一种肺癌新肿瘤标志物gsta1及其筛选方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种可用于肺癌诊断和治疗的新肿瘤标志物gsta1及其筛选方法和应用，属于分子生物学和医学领域。该标志物是在前期利用噬菌体随机肽库筛选技术获得的新肺癌特异性结合多肽的基础上，以该多肽为探针从肺癌cdna文库中筛选出肺癌相关抗原gsta1。肺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最初阶段涉及到许多肺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样，从外周血和痰液中检测肺癌特异性分子标志物的变化，具有简便、快捷、痛苦小、易复查等优点，容易为病人接受，对肺癌的临床诊治具有重要意义。本发明可为肺癌诊断和靶向治疗提供分子标志物，为肺癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种肺癌新肿瘤标志物gsta1及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子标记【技术领域】，更具体地，涉及一种肺癌新肿瘤标志物gstal及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002]肺癌目前是全球范围内最常见、致死人数最多的恶性肿瘤之一，也是我国第一大癌症，其发病率及死亡率增长最为迅速。由于肺癌起病隐匿，其诊治情况远不令人满意，咎其原因主要在于缺乏早期诊断的手段和有效治疗方法。患者出现症状时多为晚期，预后较差，总的五年生存率不超过15%，有症状者< 10%。但早期确诊的肺癌患者，手术治疗的预后较中晚期肺癌明显改善，其生存率可达70%。由此可见，要降低肺癌病人的死亡率除了在病因预防上降低发病率外，提高早期诊断水平和药物治疗的疗效是两个重要方面。然而，肺癌的早期诊断一直是一个世界性难题，目前影像诊断(x线、ct和mri)，化学诊断(癌反应，血清学和免疫学指标)及组织细胞学诊断是肿瘤诊断的三大支柱，前者在亚临床期诊断上有很大局限性，后二者均以肿瘤标志物作为观察指标，可以比影像诊断更早发现肿瘤的存在，具有高效、高灵敏性、方便、标本易获取及创伤小等优点，因此，在肺癌早期诊治研究中，筛选及鉴定高特异性的肺癌肿瘤标志物一直是研究的重点和难点。
[0003]所谓肿瘤标志物，是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞生物合成、释放或者是肿瘤与宿主相互作用而产生的一类物质，反映着肿瘤的存在和生长。我们可通过利用化学、免疫、分子生物学等技术对血液或分泌物进行定性或者定量的检测，通过对其分析，帮助我们从正常组织中区别肿瘤或者测定肿瘤细胞核、细胞质以及对细胞膜上的特性进行分析，以此作为辨别肿瘤细胞的标志。肺癌的发生与发展具有十分复杂的机制，其发病的最初阶段涉及到许多肺癌相关基因及其表达的改变，在致癌因素的作用下患者体内可表达多种粘附分子及其受体或配体，在肿瘤发展的不同时期其释放标志物含量也不一样，从外周血和痰液中检测肺癌特异性分子标志物的变化，具有简便、快捷、痛苦小、易复查等优点，容易为病人接受，对肺癌的临床诊治具有重要意义。
[0004]目前比较有代表意义的肺癌肿瘤标志物主要有以下几类:1)胚胎抗原:以癌胚抗原(cea)为代表；2)糖蛋白类抗原:包括糖类抗原19-9(ca19-9)、糖类抗原125(ca125)、糖类抗原153 (ca153)、鳞状细胞抗原(scc-ag)等；3)角蛋白类抗原:包括细胞角蛋白19片段抗原(cyfra21-1)、组织多肽特异性抗原(tps)等；4)酶类抗原:包括同工酶类，如胃泌素释放肽前体(progrp)、神经元烯醇化酶(nse)、乳酸脱氢酶(ldh)、基质金属蛋白酶(mmps)、肿瘤m2型丙酮酸激酶(tum2-pk)等；5)瘤基因及抑瘤基因蛋白产物及抗体:如p53和抗p53抗、c-erbb-2 及 bcl_2 蛋白。
[0005]尽管已经发现上述肺癌相关的肿瘤标志物，然而这些指标绝大多数是无器官特异性的，它们并非肺癌特异性抗原，而是肿瘤相关物质，不但存在于恶性肿瘤中，也存在于良性肿瘤、胚胎组织，甚至正常组织中，对肺癌的诊断缺乏特异性，只有参考价值。另一方面，由于肺癌组织病理的多样性、同种病理肿瘤细胞的异质性和肿瘤生物学行为的复杂性及多态性，造成单一标志物检测对肺癌的诊断价值有限，只能反映了疾病某些侧面的变化，国内外众多学者倾向于筛选多种有价值的肿瘤标志物进行联合检测，以提高肺癌诊断的阳性率。虽然联合检测优于单项检测已成共识，但并非任意一种组合均能提高临床诊断的阳性率，在最佳组合上结论颇不一致，甚至出现相反的结果。因此，寻找一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于肺癌临床诊治的生物标志物已成为肺癌研究中亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于肺癌临床诊治的生物标志物。
