一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及剪切聚合反应和环介导反应，是一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。
【背景技术】
[0002]癌症是全球性的医学难题，卫生部报告:我国每年新发癌症病例220万，因癌死亡160万，防治癌症的任务异常艰巨。防治癌症的最好办法是早期诊断、早期治疗。但是目前所使用的检测方法存在特异性和灵敏度不够高，容易导致假阳性和假阴性结果。因此迫切需要构建高灵敏的检测方法，进行关键技术的攻关创新。
[0003]肿瘤标志物是反映肿瘤存在和生长的化学物质，临床上通过对这些化学物质的检测，可以对相应肿瘤作早期诊断、疗效评估和预后判定。目前，有多种肿瘤标志物应用于临床，但大多数标志物仍然缺乏足够的组织特异性和肿瘤特异性。
[0004]微小核糖核酸(microrna)是近年来发现的一种内生的、非蛋白编码的核糖核酸，长度约为22个核苷酸左右,可通过转录后调控祀基因的信使核糖核酸(mrna)的翻译，在基因表达调节方面扮演着重要的角色。随着microrna研究的深入，大量文献报道microrna与肿瘤的发生发展有着密切关系，所以microrna作为一种有潜力的肿瘤标志物，可以用来进行癌症的早期诊断。microrna的检测不仅对于microrna的生物功能的研究,而且对于临床诊断都具有重要的意义。let7a作为较早被发现的let7 microrna家族中的一种已被证实参与多种肿瘤的细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为，包括肺癌、卵巢癌和淋巴瘤等。
[0005]目前，let7a的检测方法主要有:rna印迹法、微阵列法、纳米粒子标记法、生物荧光法、电化学方法等。这些方法普遍存在的问题是，灵敏度不高，特异性不够高，因为let7a存在同源的多种microrna，如let7b、let7c、let7d等，它们的结构与let7a只差一个或者几个碱基，不容易区分。本方法利用脱氧核酶剪切，解决特异性的问题；利用多重放大技术，解决灵敏度的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，该方法具有选择性好、灵敏度高等特点，适用于肿瘤标志物let7a的检测。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，操作如下:
(1)磁珠连接的脱氧核酶(dnazyme)与let7a杂交。在一定条件下，let7a被剪断。一段进入溶液，剩余的杂交的let7a部分，可以在聚合酶和剪切酶的作用下进行剪切聚合反应，产生大量的单链脱氧核糖核酸1 (s1);
(2 )在(1)的基础上产生的s1可以与另一连接磁珠的单链脱氧核糖核酸2 (s2 )杂交，进行下一个剪切聚合的循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸3 (s3)；
(3)在(2)的基础上产生的s3，55-60°c下，加入单链脱氧核糖核酸4 (s4)、模板(s5)和聚合酶可以弓i发环介导反应，产生大量的带茎环结构的dna ； (4)加入荧光试剂sybr-1，嵌插入(3 )中产物中，可以进行荧光检测。
[0008]本发明的优点:
1、本发明选择与let7a杂交的脱氧核酶，可以实现高的选择性，let7a同源家族的microrna很难剪断，避免干扰。
[0009]2、将磁珠引入步骤(1) (2)中，方便进行磁分离。
[0010]3、采用多重放大技术，let7a的检测限可低至10 lsmol/l。
【附图说明】
[0011]图1为检测let7a的原理图。图中，s3是两次聚合剪切得到产物，用来作为环介导反应的引物1，s4是另外加入的环介导反应的引物2。环介导反应的温度是55-60°c。
【具体实施方式】
[0012]以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。
[0013]实验条件:
荧光分光光度计，磁珠，荧光试剂sybr i，phi29 dna聚合酶、bst聚合酶，tris-hcl缓冲液、depc处理的水等。
[0014]具体操作过程:磁珠接dna:磁珠1接let7a脱氧核酶，磁珠2接s2。
[0015]羧基化的磁珠，用缓冲液洗三次，加入imidazol-hcl和edc活化磁珠的羧基，37°c,30min ;用？83 buffer洗三次，重新悬浮，加入氨基化的dna，37°c过夜；用？83 buffer洗三次，重新悬浮在pbs buffer中，4°c贮存待用。
[0016]37°c，在pbs缓冲液中，实现接let7a脱氧核酶与let7a的杂交，实现let7a链的剪切，从剪切处开始聚合反应，开始实现剪切聚合的重复反应，产生大量的s1 ；
如图1所示，产生的s1会和接磁珠的s2杂交，加入dna聚合酶，进一步发生剪切聚合反应，产物是s3 55°c下，体系中加入两端带茎环结构的模板，bst聚合酶，dntps，缓冲液，s3会沿着模板进行链取代，然后加入另一引物s4，会持续不断的引发链取代反应，产生大量的带由单链折叠而成的双链结构的dna。加入荧光染料sybr green i。这是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，sybr green i发出微弱的突光，但一旦与双链dna结合后,突光大大增强。可以根据突光信号检测出体系存在的双链dna数量。sybr green i的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
【主权项】
1.一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a检测方法，其特征在于: (1)磁珠连接的脱氧核酶，能够特异性的切断与之杂交的靶let7a，避免同源微小核糖核酸的干扰； (2)在(1)的基础上进行剪切聚合循环，产生大量的单链脱氧核糖核酸； (3)在(2)的基础上，引发环介导反应，产生大量带茎环结构脱氧核糖核酸； (4)在(3)的基础上,嵌插突光试剂，进行突光信号的检测。2.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:采用磁珠连接脱氧核酶和单链脱氧核糖核酸进行剪切聚合的循环，方便进行分离。3.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:剪切聚合反应的温度为37°c，环介导反应的温度在55-60°c。4.按照权利要求1所述基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法，其特征在于:嵌插的荧光试剂为核酸染料sybr green i。
【专利摘要】本发明描述了一种基于多重放大技术的肿瘤标志物let7a的检测方法。利用磁珠连接的脱氧核酶与目标物let7a杂交后，可以切断let7a；利用切断后的产物，进行两次剪切聚合的循环，实现信号的放大；利用剪切聚合后的产物进行环介导放大反应，嵌插荧光试剂进行荧光检测，可以计算let7a的浓度。该方法选择性好，灵敏度高，是检测肿瘤标志物let7a的理想方法。
【ipc分类】c12q1/68
【公开号】cn105274194
【申请号】cn201410749658
【发明人】郑向江, 吴从从, 张书圣
【申请人】临沂大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年12月10日