专利名称：低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用，属于微生物学，分子生物学和基因工程领域。
背景技术：
2009年，美国asco主席在介绍肿瘤进展时提到，癌症的第一死亡原因是癌症本身和癌症复发，第二位死因就是血栓。癌症与血栓的关系非常密切，重视癌症血栓的预防和治疗已成为临床医生今后工作的重点之一。1865年，法国医生armand trousseau首次报道了胃癌患者容易形成静脉血栓， 不久，billroth又于1878年发现了血栓中存在癌细胞，进一步提出癌变可引起凝血功能紊乱。临床上把肿瘤相关性血栓称为trousseau综合症。大量的病理、实验和临床研究证实了这一现象，而且还发现，几乎所有的癌症患者都存在局部或全部高凝状态。癌症患者的血栓性疾病包括深静脉血栓(de印venous thlmmbosis，dvt)、肺 ^ (pulmonary embolism, ρε) > ^ 1 ifil iw m ifil (disseminated intravascular
coagulation, dic)、门静脉血检(portal vein thmrnbosis, pvt)禾口动脉血检栓塞(arterial thromboembolism, at)、游走性浅表血栓性静脉炎(migratory thrombophlebitis superficial)等，其中下肢 dvt 最为常见。癌症患者血栓形成的发病机理相当复杂，至今尚未完全明确。多种因素通过不同途径共同导致了癌症患者的血栓易患倾向，主要包括抗癌治疗、肿瘤细胞的表达物及释放物和致癌基因等因素。抗癌治疗导致血栓形成，主要是手术治疗期间形成血栓，化疗药物和放射治疗诱发血栓形成以及患者在接受中心静脉穿刺置管治疗期间，管周纤维蛋白鞘导致血栓形成。癌症患者所患的血栓性疾病与肿瘤细胞表达和释放的物质关系密切。肿瘤细胞可通过释放促凝因子或炎性因子来直接或间接地激活凝血级联反应，另一方面，炎性因子亦可刺激肿瘤细胞释放更多的促凝因子而加剧血液的高凝状态。肿瘤细胞表达和释放的三种主要促凝物质为组织因子(tf)、癌促凝物质(cancer procoagulant cp)和丝氨酸蛋白酶 (hepsin)。新近的研究表明，某些致癌基因在促进细胞恶变的同时也能够引起凝血功能紊乱。如yu j等证实，导致癌症产生的某些基因病变如ras基因活化或p53基因失活能够造成组织因子(tf)的过度表达，诱发凝血病变。最近的研究还显示，血栓形成参与了肿瘤的进展、血管生成和转移等机制。除了癌症治疗形成血栓可视为外界因素外，其余两种因素所形成的血栓都是应机体癌变出现的。 研究发现，血栓的形成有利于肿瘤发生和发展的机制可能是纤维蛋白沉积于肿瘤细胞周围为肿瘤生长提供了 2个便利条件一方面为肿瘤细胞附着提供了基质，利于其局部扩散和蔓延；另一方面，纤维蛋白凝血块和相关的凝血因子能够上调血管内皮细胞生长因子的表达(vegf)，从而为新生血管创造了条件。
金黄色葡萄球菌肠毒素c2 (staphylococcal enterotoxins, sec2)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells, apcs)的加工，也不受组织相容性复合体(mhc)的限制，在apc之外与t细胞受体v β链形成mhcii-se-tcrvii复合物， 在极低浓度时就能刺激大部分有tcrvii序列的t细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。sec2可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(sag-cbpendent cell-mediated t-cell-derived cytotoxicity, sdcc)，从而产生系统的抗肿瘤反应。但作为潜在胃肠毒素，sec2可引起食物中毒，引发腹绞痛和腹泻，作为外源蛋白，sec2分子量大，易引起超敏反应。n端17个氨基酸以及c端132个氨基酸缺失的asec2分子量小，毒副作用降低，而其抗肿瘤活性得以保持。葡激酶(staphylokinase，mk)是由具有溶原性的金黄色葡萄球菌在指数期后期产生、分泌的一种胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用机制是激活体内溶栓系统，即通过激活纤溶酶原(plg)转变成纤溶酶(pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓药物，同其它的溶栓药物比较，葡激酶具有溶栓活力强，溶栓作用专一，免疫原性低以及过敏反应少等多种特点，而且当血栓被溶解后，葡激酶对纤溶酶原的激活作用会受到人体内α 2抗纤溶酶的抑制，避免了出血反应。并且n端缺失10个氨基酸的δ sak的抗血栓活性与sak的活性相似。