专利名称：粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医药技术领域的方法，具体的说，是涉及一种粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法。
背景技术：
海龙(syngnathus)为一常用中药材，2005版《中华人民共和国药典》规定为尖海龙syngnathus acus linnaeus、刁海龙solenognathus hardwickii(gray)和拟海龙syngnathoides biaculeatus(bloch)干燥体，用于阳萎遗精、癥瘕积聚、瘰疬痰核、跌扑损伤及痈肿疔疮。除药典收载品种外，粗吻海龙trachyrhamphus serratus(temminck et schlegel)在我国不少地方也常作海龙药用。
经对现有技术的文献检索发现，李士敏等在海龙的体外抗肿瘤活性研究中发现，粗吻海龙经95％乙醇提取，再用石油醚、氯仿、正丁醇萃取，获得的石油醚萃取物经皂化后再用乙醚萃取，回收乙醚得非皂化物，其非皂化物部分具有不同程度的抑制人癌细胞株kb、hela、bcap37、k562、paa细胞的作用，并有明显的量效关系(李士敏，吴筱丹，曾苏，等.海龙体外抗肿瘤活性研究[j].中国中药杂志，2001，26(3)198-201)。目前粗吻海龙仍以全体入药，用于跌打损伤和阳萎遗精的治疗，而用于抗肿瘤和增强免疫的功能没有得到充分研究和开发。近年来动物类中药中活性蛋白和多肽的研究日趋活跃，抗肿瘤蛋白和多肽成为研究开发新热点。由于海洋生物和内陆生物的差异性，来自于海洋动物的蛋白质组分更具有开发和应用价值，目前国际上已有数百个海洋生物多肽和蛋白质进入临床研究。在文献检索中未见用于抗肿瘤和增强免疫的功能相关技术文献的报道，尤其是没有关于粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白质分离方法的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，使其以粗吻海龙为原料，经提取分离制得，具有增强免疫的特点。具体的说是从粗吻海龙中分离纯化了一种分子量在10-100kda的蛋白质，经检测具有抗肿瘤活性，同时有增强免疫的作用。
本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤(1)以粗吻海龙为原料，粉碎后过筛，待用。
(2)在粗吻海龙粗粉中加入4～12倍量的体积百分比为0～90％的乙醇-水溶液，匀浆、低温浸泡，离心后取上清液，即为海龙蛋白粗提液。
(3)将蛋白粗提液于20～60℃减压蒸发浓缩后，与hz-801大孔树脂接触，充分吸附后用蒸馏水洗脱，收集蛋白组分，得到海龙蛋白分离液。
(4)将海龙蛋白分离液减压蒸发浓缩，加入硫酸铵粉末使硫酸铵浓度达到20％-90％饱和度，充分搅拌后4℃静置，离心，收集沉淀，将沉淀用少量tris-hcl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白。
(5)将海龙粗蛋白用ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解后，与凝胶过滤介质接触，用ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kda的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，经体外抗肿瘤活性检测，获得海龙抗肿瘤粗蛋白，蛋白质成分含量达95-100％。
(6)将海龙抗肿瘤粗蛋白用ph 8.4、20mm tris-hcl缓冲液溶解，与离子交换介质接触，梯度nacl缓冲液洗脱，得到数个不同浓度nacl缓冲液的洗脱组分，第四个洗脱峰经透析、浓缩、冻干后即为海龙抗肿瘤活性蛋白。
本发明为了提高蛋白质提取率，采用匀浆搅拌提取方法。提取液与hz-801大孔树脂接触，水洗，可以去除大量甾体、酯类、色素等小分子物质。
本发明获得的海龙抗肿瘤活性蛋白外观为白色粉末，蛋白质含量在99-100％之间，糖含量在0-1％之间。sds-page凝胶电泳显示是单一条带，分子量在10-100kda之间。经体外抗肿瘤活性测试，该蛋白具有良好的抗肿瘤活性，小鼠及人癌细胞株给药剂量在0.1-100μg/ml范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长；小鼠给药剂量在lmg/kg-100mg/kg范围内可抑制动物体内移植肿瘤的生长，同时可以显著改善荷瘤小鼠体征性状。
本发明海龙抗肿瘤活性蛋白可以与传统化疗药物配合组成抗癌复方制剂，包括甲胺蝶呤、5-氟脲嘧啶、顺铂、长春新碱、环磷酰胺、丝裂霉素等。
用本发明制备的活性蛋白质单独或与其它药物联合使用均有抗肿瘤作用，主要用于各种癌症的治疗和辅助治疗，如肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、白血病等，尤其对a-549、bel-7402、hela、lovo、p-388细胞株有较强杀伤作用。
采用lowry法测定蛋白质浓度，用本发明方法制备的海龙抗肿瘤活性蛋白蛋白质含量在99-100％。
本发明采用蛋白质sds-page凝胶电泳测定蛋白质分子量；海龙抗肿瘤活性蛋白质分子量约为55kda。
用本发明方法制备的活性蛋白质与甲胺蝶呤、顺铂联合使用，对人结肠癌细胞株进行抗肿瘤活性体外测试，当甲胺蝶呤浓度为2.5μg/ml时，细胞生长抑制率增加40.3％，当顺铂浓度为0.025μg/ml时，细胞生长抑制率增加70.4％。
具体实施例方式
结合本发明的技术方案提供以下实施例。
实施例1(1)粗吻海龙药材低温烘干，粉碎，过40目筛。
