专利名称：肿瘤抑制蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合并调节诸如p53的肿瘤抑制蛋白活性的蛋白；编码所述蛋白的核酸分子和调节所述多肽对其靶多肽的结合活性的筛选方法。
肿瘤抑制基因编码能抑制细胞生长或分裂的蛋白质，因此对于维持正常细胞的增殖、生长和分化很重要。肿瘤抑制基因中的突变产生了异常细胞周期过程，由此，例如当dna被破坏时，停止细胞周期的正常细胞周期检测点被忽视，并且损害的细胞不可控制地分裂。肿瘤抑制基因的产物在细胞的所有部分起作用(例如细胞表面、细胞质、细胞核)，以防止已被损害的细胞通过细胞周期途径(即，g1、s、g2、m和细胞质分裂)。一些肿瘤抑制基因已被分离并测序。这些包括视网膜神经胶质瘤基因(rb)、与诸如骨癌(骨肉瘤)、膀胱癌、小细胞肺癌和乳腺癌，以及视网膜神经胶质瘤有关的突变。wilms肿瘤1基因(wt-1)，与肾癌和神经纤维瘤有关的突变。
可论证地，已经成为最热门研究课题的肿瘤抑制基因是p53。p53编码了作为转录因子发挥作用并且是细胞分裂周期的关键调节剂的蛋白质。在1978年(lane与crawford，1979)发现它作为蛋白质显示亲和性地与sv40大t抗原结合。p53基因编码了具有53kda的393个氨基酸多肽。p53的最重要的肿瘤抑制功能之一是它能够诱导细胞凋亡。细胞凋亡或程序性细胞死亡，是一种多细胞有机体调节细胞数量和分化的过程。该过程通过诱导或者阻止细胞凋亡的因子进行调节。细胞凋亡的诱导剂包括bcl-2家族成员、caspase(半胱天冬酶)家族成员以及他们有关联的因子apaf-1和fadd。caspase作为酶原被合成，并通过蛋白裂解来活化。然后活化的caspase诱导许多与细胞凋亡有关的形态学和生物化学的变化。
线粒体通过释放诸如细胞色素c、aif和diablo的促凋亡因子在活化过程中起到关键作用。bcl-2蛋白家族控制其从线粒体的释放(例如，bcl-2和bcl-x1抑制释放；bax和bak诱导释放)。
国际公开wo2/12325所描述的称为iaspp的多肽是参与细胞凋亡调节试剂的另一个例子。
我们描述了变体iaspp多肽，其具有区别于国际公开wo2/12325中公开的多肽的特征。与iaspp比较，该称为iaspp6c的多肽在它的氨基末端延长并优先结合到p53上。当与wo2/12325中公开的较短的版本比较时，iaspp c6优先结合p53。该较短的版本优先结合细胞凋亡诱导蛋白bcl 2。
iaspp c6是可能在体内控制iaspp c6代谢(turnover)的泛素化的多肽。泛素是在种属间高度保存的76个氨基酸所组成的小蛋白。泛素具有的最重要的功能是调节蛋白质代谢。近几年的研究已经鉴别了参与泛素诱导的蛋白质水解的许多附属蛋白质。第一步是将泛素连接到欲降解的被指定的靶蛋白质。这一步由三种被称为e1、e2和e3的蛋白质来介导。泛素通过e1活化酶首先被活化，该e1活化酶是通过硫酯键连接到泛素的两个相同的105kda亚基所组成的同型二聚体。活化后是e1泛素轭合物被e2(被称为载体蛋白质)转运。e2蛋白质在大小上明显地不同但有一些保守元件。e2蛋白质从e1接受了泛素并再次通过硫酯键形成第二复合物。e3蛋白质可参与或不参与最后的步骤，该步骤是将泛素转换成蛋白底物。随后被降解该泛素化蛋白质的蛋白酶识别。该蛋白酶可以是被称为蛋白体的部分结构，所述蛋白体是蛋白酶和有关协同因子的大型多亚基复合物。在一些实例中，蛋白质可以被聚泛素化，是由被连接到泛素蛋白的泛素蛋白产生的，该泛素蛋白已经连接到靶蛋白质。
根据本发明的一个方面，提供了分离的多肽或变体多肽，其中所述多肽由
图1a所示的氨基酸序列表示，其变体是通过至少一个氨基酸残基的添加、删除和取代而修饰的，其特征是所述多肽具有下列特征i)当与由图2a所示氨基酸序列所表示的多肽比较时，优先结合肿瘤抑制多肽p53以抑制p53的促凋亡活性的多肽或其变体；ii)包括至少一个氨基酸残基被泛素化的多肽；和
iii)包含氨基末端多肽结构域的多肽，其中所述结构域由图1a所示的氨基酸1-483的氨基酸序列所表示。
在本发明优选的实施方式中，当与图2a所示的氨基酸序列代表的多肽比较时，所述多肽优先结合p53。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述多肽被至少一个氨基酸残基的添加、缺失或取代所修饰，其中，所述修饰在图1a所表示的氨基酸序列的氨基酸残基 1至 483。
确定本文所公开的多肽的结合的分析，例如，本领域已知的和本申请所描述的p53。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述多肽包含图1a所示的氨基酸序列。优选的所述多肽由图1a所示的氨基酸序列所组成。
根据本发明的一个方面，本发明提供了分离的核酸分子，其中所述核酸分子编码本发明的多肽。
在本发明进一步优选的实施方式中，本发明所述核酸分子由图1b所示的核酸序列所表示，或者是在严格的杂交条件下与图1b所示的序列杂交并编码本发明多肽的核酸分子。
在本发明优选的实施方式中，所述核酸分子由图1b所示的核酸序列组成。
在本发明进一步优选的实施方式中，所示分离的核酸分子是cdna。在本发明可选择的优选实施方式中所述核酸分子是基因组dna。
根据本发明的另一个方面，本发明提供了包含本发明核酸分子的载体。优选所述载体是适合于所述多肽的重组表达的表达载体。
优选地，所述载体适合于原核基因表达。在本发明可选择的实施方式中，所述载体适合于真核基因表达。
作为实例但不作为限制的方式，通常所述的适应包括介导细胞/组织特异表达的转录控制序列(启动子序列)的提供。这些启动子序列可以是细胞/组织特异的、可诱导的或组成型的。
启动子是本领域认可的术语并包括例如但不受限制的以下特征。增强子元件是经常在基因的转录起始位点5’发现的(增强子也可在基因序列3’端或者甚至位于内含子序列并因此其位置有独立性)的顺式(cis)作用核酸序列。增强子的功能是增加其连接的基因的转录率。增强子活性是对反式作用转录因子(多肽)的反应，该因子已显示出特异结合到启动子元件。转录因子的结合/活性(请看圣地亚哥academicpress有限公司david s latchman的“真核转录因子”(eukaryotictranscription factors))是对许多环境的信号作出的反应，所述信号包括，例如但不限于中间代谢产物或环境作用因子，例如温度。
