环(约16%)，并具有较多的无规卷曲结构(约40%)。因此，对于这两种蛋白质，圆二色性谱是不同的。
[0119]tf-t融合蛋白质的分泌:在transwell滤器上培养4周时，rpe细胞形成紧密连接。通过zo-1蛋白质染色也确定紧密连接形成。rpe细胞显示清楚的zo-1染色样式，并勾勒出单层内rpe细胞的均匀的多边形状。继蛋白质顶端暴露之后，rpe细胞向基底外侧分泌126.8 μ g/ml的tf-t蛋白质。相反,仅12.3 μ g/ml中瘤抑素向基底外侧分泌。
[0120]tf-t蛋白质的稳定件:发现tf-t在ρη7.0最稳定。sds page表明，与对照tf-t相比，在ph4-6条带强度降低，这指示蛋白质降解。另外，荧光和圆二色性表明，除ph7.0外在所有ph值信号都减弱。因为发现蛋白质在ph7.0最稳定，在ph7.0进行进一步的稳定性研究(离子强度和缓冲液)。
[0121]获得了暴露于磷酸盐柠檬酸盐和tris缓冲液中的nacllomm至250mm的tf-t的荧光和圆二色性谱。tf-t显示，在存在磷酸盐柠檬酸盐缓冲液的情况下，没有离子强度改变的作用。然而，在存在nac1250mm和tris缓冲液的情况下，tf-t信号减弱。因而，磷酸盐柠檬酸盐缓冲液更好地适用于该蛋白质。
[0122]cnv诱导的棕色挪威大鼠中早期时间点效能研究:
[0123]当在早期时间点(cnv诱发后7天)开始治疗时，tf-t治疗的大鼠与贝伐珠单抗治疗的大鼠对比，损伤大小降低。这表明，tf-t作为针对脉络膜新血管化的预防性处理是有效的。
[0124]本发明的上述讨论是为了举例说明和描述的目的呈现的。上述内容不意图将本发明限制于这里公开的 一种或多种形式。尽管本发明的描述包括一个或多个实施方案和某些变型和修改的描述，但是其它变型和修改在本发明的范围内，例如，在了解本公开之后，其在本领域技术人员的技术和知识的范围内。意图以容许的程度获得包括备选实施方案的权利，包括与要求保护的那些交替，可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤，不论此类交替、可互换和/或等同的结构、功能、范围或步骤是否在这里公开，而不意图公开献出任何可专利性的主题。
【权利要求】
1.重组蛋白，其包括连接到肿瘤抑素(tumstatin)的运铁蛋白。
2.权利要求1的重组蛋白，其中运铁蛋白和肿瘤抑素彼此直接连接。
3.权利要求1的重组蛋白，其中运铁蛋白和肿瘤抑素彼此通过接头共价连接。
4.质粒，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。
5.权利要求4的质粒，其中所述编码重组蛋白的核酸序列可操作连接到表达控制序列。
6.重组核酸分子，其包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。
7.权利要求6的重组核酸分子，其中所述核酸序列可操作连接到表达控制序列。
8.重组宿主细胞，其用重组核酸分子转染并且表达该重组核酸分子，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列。
9.一种用于生成包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的方法，所述方法包括: 用重组核酸分子转染重组宿主细胞，所述重组核酸分子包括编码包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的核酸序列； 在足以产生包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白的重组蛋白的条件下，培养转染的宿主细胞；并 将该重组蛋白以基本上纯化的重组蛋白回收。
10.权利要求9的方法，其中所述重组蛋白包括直接连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
11.一种用于治疗受试者中与脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,cnv)有关的临床状况的方法，所述方法包括对需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的重组蛋白，该重组蛋白包括连接到肿瘤抑素的运铁蛋白。
12.权利要求11的方法，其中所述与cnv有关的临床状况包括弹性假黄色瘤(pseudoxanthoma elasticum)、血管样条纹症(angioid streaks)、组织胞衆菌病(histoplasmosis)、点状内层脉络膜病变(punctuate inner choroidopathy)或湿性年龄相关黄斑变性(amd) (wet age related macular degeneration)。
【文档编号】c12n15/63gk103998470sq201280051256
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年8月15日 优先权日:2011年8月17日
【发明者】u·b·科姆佩拉, r·i·沙因曼, p·泰亚吉 申请人:科罗拉多大学董事会法人团体