[0007]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的。
[0008]一种肺癌肿瘤标志物gstal，所述标志物是在前期利用噬菌体随机肽库筛选技术获得的新肺癌特异性结合多肽的基础上，以该多肽为探针从肺癌cdna文库中筛选出来的。
[0009]本发明的的研究主要包括四个方面的内容:gsta1的筛选，gstal的肺癌细胞特异性鉴定，gstal的亚细胞定位，gstal与肺癌细胞生长的关系。
[0010]具体的技术方案如下:
将肺癌特异性结合多肽通过化学合成方法偶联生物素(b1tin)，并固相化到经过亲和素(avidin)处理过的elisa反应板(b1tin和avidin可以牢固结合),通过固相化多肽对t7 select人类肺癌cdna噬菌体展示文库进行3轮减性筛选，寻找与多肽结合的肺癌相关抗原，发现其中一序列与gstal具有同源性。
[0011]采用real- time pcr检测mrna表达水平、采用western blot及细胞免疫突光分析蛋白质表达水平，检测gstai在常见肿瘤(人肺癌细胞ltep-a2、spca1、nc1-h460、nc1-h1299、nc1-h1650、a549，人骨肉瘤细胞mg-63，人肝癌细胞h印g2、bel-7402，人宫颈癌细胞hela)和肺正常细胞mrc-5的基因和蛋白质表达谱，证实与mrc-5细胞对比，癌细胞的gstal的表达显著增加，特别是肺癌a549细胞无论是在mrna水平还是在蛋白质水平，其表达量远高于其他细胞。
[0012]采用细胞免疫荧光技术，同时结合hoechst33258和dii染色法，利用激光共聚焦扫描显微镜进行gstal的亚细胞定位，证实gstal主要在细胞浆和/或细胞膜中表达。
[0013]根据sirna设计原则设计、化学合成针对新标志物的sirna，借助脂质体转染上述肺癌细胞，观察对其生长的影响，rt-pcr和western blot检测标志物的表达情况，mtt、srb法检测细胞增殖能力的变化，hoechst 33258染色法检测细胞凋亡情况，流式细胞仪分析细胞凋亡情况。证实沉默gstal可以通过促使a549凋亡，从而抑制其增殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1.倒置荧光显微镜下观察不同细胞gstal的表达情况(200x);a为a549细胞；b 为 bel-7402 细胞；c 为 nc1-h1299 细胞；d 为 nc1-h1650 ；e 为 hela 细胞；f 为 ltep-a2 细胞；g为mg-63细胞；h为spcal ； i为mrc-5细胞。
[0015]图2.gstal在不同癌细胞和肺正常细胞mrc-5中表达量的不同；a为不同细胞中gstal的mrna的相对表达量；b为不同细胞中gstal的蛋白的相对表达量；*p〈0.05 ；**ρ〈0.01 ，癌细胞组 vs.mrc-5 组。
[0016]图3.激光共聚焦显微镜下观察a549细胞和mrc-5细胞gstal的表达情况，a为a549细胞，b为mrc-5细胞。
[0017]图4.gstal沉默后对a549细胞增殖的影响；*p〈0.05，**p〈0.01，实验组vs.1ipo 组。
[0018]图5.a549细胞gstal沉默后细胞核凋亡情况。
【具体实施方式】
[0019]下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本【技术领域】常规试剂和设备。当然实施例中仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。另外，实施例中未详细说明的分子生物学方法均为本领域常规的方法，具体操作可参看分子生物指南或产品说明书。
[0020]实施例1
gstal的肺癌特异性验证
将细胞 a549、spcal、nc1-h1650、nc1-h1299、ltep-a2、bel-7402、hela、mg-63 和肺正常细胞mrc-5以i x 14个细胞/孔接种于96孔板中，24h后采用4%多聚甲醛室温固定15min，
0.5%吐温透化lomin，0.4% 二抗来源血清室温封闭lh，一抗4度孵育过夜，pbs洗涤充分后，二抗孵育lh，全程闭光操作，pbs洗涤后，采用倒置荧光显微镜下观察。
[0021]结果如图1所示，通过显微镜观察染色结果可见，不同癌细胞的绿色荧光强于比正常细胞mrc-5，由此说明gstal在癌细胞中的表达量远高于肺正常细胞。