启动子元件也包括起到选择转录起始位点作用的所谓的tata框和rna聚合酶起始选择(ris)序列。这些序列也结合多肽，该多肽起到通过rna聚合酶的选择尤其促进转录起始的作用。适应性也包括提供在真核细胞或原核宿主内都可促进所述载体维持的选择标志和自我复制序列。自我维持的载体指的是游离基因的载体。由于这些分子可以结合大dna片段(30-50kb dna)，因此游离基因的载体是理想的。这类游离基因的载体公开在wo98/07876。
促进载体编码基因表达的适应性包括提供转录末端/聚腺苷酸化序列的基因。这也包括提供内部核糖体进入位点(ires)，其起到了最大化排列在双顺反子或多顺反子表达盒中的载体编码基因表达的作用。
这些适应性是本领域所公知的。一般地，有大量的关于表达载体构建和重组dna技术的公开文献。请参见，sambrook等人(1989)的分子克隆实验室手册(molecular cloninga laboratory manual)、coldspring harbour laboratory、cold spring harbour、ny及其中的参考文献；marston，f(1987)dna克隆英国牛津大学irl出版社a practicalapproach卷iii；dna克隆john wiley & sons公司(1994)f m ausubel等人，现代分子生物学的方法(current protocols in molecular biology)。
根据本发明的第四方面，提供了产生本发明所述多肽的方法，包括i)提供用本发明核酸分子转化/转染的细胞；ii)在有助于制备所述多肽的条件下培养所述细胞；以及i)从所述细胞或其生长环境中纯化所述多肽。
在本发明优选的实施方式中本发明所述核酸分子是本发明的载体。
在本发明优选的方法中，所述载体编码分泌信号以促进所述多肽的纯化，并因此而提供所述重组多肽。
按照本发明的另一方面，本发明提供了结合本发明所述多肽的抗体，其特征是所述抗体结合图1a所示的氨基酸序列的氨基酸残基 1至 483的所述多肽。
优选地所述抗体不结合图1a所示的氨基酸序列的序列 484至 828所代表的所述多肽。
抗体，也被称作免疫球蛋白，是对外来分子(抗原)通常具有特异性的蛋白分子。免疫球蛋白是一种由两对多肽链、一对轻(l)(低分子量)链(κ或λ)和一对重(h)链(γ、α、μ、δ和∈)所组成的结构上相关的蛋白质，所有这四种链都通过二硫键结合在一起。h和l链都具有对结合抗原起作用并从一个ig分子到另一个ig分子之间高度可变的区域。另外，h和l链包含非可变或恒定区域。
l链由两个结构域组成。在指定的类型的l链之中，羧基末端结构域基本上是相同的，并称为“恒定”(c)区。在l与l链之间，氨基末端结构域是可变的并是该抗体的结合位点。因为其可变性，该区被称为“可变”(v)区。
ig分子的h链有几类，α、μ、σ、α和γ(其又可分为几种亚类)。装配好的ig分子由两种相同的h和l链的一种或多种单位组成，并根据其具有的h链来命名。因此，有五种ig同种型(isotypes)iga，igm，igd，ige和igg(根据h链的“恒定”区的不同，其还有四种亚型，即igg1，igg2，igg3和igg4)。有关抗体结构及其不同功能的进一步详细的资料可参见，抗体应用实验室手册(using antibodiesa laboratorymanual)，cold spring harbour laboratory press。
在本发明优选实施方式中，所述片段为fab片段。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述抗体选自f(ab′)2，fab，fv和fd片段；且抗体包含cdr3区。
优选地，所述片段是单链抗体可变区(scfv’s)或功能结构域抗体。如果存在产生特异单克隆抗体的杂交瘤，本领域所属技术人员公知，通过rt pcr从所述杂交瘤中提取的mrna中分离scfv’s。可选择地，可用噬菌体展示技术来筛选表达scfv’s的克隆。功能结构域抗体是抗体的最小结合部分(大约13kda)。这种技术的例子如专利us6,248,516、us6,291,158、us6,127,197和ep0368684中的公开，本文将其全部引入用作参考。
修饰抗体、或抗体变体以及参考抗体，可通过一种或多种替代、添加、缺失、平截以及其任意的组合使氨基酸序列不同。优选的变体是通过保守氨基酸替代而不同于参考多肽的变体。这种替代是通过类似特性的另一种氨基酸替代指定氨基酸。以下非限制列出的氨基酸可考虑进行保守的替代(相似)a)丙氨酸，丝氨酸，和苏氨酸；b)谷氨酸和天冬氨酸；c)天冬酰胺和谷氨酰胺；d)精氨酸和赖氨酸；e)异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和缬氨酸，及f)苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。最高优选的是显示增强生物活性的变体。
优选地所述抗体是人源化或嵌合抗体。
通过重组方法来产生嵌合抗体，从而含有抗体的可变区以及人抗体的不变或恒定区。
通过重组的方法来产生人源化抗体，从而将抗体的互补决定区(cdrs)与人抗体的恒定(c)区和可变(v)区的框架区结合。
嵌合抗体是重组抗体，其中小鼠或大鼠抗体的所有v区与人抗体的c区结合。人源化抗体是重组的杂交抗体，其将来自啮齿动物抗体v区的所述的互补决定区与来自人抗体v区的框架区融合。同时也使用来自人抗体的c区。该互补决定区(cdrs)处于该抗体的重链和轻链的n末端功能结构域，在此限定v区变异的大部分。这些区域形成该抗体分子表面的环。这些环提供了抗体与抗原间的结合表面。
