一种肺癌诊断标志物、抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤免疫学领域。本发明涉及一种新型肺癌肿瘤标志物n3g4,以及抗 n3g4的单克隆抗体lc128。细胞和组织学水平证明：lc128特异性识别人肺癌细胞及人肺 癌组织。本发明还涉及一个免疫磁珠法检测人肺癌的方法。该检测方法所检测的抗原为 本发明中的人的肺癌新型标记物n3g4,检测抗体为本发明中抗人肺癌n3g4的单克隆抗体 lc128〇
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前我国最常见的恶性肿瘤之一。我国肺癌的发病率与死亡率正逐年增 高。全国肿瘤登记中心2014年发布的数据显示，2010年，我国新发肺癌病例60. 59万，居恶 性肿瘤首位，占恶性肿瘤新发病例的19. 59%。并且多数患者发现时已是晚期，失去早期治 疗的机会。肺癌主要有小细胞肺癌（small cell lung cancer，sclc) (16.8% )和非小细 胞肺癌（non-small cell lung cancer, nsclc) (80.4% )两种类型。非小细胞肺癌主要有 三类：鳞状细胞癌、肺腺癌和大细胞肺癌。其中肺腺癌是最常见的肺癌形式（30% -65% )。 肺癌的病因至今尚不完全明确。
[0003] 如何实现肺癌的早期诊断和治疗是当今医学界肺癌研宄的热点课题。据统计， 早期非小细胞肺癌的5年生存率高达80%，而非小细胞肺癌总的5年生存率仅为15% (mu1shine jl, sullivan d. clinical p ractice. lung cancer screening[j]. n engl j med, 2005, 352 (26): 271422720.)。可见，肺癌的早期诊断和治疗显得极其重要。目 前用于肺癌的诊断方法主要有：痰细胞学检查、影像学检查、内窥镜检查以及活组织检 查。痰细胞学具有极低的灵敏度。肺癌的影像检查方法主要包括：x线胸片、ct、磁共振 成像（magnetic resonance imaging, mri)、超声、核素显像、正电子发射计算机断层扫描 (positron emission tomography/computed tomography，pet_ct)等方法，但影像学检查 也是相对不灵敏的，要求病变大小大于1厘米才可见。内窥镜检查要求肿瘤在内窥镜可靠 近的气道内可见。虽然目前最公认的诊断方法是低剂量的胸部ct，但灵敏度也有局限，与x 线胸片一样，ct涉及电离辐射，其自身也引起癌症。
[0004] 但由于早期患者症状不典型，诊断率仅为15% (祝晋芳等，肺癌血肿瘤标志物早 期诊断研宄进展[j].医学综述，2010, 16 (7): 1015-1018)。传统的肺癌筛查方法由于其特 异性及灵敏性有限，再加上过程痛苦、费用高等缺点使高危人群的依从性差，因此传统的肺 癌筛查方法并没有降低肺癌的病死率。因此，需要可以替代或补充传统肺癌筛查的方法，以 提高肺癌早期的诊断率，以及减少外科手术的次数以降低手术并发症的危险。近年来，肿瘤 标志物由于其特异性和灵敏度高等特点，对肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗具有提供 指导意义。有研宄表明整合素0 1参与肺癌细胞的侵袭和转移（宫雪，陈骊珠等，整合素与 肿瘤侵袭和转移的研宄进展[j]. 2007, 23(15) =2288-2289.)。整合素是由a、0两个亚基 构成的异源二聚体，其功能涉及细胞与基质、细胞与细胞的粘附，参与细胞信号转导，调节 的细胞增殖与凋亡，以及肿瘤细胞的粘附、侵袭、转移和血管形成。整合素0 1亚基（⑶29) 与a 3亚基（⑶49c)结合形成二聚体。整合素a 30 1主要街道细胞与细胞外基质成分直 接的粘附，此外整合素a 30 1的异常修饰导致肿瘤细胞恶性程度的改变。因此发现新型整 合素修饰形式对于肺癌的诊断和治疗具有积极的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明利用新鲜的人肺癌组织免疫小鼠，获得杂交瘤细胞株。用elisa的方法 筛选到一株能与人肺癌组织高度特异结合的抗体lc128,属于iggl亚类。免疫组织化学 和流式细胞术证实，lc128抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系a549、calu-3、nci-h1975、 nci-h460、sk-lu-1、nci-h157呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺癌细胞无交叉 反应。