[0022]实施例2
根据标志物的orf序列分布设计和合成上下游引物，用trizol提取不同癌细胞中的mrna，采用real- time pcr分析肺癌标志物gstal在不同癌细胞中的表达情况；提取上述细胞的总蛋白，进行western blot分析肺癌标志物gstal在不同细胞中的的蛋白质表达情况。
[0023]结果如图2 所示，不同癌细胞(ltep-a2、spcal、nc1-h460、a549、!fepg2)的 gstal在mrna表达水平和蛋白表达水平远高于肺正常细胞mrc-5，特别是a549细胞，其表达量远高于其他细胞。
[0024]实施例3 gstal的亚细胞定位
将a549细胞和mrc-5细胞以i x 15个细胞/孔接种于激光共聚焦专用培养皿中，培养24h后，4%多聚甲醛室温固定15min，0.5%吐温透化lomin，0.4%驴血清室温封闭ih后，gstal 一抗4度孵育过夜，i xpbs洗4次，每次7分钟；二抗室温孵育lh，i xpbs洗4次，每次7分钟；hoechst33258室温孵育15min，i xpbs洗4次，每次5分钟；dii室温孵育15min，pbs充分洗涤后激光共聚焦显微镜观察。
[0025]结果如图3所示，hoechst33258进行细胞核染色，dii为细胞膜红色荧光探针，gstal绿色荧光主要在胞浆表达，且a549细胞gstal的表达量高于mrc-5细胞，gstal绿色荧光与细胞膜红色荧光叠合，可以说明gstal在胞浆和/或胞膜表达。
[0026]实施例4 采用脂质体法将小干扰rna (sirna-1)转染至a549细胞，其中sirna-nc为gstal序列无同源性的阴性对照。rt-pcr和western blotting验证其沉默效果后，将上述gstal沉默的a549细胞以i x 14个细胞/孔接种于96孔板中，再添加200ul0pti_mem培养基，gstal分别干扰i天，2天,3天,4天,5天后添加20ul的5mg/ml的mtt,培养4h,在570nm波长下，用酶标仪测定各孔的吸光度值。以iipo组为空白对照，计算细胞存活率:细胞存活率(％)=(od处理-od空白)/ (0d对照-od空白)x 100%
结果如图4所示，gstal沉默5天后细胞的存活率只有51%，其a549细胞存活率随着时间的增加而降低，且具有时间的依赖性。
[0027]实施例5
将gstal沉默的a549细胞接种于48孔板中，37度，5�2分别培养i天，2天，3天，4天，5天后，用pbs洗涤2次后加入4%的多聚甲醛液固定20 min，吸尽固定液后，随即加入200ul hoechst 33258 (5 mg.γ1)染色液，避光反应 lomin，pbs 洗 3 次，每次 7min，自然风干，置于导致荧光显微镜下以340nm激发光观察并随机拍照，实验重复3次。
[0028]结果如图5所示，倒置荧光显微镜下观察，没有gstal沉默的细胞胞核大，荧光染色浅，且亮度均一，呈淡蓝色。而gstal沉默组可见细胞形态呈现变化，细胞核固缩、着色深而成亮蓝色、可见浓染致密的颗粒块状荧光，且随着时间的增加，变化更加明显。由此可见，gstal表达下调可促进细胞凋亡。
[0029]实施例6
将gstal沉默的a549细胞以9 x 16个细胞/孔接种于60mm的培养皿中，37度，5�2培养72h后，收集悬浮细胞和贴壁细胞，离心(2000rpm，5min),弃上清液，用pbs洗涤2次后加入500ul的binging buffer悬浮细胞,加入5ul的annexin v-fitc,混勻后，加入5ul的propidium 1dide (pi )，混匀，避光反应5min，于流式细胞仪进样检测，并以仪器所配软件进行数据处理，计算细胞凋亡率。
[0030]流式细胞术检测a549-sirna，a549-nc和a549组细胞的总凋亡率分别为:(9.42±0.22)%，(1.2±0.1)%，(0.02±0.03)%，p〈0.5 vs α549 细胞组，gstal 沉默组的总凋亡率高于对照组和nc组，即gstal表达下调可促进细胞凋亡。
【权利要求】
1.gstal在作为肺癌诊断和靶向性治疗的肿瘤标志物的应用。
2.—种诊断和靶向性治疗肺癌的肿瘤标志物，其特征在于，所述标志物为gstal蛋白。
3.根据权利要求2所述的诊断和靶向性治疗肺癌的肿瘤标志物，其特征在于，gstal在胞浆和/或胞膜表达。
4.gstal表达下调在促进细胞凋亡中的应用。
【文档编号】g01n33/68gk104198722sq201410391515
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】潘雪刁, 臧林泉, 杨周萍 申请人:广东药学院