来自非人类的抗体激发对外来抗体的免疫反应并从循环中去除该抗体。来自非人类的抗体激发对外来抗体的免疫反应并从循环重去除该抗体。当注射到人个体时，嵌合和人源化抗体均具有降低的免疫原性，因为在重组杂交抗体中啮齿动物(即外来)抗体量减少，而人抗体区并不产生免疫反应。这导致对该抗体的较弱的免疫反应和降低的清除率。当利用治疗性抗体治疗人类疾病时，这是非常需要的。可将人源化抗体设计成具有更少的“外来”抗体区域并由此设想比嵌合抗体具有更少的免疫原性。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用作药物的多肽。
根据本发明的另一方面，本发明提供了用作药物的核酸。
在本发明优选的实施方式中，所述药物还含有稀释剂、载体或赋形剂。
当给药时，本发明的治疗组合物可以药物可接受的制剂形式来给药。这种制剂通常包括药物可接受的盐浓缩物，缓冲剂、防腐剂、匹配的载体、诸如佐剂和细胞因子的辅助免疫强化剂、以及任选的诸如化疗剂的其它治疗剂。
本发明的治疗剂可以通过任何常规的途径给药，包括一段时间的注射和逐步的输注。可例如，口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下和透皮给药。当使用抗体进行治疗时，优选的给药途径是肺气雾剂给药。制备含有抗体的气雾剂传输系统的技术是本领域所属技术人员公知的。一般而言，这种系统应使用不显著破坏该抗体生物学特性的组分，例如抗体决定簇结合能力(参见例如，sciarra与cutie，“气雾剂”inremington’s pharmaceutical sciences(雷明顿制药学)，18th edition，1990，pp 1694-1712；引用作为参考)。本领域所属技术人员容易确定制备抗体气雾剂的参数和条件而无需过多的试验。当使用本发明的反义制剂时，优选缓慢的静脉内给药。
本发明的组合物以有效量给药。“有效量”为组合物单独和与另外的剂量一起的产生了所需的反应的组合物量。在治疗具体疾病的情况下，例如癌症，所需的反应是疾病进程的抑制。这可以包括该疾病进程的暂时性减缓，尽管更优选地，其包括永久地阻断该疾病的进程。可通过常规的方法或通过在本文中讨论的本发明的诊断方法来监测该疾病的进程。
当然这种量依赖于治疗的具体疾病状态，该疾病状态的严重程度，个体患者的参数包括年龄、物理状态、身高和体重、治疗的时间、同时治疗的性质(如果有)，给药的特异途径以及健康实践者知识和经验范围内的类似因素。这些因素是本领域所属技术人员公知的，并仅通过常规试验即可得到。通常优选为使用的单独组分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。本领域所属技术人员应理解，虽然出于医疗原因、心理因素或实际中的任何其它原因，患者可坚持较低剂量或耐受剂量。
用在前述方法中的药物组合物优选是无菌的并含有有效量的例如显性阴性iasppc6或者编码显性阴性iasppc6的核酸、从而在适合对患者给药的重量和体积单位中产生所需反应。这些反应可通过例如以下的方式被检测的，例如，通过报告系统确定由所述显性阴性iasppc6组合物抑制的信号转导，测量诸如基因表达的下游作用，或者测量iasppc6组合物的生理学作用，诸如肿瘤的消退、疾病症状的减少、凋亡的调节等等。
根据不同的参数特别是根据给药的方式以及该个体的状态可选择对个体给药的显性阴性iasppc6多肽或核酸的剂量。其它的因素包括治疗所需的时间。如果应用的起始剂量不足以在个体中产生反应，可采用更高的剂量(或利用不同的、更局限的传输途径的有效的更高剂量)来扩展患者的耐受允许。
通常，根据本领域的标准方法，以1ng至约500mg，以及10ng至100mg的剂量配制和给药药物的剂量。当使用编码显性阴性iasppc6的核酸时，根据本领域的标准方法，以1ng至0.1mg的剂量配制和给药。iasppc6组合物给药的其它方案是本领域所属技术人员公知的，其中剂量、给药时间表、注射部位、与前述的有所不同的给药方式(例如，瘤内)等等。对非人的哺乳动物的iasppc6组合物的给药，例如试验目的或兽医治疗目的，以与上述基本相同的条件进行。本文所采用的个体为哺乳动物，优选人，并包括非人的灵长类，牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类。
当给药时，本发明的药物制剂以药物可接受的量并在药物可接受的组合物中使用。术语“药物可接受的”指非毒性材料，其不干扰活性成分的生物活性的有效性。这种制剂可常规的包含盐、缓冲剂、防腐剂、匹配的载体、以及任选的其它治疗剂。当在医药中使用时，所述的盐为药物可接受的，但是非药物可接受的盐也可常规地用于制备其药物可接受的盐并不排除在本发明的范围中。这种药理学和药物可接受的盐包括但不限于，从以下酸中制备的盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、蚁酸、丙二酸、琥珀酸等等。同时，药物可接受的盐也可制备成如钠、钾或钙的碱金属或碱土金属盐。
如果需要，iasppc6组合物可与药物可接受的载体结合。本文所用术语“药物可接受的载体”指一种或多种匹配的固体或液体装填物、稀释剂或封装物质，其适于对人给药。术语“载体”指有机或无机成分、天然和合成的，其与活性成分结合以便应用。以没有基本破坏所需药物有效性的相互作用的方式，药物组合的组分也能够与本发明的所述分子相互共混合。
所述药物组合物也可包含适合的缓冲剂，包括乙酸盐；柠檬酸盐；硼酸盐；以及磷酸盐。
所述药物组合也可任意地包含适合的防腐剂，例如氯化苄烷胺；氯代丁醇；对羟基苯甲酸酯和乙基汞硫代水杨酸钠。
所述药物组合物可以存在常规的剂型，并可按照药剂学领域公知的任何方法来制备。所有的方法包括将所述活性试剂加入与载体的结合步骤，该载体组成一种或多种附加成分。一般而言，通过将所述活性化合物与液体载体、精细粉碎的固体载体和二者同时发生均一和密切的结合来制备所述的组合物，并随后，如果需要，成型该产物。
适合口服给药的组合物能以离散的单位存在，诸如胶囊、片剂、锭剂，每一种均含有活性化合物的预定剂量。其它的组合物包括诸如糖浆、酏剂或乳液的水性液体和非水性液体。