目前，治疗肿瘤及血栓的药物都为单一功能的药物，对于肿瘤并发血栓尚无特效药。因此，构建出一种既抗肿瘤又溶栓的双功能嵌合蛋白，对于治疗癌症并发血栓的病例具有重要意义。虽然也有既抗肿瘤又溶栓的嵌合蛋白，但是其分子量高达44kd，而且具有较高的免疫原性，因此，降低分子量、降低免疫原性成为当前亟待解决的问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是构建一种分子量低，免疫原性低的抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白。为了实现上述目的，本发明采取如下技术方案一种低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，由序列表seq id n0. 3所示的δ sak氨基酸序列和序列表seq id ν0. 4所示的 δ sec2氨基酸序列构成，将δ sec2和δ sak连接在一起得到氨基酸序列如seq id no. 11 所示的嵌合蛋白δ mk-δ sec2，或氨基酸序列如seq id ν0. 12所示的嵌合蛋白δ sec2 -asak。利用大肠杆菌表达系统生产上述低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白 δ sak- δ sec2的方法如下
1)构建载体pet 2sa~ asak- linker-δ sec2, asak- /i/^er-」secs 的 dna 序列如 seq id no. 5 所示；
2)将得到的载体pet28a~δ saa-^secj经pcr去除」仰左禾口 zl1secj之间的 linker，构建出表达嵌合蛋白δ δ sec2的质粒pei^8a_」仰左-」sec么zl sak-δ sec2 的dna序列如seq id no. 7所示；
3)将质粒pei^8a-」sak-δ mcj 转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，得到重组大肠杆
菌；
4)将重组大肠杆菌接种于lb培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在30°c条件下用1 mm iptg诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；
5)用超声波破碎菌体细胞，功率200-300w;处理时间6x9 sec,9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过ni-nta亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白 his- δ sak- δ sec2，其氨基酸序列如seq id no. 9所示；
7)嵌合蛋白his-δ sak- δ sec2经过肠激酶切割，再次过ni-nta亲和层析柱，得到嵌合蛋白a&ik-asec2，其氨基酸序列如seq id no. 11所示。利用大肠杆菌表达系统生产上述的低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白δ sec2-δ sak的方法如下
1)构建载体pet 28a-/isec^- linker-δ sak，δ sec2~ /i/^er-」sa左的 dna 序列如 seq id no. 6 所示；
2)将得到的载体pet28a-zl sec2~ linker-δ sak经pcr去除」sec2和」sak之间的 linker,构建出表达嵌合蛋白 δ sec2- δ sak 的质粒 pei^8a_」sec2~a sak, δ sec2~a sak 的dna序列如seq id no. 8所示；
3)将质粒pei^8a-」sec2-δ sak转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，得到重组大肠杆
菌；
4)将重组大肠杆菌接种于lb培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在 30°c条件下用1 mm iptg诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；
5)用超声波破碎菌体细胞，功率200-300w;处理时间6x9 sec,9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；
6)将上清液过ni-nta亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白 his-asec2-asak，其氨基酸序列如seq id no. 104所示；
