专利名称：：卵巢癌的检测方法及抑制方法
技术领域：
：本发明涉及一种以通过观察卵巢癌的基因型对卵巢癌进行初期诊断为目的，通过检测特定染色体区域中存在的基因的变化来检测癌症的方法。
背景技术：
：卵巢癌(ovariancancer(oc))多发于50岁-70岁的女性，在妇科癌症中为排名第2位的多发性癌症，已知由卵巢癌引起的死亡人数多于其它的妇科癌症。卵巢癌有多种类型，分别是由卵巢中不同类型的细胞产生的，但是约80%以上的卵巢癌为在卵巢的表面上发生的上皮癌。近年，尽管用于卵巢癌的诊断和治疗的方法一直在发展，但是到目前为止仍然难以作到早期诊断。为此，强烈期望找到卵巢癌的致病基因并阐明其功能，从而建立起一种用于探索有效的治疗和诊断标记、进行化学预防的新型战略性见解。
发明内容发明所要解决的问题如果能够阐明来源于卵巢、主要是来源于卵巢上皮的细胞发生癌化时在基因水平上的机制，就能够在基因水平上发现来源于卵巢的细胞发生癌化、对卵巢癌的恶性程度进行诊断以及对卵巢癌的发展进行控制，进一步，就应该能够根据该机制来筛选、开发药物或确立治疗的方法。具体来说，可以认为，通过鉴定出在卵巢癌中显示特征性行为的基因，并以该基因为中心进行技术上的研究，从而可以解决上述课题。即，本发明要解决的问题是鉴定出在卵巢癌等癌症中显示特征性行为的基因，从而提供一种癌症的检测方法及细胞增殖抑制剂。解决问题的手段比较基因组杂交技术(comparativegenomichybridization(cgh))是一种可用于解析伴随基因组中多个基因的扩增或缺失、或者基因失活所致的基因异常的简便、迅速、最佳方法。因此，为了解析与癌化和癌症恶化等有关的基因组上的基因异常，本发明人通过对在cgh阵列上载有的800种bac/pacdna进行了cgh阵列分析(mcgcancerarray-800;takadah.,etal"cancersci.96,100-105,2005)，成功地鉴定出了与促进源自卵巢的细胞癌化有关的癌基因，即，成功地鉴定了结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor(ctgf))基因。然后，又成功地发现，ctgf基因的缺失或者失活，即ctgf蛋白质的减少会显著地促进卵巢癌的增殖，而且，如果使ctgf基因的转录产物或蛋白质增加，卵巢癌的增殖会显著地降低，由此完成了本发明。艮p，根据本发明，提供一种癌症的检测方法，该方法通过检测存在于样本的染色体区域2ql4.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、llql3.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15ql2、15ql5.1、17pl2、17pl3.1、17pl3.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20ql3.13、20ql3.2、20ql3.31、20ql3.33、xpll.23、xpl3.1、xpl3.3、xp26.2、xp26.3、或xp28中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的癌化，并包括检测样本的癌化的恶性程度。优选的是，所述基因为gli2、ccnd1、fgf3、tgfbr2、cdkn2a、mtap、smad4、evil、muc4、ptpn1、znf217、bcas1、tfap2c、birc7、tnfrsf6b、vegfc、klf12、fgf14、efnb2、gabrb3、rad51、rh68621、pmp22、rcv1、hsxiapaf1、abr、hic1、madh4(smad4)、dcc、malt1、grp、serpinb5、fvt1、bcl2、serpinb3、bcl2、ctdp1、shgc-145820、ssx1、ar、mllt7、abcb7、gpc3、fgf13、magea2、kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、禾卩ctgf中的至少一个。优选的是，所述基因的变化为基因扩增、缺失和失活中的至少一种。优选的是，所述基因的变化是由cpg岛的甲基化而引起的失活。优选的是，在样本中，通过检测由权利要求2所述的基因所翻译的蛋白质的量来检测样本的癌化，并包括检测其恶性程度。优选的是，通过免疫组化方法来检测蛋白质的量。优选的是，通过检测ctgf基因的缺失或失活来检测样本的癌化，并包括检测其恶性程度。优选的是，所述样本为源自卵巢的组织。