适合肠道外给药的组合物通常包括iaspp c6多肽或核酸的无菌的水性或非水性制剂，其优选与受者的血液等张。根据公知的方法利用适合的分散或湿化剂和悬浮剂来配制该制剂。该无菌的注射制剂也可以是非毒性肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的注射溶液或悬浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。在可接受的载体和溶剂中，可以使用水、林格氏液和等渗氯化钠溶液。此外也可常规使用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。对于此目的，可使用任何混合的不挥发油，包括合成的甘油单或二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸也可用于注射制剂。适合口服、皮下、静脉内、肌肉内等等给药的的载体制剂可参见《雷明顿制药学》，mack publishing co.，easton，pa。
在本发明优选的实施方式中，所述核酸分子选自抑制性rna(rnai)分子或反义核酸分子。
在本发明优选的实施方式中，所述核酸分子选自参考图1b所示的核酸序列所设计的反义分子或抑制性rna分子。优选的所述反义或抑制性rna分子被设计成针对所述核酸序列的部分，其编码由图1a所示的氨基酸残基 1至 483所限定的氨基酸序列。
本文所使用的术语“反义分子”或“反义”描述了寡核苷酸，其是在生理学条件下与包含特定基因的dna或该基因的mrna转录本杂交的寡核糖核酸、寡脱氧核糖核酸、修饰寡核糖核酸或修饰寡脱氧核糖核酸，并因此抑制了该基因的转录和/或所述mrna的翻译。设计的反义分子依靠与靶基因或转录本杂交来干扰靶基因的转录或翻译。本领域的技术人员应认识到，所述反义寡核苷酸的精确长度和与其靶标的互补程度依赖于所选择的具体靶标，其包括所述靶标的序列和含有该序列的具体碱基。优选反义寡核苷酸被构建或排列，以便在生理学条件下与所述靶标选择性的结合，即，在生理学条件下，在靶细胞中，基本上更多地与所述靶序列杂交，而不是任何其它序列。基于本文所提供的iaspp6c核酸序列、或等位的或同源的基因组和/或cdna序列，本领域的技术人员可以容易地选择并合成本发明所使用的任何适合的反义分子。例如，可以制备“基因漫步”，其包含跨越iaspp6c核酸长度的15-30核苷酸的一系列寡核苷酸，随后检测对相应的iaspp6c表达的抑制。任选地，在寡核苷酸之间可以保留5-10核苷酸的间隔以降低合成和检测寡核苷酸的数量。
尽管长度为7个碱基的修饰寡核苷酸已经被成功地用作反义寡核苷酸(wagner等人，nature biotechnol.14840-844，1996)，但为了充分地选择和有效抑制，这样的反义寡核苷酸应该含有至少10个、并优选至少15个与所述靶标互补的连续碱基。更优选地，所述反义寡核苷酸含有20-30个碱基的互补序列。尽管可以选择对基因和mrna转录本的任何区域是反义的寡核苷酸，但是在优选的实施方案中，所述反义寡核苷酸对应于诸如翻译起始、转录起始或启动子位点的n末端或5’上游位点。另外，3’-非翻译区域可以被作为靶标。靶向mrna拼接位点也已经在本领域中使用，但如果存在替代的拼接就不是优选的。另外，所述反义被优选靶向不出现mrna二级结构的位点(参见，例如sainio等人，cell mol.neurobiol.14(5)439-457，1994)内并处在不希望蛋白质结合的位点。最后，尽管本文公开了iaspp 6c cdna序列，本领域的技术人员可以容易地得出相应于所述cdna的所述基因组dna。因此，本发明还提供了与iaspp6c基因组dna互补的反义寡核苷酸。同样地，不需要过多的实验，对等位的或同源的cdna和基因组dna反义也是可以的。
在一组实施方式中，本发明的所述反义寡核苷酸可以由“天然的”脱氧核糖核酸、核糖核酸或其任意组合组成。也就是说，像在天然系统中一样，一个天然的核苷酸的5’端与另一个天然的核苷酸的3’端可以通过磷酸二酯核苷酸间的键合共价地连接。可以通过领域内已知的可以手工实施的方法或通过自动合成仪制备这些寡核苷酸。也可以通过载体重组产生这些寡核苷酸。
在本发明的优选实施方式中，提供了包含可操作地连接到启动子的核酸序列的转录盒，该启动子转录所述核酸分子以产生反义核酸分子，所述序列选自i)图1b所代表的核酸分子序列或其部分；ii)，与存在于图1b所述的有义序列杂交并编码本发明多肽的核酸序列。
最近的特异消融基因功能的技术是通过将双链的rna，也称为抑制性rna(rnai)，介入细胞产生与该rnai分子序列互补的mrna的破坏。该rnai分子包括rna的两条互补链(有义链和反义链)相互退火来形成双链rna分子。该rnai分子通常来自欲消融的基因外显子或编码序列。
最近的研究表明，来自编码序列的长100-1000bp的rnai分子，是有效的基因表达抑制剂。令人惊奇的是，仅需要一些rnai来阻断基因的表达，提示其机制为催化作用。作用的位点位于核内，因为很少有在细胞浆中检测到任何rnai，如果检测到其提示rnai在mrna合成和加工阶段来发挥作用。
在本发明进一步优选的实施方式中，提供了含有核酸分子或其部分的转录盒，其选自i)在图1b中由所述核酸序列代表的核酸分子；ii)与上述(i)中序列杂交并编码本发明多肽的核酸分子；或者iii)因上述(i)和(ii)定义的序列的遗传密码而作为简并密码子的核酸分子，其中适应所述盒从而有义和反义核酸分子均可从所述盒转录。
在本发明优选的实施方式中，所述盒提供有适合转录所述核酸分子的有义和反义链的至少两个启动子。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述盒包括核酸分子，其中所述分子包括连接于第二部分的第一部分，其中所述第一和第二部分的至少一部分的它们序列是互补的，以及其中所述核酸分子的转录产生rna分子，其通过所述第一和第二部分的互补碱基配对形成双链区。
在本发明优选的实施方式中，所述第一和第二部分通过至少一个核苷酸碱基连接。