7)嵌合蛋白his-δ sec2- δ sak经过肠激酶切割，再次过ni-nta亲和层析柱，得到嵌合蛋白asec2-a&ik，其氨基酸序列如seq id n0. 12所示。本发明的嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。以本发明的嵌合蛋白a&ik_asec2或嵌合蛋白δ sec2-δ sak为有效成分，添加药学上常规的辅料，可制备具有抗肿瘤溶栓双效的各种药物制剂。本发明，基于sec2的抑瘤活性和sak的溶栓活性，且为了降低双功能蛋白的分子量以及免疫原性，将n端缺失10个氨基酸的葡激酶δ sak及n、c端分别缺失10、132 个氨基酸的肠毒素asec2嵌合在一起，并使两者之间无任何连接肽，所构建的嵌合蛋白 δ sec2-a sak和δ sak-asec2分子量大大降低，去掉了具有较高免疫原性的氨基酸序列， 解决了嵌合蛋白分子量大和高免疫原性的问题，同时抗肿瘤和溶栓的功能得以保留。本发明的有益效果是本发明所构建的抗肿瘤溶栓双效蛋白既保留了 sak的溶栓活性又不减sec2的抗肿瘤功能，并且分子量小，只有^kd,易于静脉注射给药，对于降低毒副作用具有实践意义，是理想的溶栓抗癌双效生物制剂。本发明采用基因工程方法，通过大肠杆菌原核表达系统和m亲和层析纯化法，成功获得了高蛋白纯度的嵌合蛋白，并经体外溶栓实验和体外抑瘤实验证明了，本发明的嵌合蛋白分别保留了 sak的溶血栓活性和sec2 的抗肿瘤活性，成功实现了低免疫原性的溶栓抗癌双效生物制剂的构建。
具体实施例方式
实施例1低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白δ sak- δ sec2的制备 (一)带有嵌合基因」sak-δ sec2的表达质粒构建
i) asak的pcr扩增，」sak基因序列如seq id no. 1所示，」sak通过xhol 连接在pet28a上，构建质粒pei^8a_」sak,以质粒pei^8a_」sak为模板，通过设计特定引物
上游5’ -attaatcatatggacgacgacgacaaaaaaggcgatgacgcgagt-3’ 下游5’ -cgggccgaattctttcttttctataacaac-3，
利用pcr方法扩增」sak,并使」sak编码氨基酸上游具有肠激酶识别为点，」sak两端分别带有限制性酶切位点nde\和。2) pet28a-」sak - linker-δ sec2 的构建」sec2 基因序列如 seq id no. 2 所示，」sec2通过xhol连接在pet 28a上，构建质粒pei^8a_」sec2, δ sak经mfei 和&0ri双酶切后插入pet28a-」sec2中zl sec2上游的mfei和位点，t4连接酶 16°c连接过夜，得到连接反应液。将连接反应液加入到预先通过氯化钙法制备的大肠杆菌 bl21感受态细胞中，经化学方法转化(42°c水浴热激)，之后，将菌液涂布于含有kan抗性的 lb平板上，37°c培养过夜后挑取阳性克隆，培养后提取质粒，经mfei和双酶切验证， 确定」^aa是否被插入到pet zsa-zl1secj中，是否构建pet 28a~asaa - linker-δ sec2 (由于」sak和」^ecj 是通过&0ri酶切位点连接，所以在」sak和」mcj 之间有一个序列为gaattc (即feori酶切位点)的linker)ο3)pet28a-」sak -δ sec2 的构建,将 pet28a_」sak- linker-δ sec2 经 pcr 去除 」sak和」之间的linker (gaattc),对pcr产物进行末端平滑化及5’磷酸化处理， 高效连接酶进行自身连接(环化反应)，然后化学转化至大肠杆菌bl21感受态细胞，将菌液涂布于含有kan抗性的lb平板上，37°c培养过夜后挑取阳性克隆，培养后提取质粒经feori 单酶切验证，确定linker是否被去掉。再由上海生工公司(sangon，china)对得到的重组质粒进行测序确认。试验结果
经酶切验证和测序分析综合表明，表达嵌合蛋白his-a&ik-asec2的原核表达载体构建成功。获得带有重组质粒pet28a_」mi -zmcj 的重组大肠杆菌。(二)his- δ sak- δ sec2的诱导表达纯化及δ sak- δ sec2的获得 uhis-asak-asec2的诱导表达
将带有重组质粒pei^8a_」sak -δ sec2的重组大肠杆菌接种于含有kan (卡那霉素， kanamycine, kan) (40 μδ/πι1)的10 ml lb培养基中，培养12 16小时，次日按2%的接种量，将培养好的菌液接种到含有kan (40 pg/ml)的200 ml lb培养基中培养，当菌液吸光度值达到0.6时，用1 mm iptg进行诱导。为了避免在表达过程中出现包涵体，本发明选择在菌体生长不是很活跃的30°c作为诱导温度，诱导4 一 5 h。2、his- δ sak- δ sec2 的纯化