优选的是，所述癌症为卵巢癌。优选的是，采用dna芯片法、southern印迹法、northern印迹法、实时rt-pcr法、fish法、cgh法、或阵列cgh法、亚硫酸氢盐测序法、cobra法对所述基因的变化进行检测。本发明进一步还提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因、或者将作为该基因的表达产物的蛋白质，在体外导入到细胞中。本发明进一步还提供一种细胞增殖抑制剂，其含有kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因、或作为该基因的表达产物的蛋白质。本发明进一步还提供一种激活细胞增殖的方法，其包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。本发明进一步还提供一种细胞增殖激活剂，其含有kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。本发明进一步还提供一种物质的筛选方法，其为针对由于其中的kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的cpg岛被甲基化而导致基因表达被抑制的卵巢癌，使该卵巢癌与待测物质接触以检测所述基因的表达，当与未接触待测物7质的体系相比较，发现所述基因的表达增加时，可将该待测物质筛选为可以通过将所述基因的cpg岛脱甲基化而使该基因活化的抗肿瘤物质。发明效果根据本发明，可以切实地把握来源于卵巢的细胞样本是否发生癌化及其恶性程度。而且，在卵巢癌中，通过导入基因表达失活的ctgf基因的转录产物，从而可以抑制卵巢癌的增殖。而且，可以对作为由于ctgf基因表达失活而引发的卵巢癌的治疗剂进行筛选。在图1中，图1a表示24种卵巢癌细胞株中拷贝数的扩增与缺失在全部基因组中的频率。克隆基于ucsc作图位置(http:〃genome.ucsc.edu/[versionmay,2004])按照1-22、x、y染色体的顺序进行排列。星号表示确认有高水平扩增(log2比值x).4)、或有纯合缺失(log2比值《0.4)的区域(表1)。图1b表示在卵巢癌细胞株中的6q23.2染色体区域中确认有扩增。图1b的上部为rmug-s细胞株的代表性扩增的阵列cgh图像，6q23.2染色体区的bac克隆的纯合缺失可以由明显的信号得到确认(箭头)。图1b的下部为显示rmug-s细胞株的6q23.1-23.2的纯合缺失区域的图谱。用水平线表示的bac(rp11-69i8)在阵列cgh解析中为纯合缺失。rmug-s细胞株中纯合缺失的区域经基因组pcr确定，用白色双箭头表示。rmug-s细胞株中经基因组pcr确定的位于纯合缺失区域周围的10个基因、纯合缺失(8个基因)或残留基因(2个基因)用箭头表示。图1c表示卵巢癌细胞株中位于6q23纯合缺失区域周围的基因的基因组pcr和rt-pcr分析结果。图1c的上部为通过基因组pcr在一个卵巢癌细胞株中确认有ctgf、enpp1、enpp3、crsp3、arg1、akap7、epb41l2、kiaa1913的纯合缺失。1:ht、2:htoa、3:huoa、4:kf28、5:mh、6:ovkate、7:ovsaho、8:kfrl3、9:hmkoa、10:mcas、ll:rmug-l、12:rmug-s、13:kk、14:ovise、15:ovmana、16:ovtoko、17:rmg-i、18:rmg-ii、19:es-2、20:w3uf、21:hi0anu、22:hmoa、23:hnoa、24:htboa。图1c的下部为由rt-pcr确认卵巢癌细胞株、源自正常卵巢和源自正常卵巢上皮细胞的细胞株(ose-2a)中ctgf、enpp1、enpp3、crsp3、akap7、epb41l2、kiaa1913基因的mrna表达。箭头表示经基因组pcr分析显示出纯合缺失的细胞株。在多数的卵巢癌细胞株中，crsp3、akap7、epb41l2的mrna显示出或多或少的减少。而且，enpp1、enpp3、ctgf的mrna的表达高频率地消失。在23个细胞株中，因纯合缺失以外的原因而使ctgf基因表达减少的为12种(50%)。图1d为用5-aza-dcyd(5pm)处理5天/或用tsa(100ng/ml)处理12小时(经处理的为 、未经处理的为-)后的卵巢癌细胞株(hnoa和rmg-i)中ctgf基因的rt-pcr的分析结果。图2表示的是在卵巢癌细胞株和卵巢癌临床样本中ctgf的富含cpg区的甲基化状态。