在本发明优选的实施方式中，所述第一和第二部分通过2，3，4，5，6，7，8，9或至少10个核苷酸碱基连接。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述rnai分子长度为100bp-1000bp。更优选地，所述rnai分子长度选自100bp；200bp；300bp；400bp；500bp；600bp；700bp；800bp；900bp或1000bp。更加优选地，所述rnai分子长度为至少1000bp。
在本发明可选择的优选实施方式中，所述rnai分子长度为15bp-25bp，优选地，所述分子为21bp。
在本发明优选的实施方式中，所述盒是载体的一部分。
根据本发明的另一方面，本发明提供鉴别试剂的筛选方法，该试剂调节p53结合蛋白与p53多肽的相互作用，其中，所述方法包括如下步骤iii)形成制剂，其包括本发明的多肽和p53多肽、或其序列变体，以及至少一种待检测的试剂；iv)测定与所述多肽和p53多肽结合相关的所述试剂的活性。
根据本发明的另一方面，本发明提供鉴别试剂的筛选方法，该试剂调节bcl-2结合多肽与bcl-2多肽的相互作用，其中，所述方法包括如下步骤i)形成制剂，其包括图2a所示氨基酸序列代表的多肽或多肽变体、bcl-2多肽或其变体、以及至少一种待检测的试剂，所述多肽变体被至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰；及ii)测定与所述多肽结合所述bcl-2多肽相关的所述试剂的活性。
根据本发明的另一方面，本发明提供鉴别试剂的筛选方法，该试剂调节本发明多肽的泛素化，所述方法包括如下步骤i)形成制剂，其包括本发明的多肽，泛素多肽或其变体，具有与泛素轭合多肽有关的特异活性的多肽以及至少一种待检测的试剂；ii)测定与泛素轭合到所述多肽相关的所述试剂的活性。
在本发明的优选方法中，所述试剂是肽或多肽。
在本发明的优选方法中，所述肽的长度是至少6个氨基酸残基。所述肽/多肽优选的长度选自至少7个氨基酸残基；8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20个氨基酸残基长度。所述肽/多肽可选择的长度是至少20个氨基酸残基；30，40，50，60，70，80，90或100氨基酸残基长度。
对本领域所属技术人员显而易见的是，对肽试剂的氨基酸序列的修饰可增强该肽对其靶序列的结合和/或稳定性。此外，所述肽的修饰还可增加该肽的体内稳定性从而减少抑制iaspp的p53结合所需的肽的有效量。这将有利于减少可能在体内发生的不必要的副作用。修饰包括，例如但不限于乙酰化或酰胺化。可选择地或优选地，所述修饰包括在重组或合成形式肽的制备中修饰的氨基酸的使用。对本领域所属技术人员显而易见的是，修饰的氨基酸包括，例如但不限于4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸、n6-乙酰赖氨酸、n6-甲基赖氨酸、n6，n6-二甲基赖氨酸、n6，n6，n6-三甲基赖氨酸、环己基丙氨酸，d-氨基酸、鸟氨酸。其它的修饰包括氨基酸中c2、c3或c4烷基r基团任意被1，2或3个取代基取代，该取代基选自卤素(例如f，br，i)、羟基或c1-c4烷氧基。修饰还可包括，例如但不限于乙酰化和酰胺化。
在本发明优选的实施方式中，所述肽序列被乙酰化。优选地所述乙酰化是针对所述肽的氨基末端。
在本发明进一步优选的实施方式中，所述肽序列被酰胺化。优选地所述酰胺化是针对所述肽的羧基末端。
本领域所属技术人员显而易见的是，可通过环化作用来修饰肽。环化是本领域公知的(参见scott等人，chem biol(2001)，8801-815；gellerman等人，j.peptide res(2001)，57277-291；dutta等人，j.peptideres(2000)，8398-412；ngoka与gross j amer soc mass spec(1999)，10360-363)。
在本发明的另一个优选的方法中，所述拮抗剂是抗体或抗体结合部分。优选所述抗体是单克隆抗体或其结合部分。
在本发明可选择的优选方法中，所述试剂为适体(aptamer)。
核酸具有线性序列结构和三维结构，该三维结构部分由其线形序列确定并还由这些分子所处的环境来决定。常用的治疗分子为小分子，例如，肽、多肽或抗体，其结合靶分子来产生激动或拮抗作用。越来越显而易见的是，核酸分子还具有提供具有所需的结合特性的试剂的潜力，该结合特性可具有治疗用途。这些核酸分子通常称为适体(aptamer)。适体是小的通常是稳定的核酸分子，其包括对靶分子的结合功能结构域。美国专利申请us5,270,163描述了鉴定适体的筛选方法，本文将其引入作为参考。适体通常是寡核苷酸，其可以是单链的寡脱氧核酸，寡核糖核酸，或者修饰的寡脱氧核酸或寡核糖核酸。
术语“修饰”包括具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰的核苷酸包括具有糖的核苷酸，该糖共价连接至低分子量的有机基团而不是3′位的羟基以及5′位的磷酸基。因此修饰的核苷酸可包括2’取代的糖，例如，2’-o-甲基-；2-o-烷基-；2-o-烯丙基-；2’-s-烷基-；2’-s-烯丙基-；2’-氟-；2’-卤素或2；叠氮基-核糖，碳环型的糖类似物a-端基异构糖；诸如树胶醛糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖的差向异构糖。