经过4个小时的诱导表达后，通过8000 rpm离心5分钟收集菌体细胞。零下20°c过夜冻存菌体，次日取出，室温放置15分钟。用超声波破碎菌体细胞，功率200-300 w ；处理时间6x9sec，9sec间隔。处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液。将上清液低速上样于ni-nta亲和层析柱，平衡缓冲液(30 mm tris-hcl, 300 mm nacl ph7. 6)平衡至基线，洗脱缓冲液(30 mm tris-hcl, 300 mm nacl, 50-300 mm 咪唑 ph7. 6)梯度洗脱，收集洗脱峰，浓缩除盐，sds-page分析纯度。得到带有组氨酸标签的重组 his-asak-asec2。本发明中，载体质粒pet28a( )编码了三个用于纯化的标签，c端6xhistag， t7tag和n端6xhistag，本发明选择了 n端6xhistag。利用ni离子特异性螯合his的特点，实现含有6 xhistag的δ sak- δ sec2与杂蛋白的分离，再通过咪唑竞争6 xhistag与 ni离子的结合实现his-a&ik-asec2的洗脱。3、δ sak- δ sec2 的制备
his- δ sak- δ sec2经过重组牛肠激酶切割后的混合物再次过ni-nta亲和层析柱，得到嵌合蛋白asak-asec20(三)δsak- δ sec2 的 sds-page 验证和 western blot 分析
δ &ik-δ sec2经sds-page后，电转印至nc膜上，经5% bsa封闭，tbst漂洗后，加入兔抗sec2抗体，37°c反应1 h;tbst漂洗，加入hrp标记的山羊抗兔igg，37°c 1 h，tbst 漂洗3次，dab染色。结果显示经sds-page验证，成功获得嵌合蛋白δ sak- δ sec2，δ sak- δ sec2 蛋白能与兔抗sec抗体结合，在相对分子质量约^kd处可见特异性反应条带，表明 δ sak- δ sec2蛋白具有良好的反应原性，δ sec2保留了与sec2超抗原相关的抗原决定簇。 δ sak- δ sec2氨基酸序列如seq id no. 11所示。(四)δ sak- δ sec2体外溶栓活性分析
sak以及a&ik_asec2的溶栓活性是相比尿激酶标准品相比测得的。具体实施如下 称取125 mg琼脂糖(电泳级)，加入23 ml生理盐水，煮沸溶解，60°c水浴平衡，加凝血酶14 μ (100 iu/ml)，人纤溶酶原沘0 μ 1 (0.5 mg/ml)，人纤维蛋白原2. 2 ml (6 mg/ ml)，倒入80 mm平板内冷却，制成人纤维蛋白平板，用前于4°c放置半个小时。在形成的纤维蛋白平板内打孔(直径2 mm)，每孔点样10 μ ，水平放置于37°c孵箱m h。标准品尿激酶(1280iu)稀释成 640 iu,320 iuu60 iu,80 iu,40 iu,20 iuuo iu制作标准曲线。点样平板经过纵横两次去溶圈直径，以各个稀释度的活性的对数(x)为横坐标，以溶圈直径的平均数(四次量取的数值)的对数为纵坐标(y)，利用统计学软件中的回归分析方法作标准曲线，并求得尸a bx中的a和b及线形回归系数r值，根据样品的溶圈直径可求得样品的活性。实验结果
根据尿激酶标准曲线侧得mk的溶栓活性为7. 5 x io3 iu/mg, δ sak- δ sec2为 7. 5 x io3 iu/mg, δ sak- δ sec2 保留了 sak 的溶栓活性。(五)δsak- δ sec2鼠脾淋巴细胞增殖试验
取4-6周龄的小鼠，雄性，体重18-22 g。脱颈处死小鼠，75%酒精浸泡消毒5 min。无菌条件下剖开小鼠，腹腔取脾，研磨过100目筛网，々-hank’ s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。1000 r/min常温离心5 min，弃上清；加红细胞裂解液10 ml，混勻脾细胞，静止4_5 min，使红细胞完全破碎。1000 r/min常温离心5 min，弃上清，去除红细胞。々-hank’ s液洗2-3遍，用2 ml rpmi1640完全培养液重悬细胞，用血球计数板计数，用rpmi1640培养液调整细胞浓度为2x io6个/ml。用rpmi1640培养液稀释供试品，每孔100 μ 1，加入到96 孔板中，以pha-p为阳性对照，以bsa为阴性对照孔，以rpmi1640培养液为空白对照孔，设6 个复孔，向各孔中分别加入100 μ 1脾淋巴细胞悬液。待脾淋巴细胞贴壁后，加样。每个孔加100 μ 样品。将加好样的96孔板置37 0c ,5% co2孵箱中培养72 h。终止培养，3000 rpm离心10 min，弃去孔内培养液。每孔加120 μ 1 二甲基亚砜(dms0)，振荡10 min，充分溶解结晶，置酶标仪上测定各孔在波长为570 nm处的吸光值。
对.rsfi (odd:>