图2a为包括ctgf基因外显子1周围的cpg岛(白色箭头)在内的富含cpg区的概略图以及亚硫酸氢盐测序的代表性结果。cpg部位用竖线表示。外显子l用空白窗口表示，转录起始点标记为 1。启动子分析中所使用的片段用粗黑线表示。cobra和亚硫酸氢盐测序所确定的区域用灰线表示。用于cobra法的限制酶部位bstui用黑色箭头表示。还显示出了表达ctgf的卵巢癌细胞株( )和未表达ctgf的卵巢癌细胞株(-)中所检测的富含cpg区的亚硫酸氢盐测序的代表性结果。各白色和黑色的方块分别表示非甲基化和甲基化的cpg部位。每列来自一种克隆。用于msp的pcr引物用箭头表示。图2b表示的是bstui消化后的卵巢癌细胞株中ctgfcpg岛的cobra法检测的代表性结果。箭头表示甲基化cpg部位被特异性消化后的片段。箭头表示未被消化的片段中非甲基化的cpg。图2c表示的是ctgf富含cpg区的启动子活性。构建了pgl3空载体(mock)和包含cpg岛区域片段1-3不同序列的报告基因质粒。将这些构建体与内部对照载体(prl-htk)同时转化到rmug-s细胞、kk细胞、kf28细胞中。相对于对照物，将荧光素酶活性标准化。数据表示的是3个独立试验的平均值士sd。图2d中，上部左侧表示的是卵巢癌临床样本中ctgf启动子区域的msp分析的代表性结果。同时采用对于非甲基化(u)dna或甲基化(m)dna具有特异性的引物进行研究。图2d中，下部表示的是通过对肿瘤样本进行亚硫酸氢盐测序确定了ctgf启动子区域的甲基化状态。图2d中，上部的右侧表示的是除了粘液型肿瘤以外的43种卵巢癌临床样本中，由msp所确定的ctgf的甲基化状态和由rt-pcr所确定的mrna表达状态之间的相关关系。图3表示的是卵巢癌临床样本中ctgf表达的免疫组化分析。其中图3a表示的是正常人卵巢上皮细胞和卵巢癌临床样本中代表性的ctgf免疫化学染色。在图3a中，左侧表示的是在正常卵巢上皮细胞中可见到ctgf的高表达，中间和右侧表示的是在卵巢癌临床样本的癌细胞中可见到ctgf表达较高(中间)、或者几乎没有表达(右)的结果。在正常上皮细胞和卵巢癌细胞中，ctgf清楚地局部分布在细胞质的顶点。倍率为x200。图3b表示的是相对于卵巢癌患者的全体的存活率的卡普兰迈耶曲线。在图3b中，左侧表示的是在各期的肿瘤中，由免疫组化法确定为ctgf表达低的患者比ctgf表达高的患者显示出更好的存活率(p=0.128、log-rank检验)，中间表示的是在.i期和ii期的肿瘤中，由于ctgf表达高的患者组没有出现死亡，所以无法进行统计分析，但是，ctgf表达低的患者比ctgf表达高的患者还是显示出存活率縮短的倾向，右侧表示的是在iii期和iv期的肿瘤中，ctgf表达高的患者比ctgf表达低的患者显示出更短的存活率(p=0.189、log-rank检验)。图3c表示的是相对于60岁以下的处于iii期和iv期的卵巢癌患者的全体存活率的卡普兰*迈耶曲线。当仅限于60岁以下的、与转移现象相关的iii期和iv期的卵巢癌患者时，尽管分析中所包含的患者只有少数的病例，但ctgf表达高的患者比ctgf表达低的患者还是明显地显示出存活率更短(p=0.033、log-rank检验)。图4表示的是ctgf基因表达对卵巢癌增殖的效果(a、b)。将pcmv-3tag4-ctgf或pcmv-3tag4-mock转化到ctgf基因缺失的细胞株(hnoa、hmoa)中。图4a表示的是用从转化后48小时的细胞中所提取的蛋白质10|ig，采用抗myc抗体进行western印迹分析。b表示的是对不表达ctgf基因的细胞株(hnoa、hmoa)进行菌落形成分析。向这些细胞中瞬时地转化包含ctgf基因的myc标签载体(pcmv-3tag4-ctgf)或者空载体(pcmv-3tag4-niock)。在g418的存在下进行药物筛选2周。在图4b中，上部表示的是转化2周后形成耐药性菌落的结果。转化有ctgf基因的细胞所形成的菌落比转化有空载体的细胞要少；下部表示的是对菌落形成的定量分析，计数〉2mm的菌落个数，其结果用三个独立试验的平均值土sd来表示。具体实施例方式下面进一步详细说明本发明。(1)癌症的检测方法
技术领域：