修饰的核酸是本领域所公知的并包括例如但不限于，烷基化嘌呤和/或嘧啶；乙酰化嘌呤和/或嘧啶或其它杂环。嘧啶和嘌呤的种类也是本领域所公知的并包括，假异胞嘧啶；n4，n4-ethanocytosine(乙醇基胞嘧啶)；8-羟基-n6-甲基腺嘌呤；4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶；二氢尿嘧啶；肌苷；n6-异戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；2，2-二甲基鸟嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鸟嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；n6-甲基腺嘌呤；7-甲基鸟嘌呤；5-甲基氨基甲基尿嘧啶；5-甲氧氨基甲基-2-硫尿嘧啶；β-d-甘露糖基queosine；5-甲氧羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧尿嘧啶；2甲基硫代-n6-异戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯；假尿嘧啶；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；n-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯；尿嘧啶5-羟乙酸；queosine；2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；以及2，6，-二氨基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；1-甲基胞嘧啶。
通过常规的磷酸二酯连接的核苷酸来合成本发明的适体，并利用标准的本领域公知的固相和液相合成技术来合成。核酸间的连接可利用可选择的连接分子。例如，以下式的连接基团p(o)s，(硫酯，thioate)；p(s)s，(二硫酯)；p(o)nr’2；p(o)r’；p(o)or6；co；或conr’2，其中r为h(或盐)或烷基(1-12c)，而且r6为烷基(1-9c)通过-o-或-s-加入到相邻的核苷酸。通过本文所公开的分析法容易检测到适体对靶多肽的结合。
现在参考以下附图仅利用实施例来描述本发明的实施方式。
图1a为iaspp c6蛋白的氨基酸序列，下划线的氨基酸序列与iaspp相同；图1b为iaspp6c的核酸序列；图2a为iaspp的氨基酸序列；图2b为iaspp的核酸序列；
图3为全长iaspp6c和iaspp的序列比对；图4a所示为在不同细胞系表达的iaspp的表达。在约100kda检测全长iaspp6c。用抗体lx049.3探查的样品是在体外翻译的2.1kb iaspp；rko(结肠癌细胞系)；hela；293(肾脏)；mcf7(乳腺)；saos2(骨肉瘤)；hbl100(乳腺)；h1299(肺)；u937(肺)；u20s(骨肉瘤)细胞；图4b、4c和4d显示通过抗iaspp和iaspp6c中序列的不同抗体可以检测iaspp6c。4b所示为用于产生抗体lx049.3、sa4.1和pab18抗体的抗原相对位置图；4c示出了用未标记氨基酸在体外翻译iaspp6c和iaspp cdna。同时进行包含空载体的对照反应。用lx049.3探查印记中的两个iaspp蛋白之间所观察到的条带是非特异的。4d示出了用lx049.3在细胞系中检测的iaspp6c和iaspp的表达水平。iaspp6c和iaspp cdna在体外的翻译产物(ivt)作为阳性对照物被加载。分子量标记的位置显示在右边。抗pcna抗体pc-10用作细胞裂解的加载对照物；图5所示为用两个不同的iaspp抗体的免疫沉淀反应/western(蛋白)印记lx049.3是小鼠单克隆抗体而pab18是兔抗体(参见图3，在肽比对中给出了抗原决定簇)；图6a和6b显示iaspp c6是泛素化的。这个过程导致产生了83kda片段，其在mg132(泛素-蛋白体抑制剂)存在下被阻断。泛素化也依赖于细胞密度产生。按照所需要的细胞密度分开细胞并在第二天(16-24小时以后)加入mg132。
图7显示p53优先与全长iaspp6c结合，而bcl-2优先结合iaspp；图8显示细胞中全长iaspp6c的活性，以及iaspp和p53参与细胞凋亡基因而不是细胞周期调节基因的活化，且其也与p63和p73互相作用；图9显示全长iaspp6c而不是iaspp优先在细胞内表达，但以不同的表达水平来表达。
图10显示iaspp6c的n-末端导致它定位到细胞浆(a)lx049.3用于在saos-2和h1299细胞内检测iaspp6c。在saos-2细胞中分析转染(左)的或者内源性的iaspp6c(中心)，以及h1299细胞(右)中的内源iaspp6c。(b)编码图中所示iaspp区域的v5表位标签的构建体被转染入saos-2细胞，并利用抗-v5抗体的免疫荧光分析确定它们的亚细胞定位；以及图11显示抑制p53所需的iaspp6c的c末端。(a)用p53和示出的iaspp介导体转染saos-2细胞，并通过facs检测细胞凋亡。右手图是显示所述转染蛋白的相对表达水平的免疫印迹。(b)用1μg含pig-3启动子的荧光素酶报告质粒，以及50ng p53、0.25ng iaspp6c质粒转染saos-2细胞。该图显示了相对的转录活性的变化。
材料与方法细胞培养和试剂细胞在含10％胎牛血清的dulbecco′s改良eagle培养液(invitrogen)的培养中生长。用于这个研究中的细胞为tera(睾丸肿瘤细胞系)、rko(结肠癌)、saos-2(骨肉瘤)、h1299(肺癌)、293(胎肾)、sk-mel-37(黑素瘤)、mcf7(乳腺上皮)和u2os(骨肉瘤)。抗-v5抗体从invitrogen购买。n-20 cd20leu fitc-轭合单克隆抗体从becton dickinson得到。采用磷酸钙沉淀进行全部的转染。
质粒含有编码iaspp6c(i.m.a.g.e.克隆4994121)的cdna的est从mrc geneservice(英国剑桥)得到。cdna被亚克隆入pcdna3.1/v5-his-topo(invitrogen)。pcdna3.1 iaspp、pcdna3.1aspp2、pcdna3.1 ce-iaspp和pcdna3 p53已经在前面描述过(bergamaschi等人，2003；samuels-lev等人，2001)。用于图10中的iaspp6c平截体通过pcr-定向克隆入pcdna3.1/v5-his-topo而产生。具有5’多接头插入的两个v5序列的修饰pcdna3载体用于产生n末端v5标记的iaspp6c。