权利要求
1.低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白，其特征在于所述的嵌合蛋白为氨基酸序列如seq id no. 11所示的嵌合蛋白a&ik-asec2，或氨基酸序列如seq id no. 12所示的嵌合蛋白 asec2 - asak。
2.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白a&ik_asec2的方法，其特征在于步骤如下1)构建载体pet 28a-zl sak~ linker-δ sec2, asak- yi/^er_」secs 的 dna 序列如 seq id no. 5 所示；2)将得到的载体pet28a-zl sak~ linker-δ sec2经 pcr去除」sak和」sec2之间的linker，构建出表达嵌合蛋白δ δ sec2的质粒pei^8a_」仰左-zl sec2, asak -δ sec2 的 dna 序列如 seq id no. 7 所示；3)将质粒pei^8a-」sak-δ mcj 转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；4)将重组大肠杆菌接种于lb培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在 30°c条件下用1 mm iptg诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；5)用超声波破碎菌体细胞，功率200-300w;处理时间6x9 sec,9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；6)将上清液过ni-nta亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白 his- δ sak- δ sec2，其氨基酸序列如seq id no. 9所示；7)嵌合蛋白his-δ sak- δ sec2经过肠激酶切割，再次过ni-nta亲和层析柱，得到嵌合蛋白a&ik-asec2，其氨基酸序列如seq id no. 11所示。
3.一种利用大肠杆菌表达系统生产权利要求1所述的低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白asec2 - asak的方法，其特征在于步骤如下1)构建载体pet 2^~asec2~ linker-δ sak，δ sec2~ /i/^er-」sa左的 dna 序列如 seq id no. 6 所示；2)将得到的载体pet28a-zl sec2~ linker-δ sak经 pcr去除」sec2和」sak之间的linker，构建出表达嵌合蛋白δ sec2-δ &ik的质粒pei^8a_」^secj -zl sak, δ sec2 -δ sak的dna序列如seq id no. 8所示；3)将质粒pei^8a-」sec2-δ sak转入大肠杆菌bl21感受态细胞中，得到重组大肠杆菌；4)将重组大肠杆菌接种于lb培养基中进行摇瓶培养，当菌液吸光度值达到0.6时，在 30°c条件下用1 mm iptg诱导4 5小时，之后离心收集菌体细胞；5)用超声波破碎菌体细胞，功率200-300w;处理时间6x9 sec,9 sec间隔；处理后，6000 rpm离心10 min，去除不溶性细胞碎片，收集上清液；6)将上清液过ni-nta亲和层析柱，经梯度洗脱和浓缩除盐，得到嵌合蛋白 his-asec2-asak，其氨基酸序列如seq id no. 10所示；7)嵌合蛋白his-δ sec2- δ sak经过肠激酶切割，再次过ni-nta亲和层析柱，得到嵌合蛋白asec2-a&ik，其氨基酸序列如seq id n0. 12所示。
4.权利要求1所述的低免疫原性嵌合蛋白在制备抗肿瘤溶栓药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及低免疫原性抗肿瘤溶栓双效嵌合蛋白及其制备方法和应用。本发明嵌合蛋白的氨基酸序列如seqidno.11或如seqidno.12所示。本发明的嵌合蛋白使n端缺失10个氨基酸的金葡球菌激酶δsak及n、c端分别缺失10、132个氨基酸的金葡球菌肠毒素δsec2嵌合在一起，并使两者之间无任何连接肽，所构建的嵌合蛋白δsec2-δsak和δsak-δsec2分子量大大降低，去掉了具有较高免疫原性的氨基酸序列，解决了嵌合蛋白分子量大和高免疫原性的问题，同时抗肿瘤和溶栓的功能得以保留。
文档编号c07k19/00gk102492043sq201110441070
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者崔小进, 林家帅, 胡风庆 申请人:辽宁大学