：本发明的癌症检测方法的特征在于，通过存在于检测样本的染色体区域2ql4.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、ilql3.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15ql2、15ql5丄17pl2、17pl3.1、17pl3.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20ql3.13、20ql3.2、20ql3.31、20ql3.33、xpll.23、xpl3.1、xpl3.3、xp26.2、xp26.3、或xp28中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的包括恶性程度的癌化。更具体来说，上述基因可以是选自gli2、ccnd1、fgf3、tgfbr2、cdkn2a、mtap、smad4、evil、muc4、ptpn1、znf217、bcas1、tfap2c、birc7、tnfrsf6b、vegfc、klf12、fgf14、efnb2、gabrb3、rad51、r腦621、pmp22、rcv1、hsxiapaf1、abr、hic1、madh4(smad4)、dcc、malt1、grp、serpinb5、fvt1、bcl2、serpinb3、bcl2、ctdp1、shgc-145820、ssx1、ar、mllt7、abcb7、gpc3、fgf13、magea2、kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、和ctgf中的至少一个。特别优选的是，通过检测来源于卵巢的细胞中的ctgf基因的缺失或失活，可以检测出样本的包括恶性程度的癌化。根据人基因组计划的成果，ctgf基因的转录产物是已知的，该基因为存在于6q23染色体区域中的一个基因。已经知道的是，ctgf基因的编码蛋白属于ccn(ctgf、cyr61、nov)家族，与血管的形成、骨骼的形成、肾脏疾病、皮肤疾病等的生化学及病理学过程广泛相关。但其详细的功能尚不明。还未发现该ctgf基因是一种重要的与卵巢癌的发病或恶性程度相关的癌相关基因。如上所述，本发明检测方法的特征在于，对来源于卵巢的细胞或卵巢癌中的ctgf基因的缺失或失活进行检测。作为检测ctgf基因的缺失或失活的对象的来源于卵巢的细胞或卵巢癌，最好是样本提供者的活检组织细胞。该样本组织细胞无论是来源于健康人卵巢的细胞还是卵巢癌患者的癌组织，实际上，主要的受检对象都是这样的组织根据检査等的结果发现卵巢中存在有疑似癌化的病变部位时的病变组织；或者为已经确诊为卵巢癌，但需要判定其恶性程度和进展程度的卵巢癌的组织等。根据本检测方法，在"根据检査等的结果发现卵巢中存在有疑似癌化的病变部位时的病变组织"中确认ctgf存在基因缺失或失活的情况下，如果判定该病变组织正在进行癌化，或者已经处于癌化状态、并且恶性程度在持续增加，提示需要及早地进行正式治疗(通过手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。另外，在"已经确诊为卵巢癌，但需要判定其恶性程度和进展程度的卵巢癌的组织"中确认存在ctgf基因的缺失或失活的情况下，如果判定癌组织的恶性程度在持续增加，也提示需要及早地进行正式治疗(通过手术等切除病变部位、正式的化学疗法等)。作为样本而采集的卵巢癌组织经过必要的处理(例如，由所采集的细胞来制备dna或rna)后可以用作进行本检测方法的对象。(2)ctgf基因缺失的检测作为可直接进行ctgf基因缺失检测的代表性方法，可以列举cgh(比较基因组杂交，comparativegenomichybridization)法、fish(荧光原位杂交，fluorescenceinsituhybridization)法。该实施方案中的本检测方法为这样的方法对具有ctgf基因的bac(细菌人工染色体，bacterialartificialchromosome)dna、yac(酵母人工染色体，yeastartificialchromosome)dna、pac(pi衍生的人工染色体，pi-derivedartificialchromosome)dna(下面也称为bacdna等)进行标记后，进行fish检测，即可以检测出是否存在ctgf基因(即，ctgf基因是否缺失)。具体来说，作为含有ctgf基因的bacdna，可以列举rp11-69i8等。采用固定有基因组dna的基质来进行上述实施方案中的方法是合适的，而且在现实中也是这样进行的。通过制造多个基因组dna的固定基质来实用化时，由于通常所得到的bacdna的量很少，所以就需要将该dna作为基因扩增产物而获得(该基因扩增过程也称为"无穷化")。在该无穷化过程中，首先将bacdna等用识别4碱基的酶(例如rsal、dpnl、haeiii)等消化以后，加入连接物进行连接。