抗iaspp抗体的产生抗iaspp6c抗体pab18(兔多克隆)和sa4.1(鼠单克隆)是产生用来抗肽rlqpalppeaqsvpelee(iaspp6c的氨基酸492至509)的。抗iaspp6c鼠单克隆抗体lx049.3是抗含有iaspp6c的氨基酸459至639的c末端his-标签融合蛋白。通过pcr扩增对应的cdna并亚克隆至pcrt7/cttopo(invitrogen)。重组iaspp6c片段在bl21 star埃布氏菌(e.coli)中通过用1mmiptg孵育4小时产生，接着在变性条件下纯化。
电泳和免疫印迹法将细胞用pbs冲洗两次，然后倒入1ml pbs并在400g条件下沉淀。通过室温下，在8m脲、1m硫脲、0.5％chaps、50mm dtt和24mm精胺中孵育30分钟裂解细胞，接着在16℃、20000g离心。通过如上述(yap等人，2000)的sds-page和免疫印迹法，将30μg的蛋白质用于分析。
免疫沉淀反应通过在np40裂解缓冲液(50mm tris ph8.0、150ml nacl、1mmedta，1％np40和蛋白酶抑制剂(完全的蛋白酶抑制剂鸡尾酒，roche))中在冰上孵育45分钟裂解细胞，接着在4℃20000g离心分离20分钟。通过与蛋白质g琼脂糖珠(amersham biosciences)在4℃旋转1h，预清洗0.5-2mg的裂解产物。该珠的去除后，将该裂解产物转移到新的试管并在4℃与阻断蛋白质g琼脂糖珠，以及大约1μg特异性抗体或作为对照的非特异性鼠或兔的igg(sigma)旋转过夜。接着用冰冷的np40细胞裂解缓冲液冲洗该珠三次，采用sds-page和免疫印迹法分析所得到的复合物。
iaspp6c sirna的构建和转染如上文所述(brummelkamp等人，2002)，将含有存在于iaspp6c和iaspp cdna中的19个碱基序列的寡核苷酸连接到psuper表达质粒。通过测序证实该质粒。利用上述所示的cdna序列，用于产生sirna的寡核苷酸的完整序列如下
有义，5’gatcccctgtcaactcccccgacagcttcaagagagctgtcgggggagttgacatttttggaaa3’；反义，5’agcttttccaaaaatgtcaactcccccgacagctctcttgaagctgtcgggggagttgacaggg3’。dish对于转染，将1×106h1299细胞接种在10cm皿上。用3μg pmacsh-2kk以及psuper或psuper-si-rna iaspp(10μg)转染细胞。转染后48小时，根据制造者的说明书，用macs系统(miltenyi biotec)分离表达pmacs h-2kk质粒的细胞。这产生了两个细胞种群h-2kk表达(已转染的)细胞和非表达(非转染的细胞)。两个细胞种群都用ripa缓冲液(150mm nacl、1mmedta、50mm tris ph8、0.5％脱氧胆酸、1％np40、0.1％ sds)在冰上裂解30分钟，接着在4℃20000g离心分离30分钟。
在体外翻译并在体外免疫沉淀反应采用tnt t7快速转录/翻译联合系统(tnt t7 quick coupledtranscription/translation system，promega)用35s-蛋氨酸在体外翻译p53和iaspp6c。含有每个蛋白的网状细胞裂解产物按说明结合并在30℃一起孵育1h。将固定在蛋白质g琼脂糖珠上的lx049.3抗体加到结合反应并在4℃旋转16h。然后用pbs冲洗该珠。在sds样品缓冲液中释放结合蛋白并用10％ sds-page分析。结果通过放射自显影显示。
转录活化根据前面的描述(samuels-lev等人，2001)进行转录分析。
流式细胞仪在转染之前，将流式细胞仪的1×106saos-2细胞接种在10cm皿上24-48小时。用2μg pcmv cd20作为转染标记转染所有细胞。用以下所述适当量转染质粒pcdna3 p53(1μg)、pcdna3.1 ce-iaspp(7.5μg)、pcdna3.1 iaspp(7.5μg)、pcdna3.1 iaspp6c(1μg)、pcdna3.1aspp2(10μg)。用于图11的是2μg iaspp6c平截体。空的pcdna3载体被用于平衡所有样品中的dna总量。转染36h后，获得附着和漂浮的细胞，并以前述方法(hsieh等人，1997)分析。
免疫荧光分析将saos-2细胞以50％的密度接种在24孔培养板的盖片上，并用编码iaspp6c平截体的0.5-3μg质粒转染。转染24h后，用200μl含4％的多聚甲醛的pbs固定该细胞12分钟，然后用含0.1％ triton-x100的pbs通透4分钟。采用抗-v5抗体(在0.2％鱼皮凝胶中1∶100稀释)孵育40分钟，接着用tritc或fitc-轭合第二抗体20分钟，来检测iaspp6c构建体的表达。
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权利要求
1.分离的多肽或多肽变体，其中所述分离的多肽由图1a所示的氨基酸序列代表，所述多肽变体通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰，其特征在于，所述多肽具有以下特性i)当与图2a所示的氨基酸序列代表的多肽或其变体比较时，优先结合肿瘤抑制多肽p53从而抑制p53的促细胞凋亡活性的多肽；ii)包含至少一个被泛素化的氨基酸残基的多肽；以及iii)包含氨基末端多肽结构域的多肽，其中所述结构域由图1a所示氨基酸序列的氨基酸1至483代表。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中当与图2a所示的氨基酸序列代表的多肽比较时，所述多肽优先结合p53。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽通过至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰，其中所述修饰位于图1a表示的氨基酸序列的氨基酸残基1至483。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的多肽，其中所述多肽包含图1a所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的多肽，其中所述多肽由图1a所示的氨基酸序列组成。