(2)取200g粗吻海龙粉末，加入800ml水溶液，匀浆3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸8小时，4800rpm离心10min，移出上清液，即为海龙蛋白粗提液。
(3)将(2)中获得的海龙蛋白粗提液于40℃减压浓缩至200ml，上hz-801大孔树脂分离柱，用蒸馏水洗脱，收集洗脱组分，40℃减压浓缩至200ml，得海龙蛋白分离液。
(4)在搅拌的同时向海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至20％饱和度，4℃静置过夜使其充分沉淀，10000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀用少量ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白。
(5)海龙粗蛋白用ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取5ml与sephacryl-200(1.6×60cm)凝胶过滤层析柱接触，用含0.2mnacl的缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kda的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，获得海龙抗肿瘤粗蛋白。
(6)海龙抗肿瘤粗蛋白用ph 8.4、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取20ml，与deae-sephadex离子交换介质接触，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0m nacl的20mm tris-hcl ph8.4缓冲液洗脱，收集0.5m nacl的洗脱组分，对纯水透析、peg20000包埋浓缩至原体积的三分之一后冷冻干燥，即得到本发明所述海龙抗肿瘤活性蛋白2.75mg。
采用本发明所得的海龙抗肿瘤活性蛋白经lowry法检测蛋白质含量为99.4％。
采用mtt法测试本发明所得活性蛋白的抗肿瘤活性，当药物浓度为100μg/ml时，海龙抗肿瘤活性蛋白对lovo(人结肠癌细胞株)、a549(人肺癌细胞株)、hela(人宫颈癌细胞株)、ccrf-cem(人白血病细胞株)的抑制率分别为55.8％、69.8％、62.8％和52.7％。
采用动物移植性肿瘤实验法考察海龙抗肿瘤活性蛋白对icr小鼠s180肉瘤的抑制率，当给药剂量为20mg/kg时，小鼠肿瘤抑制率为42.88％。
本发明所得蛋白还具有增强免疫活性通过测定海龙抗肿瘤活性蛋白治疗、5-氟脲嘧啶治疗、不治疗以及正常小鼠的免疫指标，研究本发明所得活性蛋白对荷瘤小鼠免疫的影响。当海龙抗肿瘤活性蛋白给药剂量为10mg/kg时与正常小鼠相比荷瘤小鼠肝重增加30.05％、脾重增加307.14％、胸腺重增加40.0％；白细胞和血小板分别增加451.3％和58.8％；淋巴细胞、单核细胞和中性细胞分别增加370.4％、550.0％和582.3％，表明海龙活性蛋白质能显著提高荷瘤小鼠的免疫力。
实施例2(1)粗吻海龙药材低温烘干，粉碎，过20目筛。
(2)取200g粗吻海龙粉末，加入1400ml 45％乙醇溶液，匀浆3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸6小时，4800rpm离心10min，移出上清液，残渣再次加入1000ml 45％乙醇，同上操作，合并两次提取液即为海龙蛋白粗提液。
(3)将(2)中获得的海龙蛋白粗提液于20℃减压浓缩至300ml，上hz-801大孔树脂分离柱，用蒸馏水洗脱，收集洗脱组分，50℃减压浓缩至250ml，得海龙蛋白分离液。
(4)在搅拌的同时向海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至90％饱和度，4℃静置过夜使其充分沉淀，10000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀用少量ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白。
(5)海龙粗蛋白用ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取5ml与sephacryl-200(1.6×60cm)凝胶过滤层析柱接触，用含0.2mnacl的缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kda的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，获得海龙抗肿瘤粗蛋白。
(6)海龙抗肿瘤粗蛋白用ph 8.4、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取20ml，与deae-sephadex离子交换介质接触，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0m nacl的20mm tris-hcl ph8.4缓冲液洗脱，收集0.5m nacl的洗脱组分，对纯水透析、peg20000包埋浓缩至原体积的三分之一后冷冻干燥，即得到本发明所述海龙抗肿瘤活性蛋白(2.06mg)。
采用本发明所得的海龙抗肿瘤活性蛋白经lowry法检测蛋白质含量为99.0％。
采用本发明所制备的活性蛋白具有显著抗肿瘤作用，当浓度为100μg/ml时，对a549细胞株抑制率为62.8％。
实施例3(1)粗吻海龙药材低温烘干，粉碎，过20目筛。