[0006] 本发明通过免疫沉淀结合质谱与糖芯片结果鉴定，lc128抗体识别的抗原是一种 异常糖基化的整合素0 1亚基，其定位于细胞膜上，其表位为： neu5ac a 2_6glcnac 0 l_3gal 0 l_3glcnac 0 l_3gal 0 1 属于全新的肺癌标志物。
[0007] 本发明将lc128抗体偶联纳米磁颗粒，制备成抗肺癌免疫磁珠（lc128-mb)。将其 与病人胸腔积液混合，捕获并富集脱落的肺癌细胞，经瑞氏吉姆萨病理染色，在显微镜下进 行诊断。该试剂盒适用于肿瘤病人的早期筛查、预后监测及病理辅助诊断。
[0008] 本发明的创新性在于：（1)筛选并制备了一种抗人肺癌的单克隆抗体lc128,该 抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系 a549、calu-3、nci-h1975、nci-h460、sk-lu-1、nci-h157 呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺癌细胞无交叉反应；（2)揭示了 lc128抗体识 别的抗原表位为 neu5ac a 2-6glcnac 0 l-3gal 0 l-3glcnac 0 l-3gal 0 1，为全新的肺癌标志物；（3) 开发了一种基于lc128抗体的高灵敏度的用于检测人肺癌的免疫磁珠方法。 发明详述
[0009] 本发明提供了一种全新的人肺癌肿瘤标志物一异常糖基化的整合素0 1亚基， 命名为n3g4。并获得了产生抗n3g4的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株分泌 产生了单克隆抗体lc128,单克隆抗体lc128识别的抗原表位为他1154〇(12-661〇嫩(^1-3gal 0 l-3glcnac 0 l-3gal 0 1。该单克隆抗体与人肺癌组织和肺癌细胞系a549、calu-3、 nci-h1975、nci-h460、sk-lu-1、nci-h157呈强阳性反应，而与人正常肺组织和其它非肺 癌细胞无交叉反应。本发明还提供了基于单克隆抗体lc128的体外肺癌诊断的免疫磁珠 (lc128-mb)诊断方法。
[0010] 更具体地，本发明的一个目的是提供了一种异常糖基化的人肺癌肿瘤标志物 n3g4,其为异常糖基化的整合素整合素m亚基，其特征是在m亚基上包含抗原表位的糖 结构 neu5ac a 2_6glcnac 0 l_3gal 0 l_3glcnac 0 l_3gal 0 1。
[0011] 在一个优选方案中，所述整合素整合素0 1亚基的氨基酸序列如seq id no: 1所 不〇
[0012] 本发明的另一个目的是提供针对本发明所述的人肺癌标志物n3g4的抗体，其能 够特异性识别所述作为抗原表位的糖结构neu5ac a 2-6glcnac 0 l-3gal 0 l-3glcnac 0 1-3 gal |3 1，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
[0013]本发明的另一个目的是提供一种用于检测人肺癌的试剂盒，其包含本发明上述的 抗体lc128。一个优选实施方案中，所述的抗体是抗人肺癌n3g4的单克隆抗体lc128,该单 克隆抗体由保藏号为cgmcc no. 10414的杂交瘤细胞株分泌。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种缀合物，其中包含所述抗人肺癌n3g4与选自以 下组分组成的物质缀合：生物标记物、抗肿瘤药物、毒素和放射性活性剂。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种用于检测或治疗人肺癌的试剂盒，其中包含本发 明上述的抗体。
[0016] 在一个优选实施方案中，在所述的试剂盒中，所述的检测是通过单克隆抗体 lc128偶联纳米磁颗粒进行，优选将lc128抗体偶联纳米磁颗粒，制备成抗肺癌免疫磁珠 (lc128-mb)。在一个优选实施方案中，所述待测样品是含人肺癌脱落细胞的人胸腔积液或 痰液。
[0017] 本发明的另一个目的是提供分泌抗人肺癌n3g4的单克隆抗体lc128的杂交瘤 细胞株，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (cgmcc)，保持地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，其保藏 号为cgmcc n0. 10414,其分类命