6.分离核酸分子，其中所述核酸分子编码权利要求1-5任一权利要求所述的多肽。
7.根据权利要求6所述的分离核酸分子，其中所述核酸分子由图1b所示的核酸序列代表，或者是在严格的杂交条件下与图1b所示序列杂交并编码权利要求1-5任一权利要求所述多肽的核酸分子。
8.根据权利要求6或7所述的核酸分子，其中所述核酸分子由图1b所示的核酸序列组成。
9.根据权利要求6-8任一权利要求所述的核酸分子，其中所述分子是cdna。
10.根据权利要求6-8任一权利要求所述的核酸分子，其中所述分子是基因组dna。
11.载体，包含权利要求6-10任一权利要求所述的核酸分子。
12.权利要求1-5任一权利要求所述多肽的制备方法，包括以下步骤i)提供用权利要求6-11任一权利要求所述的核酸分子或载体转化/转染的细胞；ii)在有助于制备所述多肽的条件下培养所述细胞；以及iii)从所述细胞或其生长环境中纯化所述多肽。
13.抗体或其结合片段，其结合权利要求1-5任一权利要求所述的多肽，其特征在于，所述抗体结合图1a所示氨基酸序列的氨基酸残基1至483的所述多肽。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中所述片段是fab片段。
15.根据权利要求14所述的抗体片段，其中所述抗体选自f(ab′)2、fab、fv和fd片段；以及含有cdr3区域的抗体。
16.根据权利要求13-15任一权利要求所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体是人源化抗体。
17.根据权利要求13-15任一权利要求所述的抗体或其结合片段，其中所述抗体是嵌合抗体。
18.权利要求1-5任一权利要求所述的多肽作为药物的用途。
19.权利要求6-11任一权利要求所述的核酸分子或载体作为药物的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述核酸分子是抑制性rna分子。
21.根据权利要求19所述的用途，其中所述核酸分子是反义核酸分子。
22.根据权利要求20或21所述的用途，其中所述核酸分子选自参考图3所示核酸序列设计的反义分子或抑制性rna分子，其中所述反义或抑制性rna分子被设计成针对所述核酸序列的部分，其编码由图1a所示定义的氨基酸残基1至483。
23.根据权利要求22所述的用途，其中以转录盒提供所述核酸分子，所述转录盒包含操作地连接到启动子的核酸序列，该启动子转录所述核酸分子以产生反义核酸分子，所述序列选自i)图1b代表的核酸序列，或其部分；ii)与图1b所示的有义序列杂交并编码权利要求1-6任一权利要求所述多肽的核酸序列。
24.根据权利要求22所述的用途，其中以转录盒提供所述核酸分子，所述转录盒包含选自以下的核酸分子，或其部分i)图1b中核酸序列代表的核酸分子；ii)与上述(i)中序列杂交并编码权利要求1-5任一权利要求所述多肽的核酸分子；或者iii)核酸分子，其是根据上述(i)和(ii)定义的序列的遗传密码的简并密码，其中适应所述盒从而从所述盒转录有义和反义核酸分子。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述盒提供有适合转录所述核酸分子的有义和反义链的至少两个启动子。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述盒含有核酸分子，其中所述分子包括连接于第二部分的第一部分，其中所述第一和第二部分的至少一部分它们的序列是互补的，以及其中所述所述核酸分子的转录产生rna分子，其通过所述第一和第二部分的互补碱基配对形成双链区。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述第一和第二部分通过至少一个核苷酸碱基连接。
28.根据权利要求23-27任一权利要求所述的用途，其中所述盒是载体的一部分。
29.鉴别试剂的筛选方法，所述试剂调节p53结合蛋白与p53多肽的相互作用，其中所述方法包括如下步骤i)形成制剂，其包括权利要求1-5中任一权利要求的多肽和p53多肽、或它们的序列变体，以及至少一种待检测的试剂；ii)测定与所述多肽结合所述p53多肽相关的所述试剂的活性。
30.鉴别试剂的筛选方法，所述试剂调节bcl-2结合多肽与bcl-2多肽的相互作用，其中所述方法包括如下步骤i)形成制剂，其包括图2a所示的氨基酸序列代表的多肽或多肽变体，bcl-2多肽或其变体，以及至少一种待检测的试剂，所述多肽变体被至少一个氨基酸残基的添加、缺失或替代来修饰；及ii)测定与所述多肽结合所述bcl-2多肽相关的所述试剂的活性。
31.鉴别试剂的筛选方法，所述试剂调节多肽的泛素化，所述方法包括如下步骤i)形成制剂，其包含权利要求1-5任一权利要求所述的多肽，泛素多肽或其变体，具有与泛素轭合多肽有关的特异活性的多肽以及至少一种待检测的试剂；ii)测定与泛素轭合到所述多肽相关的所述试剂的活性。
32.根据权利要求29-31任一权利要求所述的方法，其中所述试剂是肽或多肽。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽/多肽是抗体或抗体结合片段。
34.根据权利要求29-31任一权利要求所述的方法，其中所述试剂是适体。
全文摘要
本发明描述了结合并调节诸如p53的肿瘤抑制多肽活性的多肽；编码所述蛋白质的核酸分子以及对其靶多肽调节所述多肽的结合活性的筛选方法。
文档编号c07k14/47gk1890263sq200480036472
公开日2007年1月3日 申请日期2004年8月13日 优先权日2003年12月10日
发明者卢欣, 伊丽莎白·希利 申请人:路德维希癌症研究院