一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肺癌检测领域，特别设及一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测 方法。
【背景技术】
[0002] 肺癌，又称原发性支气管癌，是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，其死亡率居 各类恶性肿瘤之首。世界卫生组织预测，到2025年中国每年将有超过一百万新发病例， 从而极大地危害了我国人们的生命安全和身体健康。研究认为，肺癌的总5年生存率仅 10% -16%，i期患者的5年生存率可达65-75%，而ii~iv期病人总的5年生存率则从 40%下降到5%。由于肺癌的发病原因及发病机制极为复杂，且临床表现具有个体差异，多 数患者就诊时已发展至晚期，因此早发现、早诊断、早治疗对延长肺癌恶性肿瘤患者生存期 和降低死亡率有着重大意义。
[0003] 肺癌的发生和发展是一个非常复杂的多因素、多阶段调控异常的过程，是遗传学 与表观遗传学共同作用的结果。遗传学调控是指核巧酸序列的改变，包括碱基的突变、缺 失、插入、重组等；而表观遗传学调控主要通过dna甲基化和组蛋白修饰等方式来影响基因 转录活性。dna甲基化是指在dna甲基转移酶的作用下，s-腺巧甲硫氨酸的甲基（-c册）共 价结合到dna分子的胞喀晚（c)碱基的5位碳原子上，形成5-甲基胞喀晚巧mc)，但并不改 变dna的序列。近年来的研究表明，肺癌的发生发展与抑癌基因启动子区cpg岛甲基化导 致的抑癌基因表达失活有关，且其可能发生在肺癌的早期，是一个很有潜力的早期诊断肺 癌的分子指标。因此，联合检测多个基因启动子的甲基化状态，对肺癌的诊断、治疗、预后判 断等方面具有重要意义。
[0004] 目前，甲基化的检测方法主要有甲基化特异性pcr、亚硫酸氨盐测序法和甲 基巧光法。然而运些方法存在操作繁琐、假阳性率高、成本较高等缺点，限制了其在临 床实验室的广泛应用。近年来发展的高分辨率溶解曲线技术[wojdacztk，dobrovic a.methylation-sensitivehighresolutionmelting(ms-hrm):anewapproach forsensitiveandhigh-throughputassessmentofmethylation.nucleicacids res. 2007 ;35 (6):e41]、[mighelif,stoccoroa,coppedef,etal.comparisonstudyof ms-hrmandpyrosequencingtechniquesforquantificationofapcandcdkn2agene methylation.plosone. 2013 ;8 (1) :e52501]是将pcr扩增和溶解曲线分析结合在一起，由 于目的片段的微小序列差异引起pcr溶解溫度的改变，从而可w对基因突变、基因分型、基 因甲基化等进行检测。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测 方法，采用该标志物进行联合检测具有快速、高通量、灵敏和特异性好等特点，检测方法不 仅适用于肺癌早期的检测，也可w用于肺癌晚期的检测，具有良好的应用前景。
[0006] 本发明的一种肺癌早期检测用甲基化标志物，所述甲基化标志物包括pcdhgb6、 h0xa9、mgmt和microrna-126。
[0007] 所述pcdhgb6上游引物序列如seqidno. 1所示，下游引物序列如seqidno. 2 所示；
[000引所述册xa9上游引物序列如seqidno. 3所示，下游引物序列如seqidno. 4所 示；
[0009] 所述mgmt上游引物序列如seqidno. 5所示，下游引物序列如seqidno. 6所 示；
[0010] 所述microrna-126上游引物序列如seqidno. 7所示，下游引物序列如seqid no. 8所示。
[0011] 沈q1 :5-aatttgagggggatgtatattt-3(沈qidno. 1);
[0012] 沈q2 :5-aaaatcccaaaccaaaaact-3(seqidno. 2);
[0013] 沈q3 :5-gagttgtggttgtttttttttg-3(沈qidno. 3);
[0014] 沈q4 :5-acctttcaaaactccttcctc-3(seqidno. 4);
[0015] 沈q5 :5-gcgtttcggatatgttgggatagt-3(沈qidno. 5);
[0016] 沈q6 :5-aacgacccaaacactcaccaa-3(seqidno. 6);
[0017] 沈q7 :5-tgggttggtttttgttagg-3(seqidno. 7);
[0018]seq8 ：5-taaccctcacctactccacaa-3(seqidno. 8)〇
[0019] 所述甲基化标志物组成试剂盒，其中试剂盒还包括：1xmaster和25mmmgclz。
[0020] 所述试剂盒还包括：阳性对照和阴性对照。
[0021] 本发明的一种肺癌早期检测用甲基化标志物的检测方法，包括如下步骤：
[0022] (1)从待检组织中提取dna，并对样本dna、标准品dna分别进行修饰处理，转化后 的dna(至少20ng)用水溶解后，作为pcr的模板；
[002引 似按照pcr体系比例加入基因的一对引物、master、mgcl2,使得每对引物、mgclz 的终浓度分别为lum、4mm;随后进行pcr扩增，依据不同甲基化比例的标准品dm的解链溫 度差异做标准曲线，然后依据样本的pcr结果，用标准曲线得到样本的相对甲基化水平。 [0024] 所述步骤似中的pcr扩增条件为：95度变性，lomin;45cycles，95°c10s，从62°c 到 5tc10s，72°c20s;95°clmin，4(tclmin，65°c升溫至 94°c。
[00巧]本发明采用的技术：在基因的启动子区设计一对特异性的甲基化检测的引物，然 后用该引物去扩增硫化样本dna，根据pcr扩增结果的相对巧光值来确定待测样本的甲基 化水平。
[0026] 有益效果
[0027] 与常规的肺癌诊断方法相比，采用本发明的标志物进行联合检测具有快速、高通 量、灵敏和特异性好等特点，检测方法不仅适用于肺癌早期的检测，也可w用于肺癌晚期的 检测，该方法可w使肺癌病人早发现、早治疗、延长生存期，从而提高肿瘤病人的生活质量， 具有良好的应用前景。
【附图说明】
[002引图1为四个基因w标准品dna为模板的pcr结果绘制的标准曲线；其中，a为 h0xa9,b为pcdhgb6,c为mgmt，d为mir-126;
[0029] 图2为四个基因（pcdhgb6、h0xa9、mgmt和microrna-126)在肺癌组织和远端正常 组织的甲基化检测结果分布。
【具体实施方式】