(2)取200g粗吻海龙粉末，加入1600ml 90％乙醇溶液，匀浆3次，每次30s，于4℃冰箱中冷浸6小时，4800rpm离心10min，移出上清液，即为海龙蛋白粗提液。
(3)将(2)中获得的海龙蛋白粗提液于60℃减压浓缩至300ml，上hz-801大孔树脂分离柱，用蒸馏水洗脱，收集洗脱组分，50℃减压浓缩至250ml，得海龙蛋白分离液。
(4)在搅拌的同时向海龙蛋白分离液中加入硫酸铵粉末至55％饱和度，4℃静置过夜使其充分沉淀，10000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀用少量ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白。
(5)海龙粗蛋白用ph 7.2、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取5ml与sephacryl-200(1.6×60cm)凝胶过滤层析柱接触，用含0.2mnacl的缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kda的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，获得海龙抗肿瘤粗蛋白。
(6)海龙抗肿瘤粗蛋白用ph 8.4、20mm tris-hcl缓冲液溶解，取20ml，与deae-sephadex离子交换介质接触，依次用含0、0.1、0.2、0.5和1.0m nacl的20mm tris-hcl ph8.4缓冲液洗脱，收集0.5m nacl的洗脱组分，对纯水透析、peg20000包埋浓缩至原体积的三分之一后冷冻干燥，即得到本发明所述海龙抗肿瘤活性蛋白1.65mg。
采用本发明所得的海龙抗肿瘤活性蛋白经lowry法检测蛋白质含量为99.7％。
采用本发明所制备的活性蛋白具有显著抗肿瘤作用，当浓度为100μg/ml时，对a549细胞株抑制率为86.8％。
权利要求
1.一种粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)以粗吻海龙为原料，粉碎后过筛，待用；(2)在粗吻海龙粗粉中加入4～12倍量的乙醇-水溶液，匀浆、低温浸泡，离心后取上清液，即为海龙蛋白粗提液；(3)将蛋白粗提液减压蒸发浓缩后，与大孔树脂接触，充分吸附后依次用蒸馏水洗脱，收集蛋白组分，得到海龙蛋白分离液；(4)将海龙蛋白分离液减压蒸发浓缩，加入硫酸铵粉末，充分搅拌后4℃静置，离心，收集沉淀，将沉淀用少量tris-hcl缓冲液溶解后透析、浓缩、冷冻干燥，即得到海龙粗蛋白；(5)将海龙粗蛋白用tris-hcl缓冲液溶解后，与凝胶过滤介质接触，用tris-hcl缓冲液洗脱，收集分子量在10-100kda的蛋白质洗脱液，透析、浓缩、冷冻干燥后，经体外抗肿瘤活性检测，获得海龙抗肿瘤粗蛋白，蛋白质成分含量达95-100％；(6)将海龙抗肿瘤粗蛋白用tris-hcl缓冲液溶解，与离子交换介质接触，梯度nacl缓冲液洗脱，得到数个不同浓度nacl缓冲液的洗脱组分，第四个洗脱峰经透析、浓缩、冻干后即为海龙抗肿瘤活性蛋白，获得蛋白质含量在99--100％之间，糖含量在0-1％之间的白色粉末。
2.根据权利要求1所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的步骤(2)中，乙醇-水溶液的体积百分比为0～90％。
3.根据权利要求1或者2所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的步骤(2)中，低温浸泡，是指浸泡时置于4℃冰箱中。
4.根据权利要求1所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的步骤(3)中，蛋白粗提液减压蒸发浓缩是在20～60℃条件下，然后与hz-801大孔树脂接触。
5.根据权利要求1所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的步骤(4)中，加入硫酸铵粉末使硫酸铵浓度达到20％-90％饱和度。
6.根据权利要求1所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的(4)和(5)中，tris-hcl缓冲液，是指ph7.2、20mm tris-hcl缓冲液。
7.根据权利要求1所述的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，其特征是，所述的(6)，tris-hcl缓冲液，是指ph8.4、20mm tris-hcl缓冲液。
全文摘要
一种医药技术领域的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白的制备方法，步骤为(1)以粗吻海龙为原料，粉碎后过筛；(2)在粗吻海龙粗粉中加入4～12倍量的乙醇－水溶液，制取海龙蛋白粗提液；(3)将蛋白粗提液减压蒸发浓缩后，与大孔树脂接触，制取海龙蛋白分离液；(4)将海龙蛋白分离液减压蒸发浓缩，加入硫酸铵粉末，将沉淀用tris－hcl缓冲液溶解，得到海龙粗蛋白；(5)将海龙粗蛋白用tris－hcl缓冲液溶解后，与凝胶过滤介质接触，获得海龙抗肿瘤粗蛋白；(6)将海龙抗肿瘤粗蛋白用tris－hcl缓冲液溶解，与离子交换介质接触，梯度nacl缓冲液洗脱获得。本发明制得的粗吻海龙抗肿瘤活性蛋白，纯度高，经检测具有抗肿瘤活性，同时有增强免疫的作用。
文档编号c07k14/435gk1793168sq20051011223
公开日2006年6月28日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者李晓波, 张朝晖, 秦孙星, 王威, 王梦月 申请人:上海交通大学