连接物为由10-30个碱基、合适的是由15-25个碱基组成的寡核苷酸，具有2条互补序列的链，退火以后，形成平滑末端一侧的3'末端的寡核苷酸需要磷酸化。接下来，采用与连接物一方的寡核苷酸具有相同序列的引物，通过pcr(聚合酶链式反应，polymerasechainreaction)法进行扩增，即可以实现无穷化。另一方面，可以将各bacdna等中的特征性的50-70个碱基的氨基化寡核苷酸作为检测用探针。这样，通过将无穷化的bacdna等固定于基质上、特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的dna固定化基质。所述固体基质优选为玻璃板。玻璃等固体基质更优选通过聚-l-赖氨酸、氨基硅烷、金，铝等的沉积将该基质进行包被。点接于基质上的上述无穷化的dna的浓度优选为10pg*l5貼小1，更优选为lng/w200ng/|al。点接量优选为lnll|il，更优选为10nl100nl。另外，对固定于基质上的各个点的大小和形状不特别限定，例如，大小可以为直径0.01mmlmm，从上面看的形状可以为圆形至椭圆形。对干燥点的厚度也不特别限定，为1pm至100pm。进一步，点的个数不特别限定，每个使用的基质上为10个50,000个点，更优选为100个5,00q个点。虽然各个dna的点接次数在一次至四次的范围内，但优选两次重复或三次重复点接。干燥点的制备(例如)可以通过采用点样仪将无穷化的bacdna等滴接于基质上，形成多个点以后，将点干燥而制得。点样仪可以使用喷墨式打印机、针式阵列打印机、双喷射式(注册商标)打印机，优选使用喷墨式打印机。例如，可以使用geneshot(日本名古屋市的力'<^株式会社生产)等。这样，通过将无穷化的bacdna等固定于基质上，特别合适的是固定于固体基质上，即可以制备出所希望的dna固定化基质。另外，作为直接检测该ctgf基因缺失的手段之一，可以列举southern印迹法。southern印迹法是将从样本得到的基因组dna分离并固定，通过检测该基因组dna与ctgf基因的杂交来检测样本中该基因存在的方法。而且，也可以通过northern印迹法、实时rt-pcr法进行ctgf基因的缺失检测。northern印迹是一种将由样本中获得的mrna分离、固定，通过检测该mrna与ctgf基因的杂交、从而检测该样本中该基因的mrna存在的一种方法。实时rt-pcr法是通过逆转录反应和聚合酶链式反应进行目标基因扩增、并实时进行测定的一种方法，根据扩增倍率即可以对作为模板的mrna进行定量。该定量可以采用荧光色素来进行，有两种方法。即采用在双链dna中特异性插入(intercalate)发出荧光的色素(例如，sybr绿)的方法，以及采用使荧光色素结合在扩增的dna序列中的特异性寡核苷酸上的探针的方法。(3)ctgf基因失活的检测已有报道，当富含cpg的启动子和外显子区域发生密集甲基化时就会发生转录失活(birda.p.,etal.,cell,99,451-454，1999)。在癌细胞中，与其它区域相比，cpg岛存在高频率的且密集的甲基化，启动子区域的超甲基化(hypermethylation)与癌症中的癌抑制基因的失活紧密相关(ehrlichm.,etal.,oncogene,21,6694-6702,2002)。如后所述，实际上，ctgf基因的外显子中存在的cpg岛具有启动子活性，而且，该cpg岛甲基化的程度与一部分卵巢癌中的ctgf基因的表达抑制强烈相关。而且，通过在作为脱甲基化试剂的5-氮脱氧胞嘧啶(5-aza-dcyd)的存在下培养卵巢癌，可以使cpg岛脱甲基化，其结果是，可以使ctgf基因的表达恢复。根据这些结果可以判断，cpg岛的高频率甲基化(hypermethylation)是高频率地引发卵巢癌中的癌抑制基因表达抑制的原因之一。通过上述检测方法，对于被判断为ctgf基因表达量减少的样本细胞(来源于癌组织的原发癌细胞)，使该细胞与脱甲基化试剂(5-氮脱氧胞嘧啶)发生作用，从而使基因的表达量恢复。即，在使脱甲基化试剂与样本细胞发生作用、从而使基因的表达量恢复的情况中，样本细胞中的基因受到抑制的主要原因为cpg岛的甲基化，所以通过对样本提供者给予具有脱甲基化作用的药物，预期可获得相应的抗肿瘤效果。(4)细胞增殖的抑制方法以及细胞增殖抑制剂本发明进一步提供一种抑制细胞增殖的方法，该方法包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因、或将作为该基因的表达产物的蛋白质，在体外导入细胞中。并且，本发明还提供一种含有上述基因或蛋白质的细胞增殖抑制剂。在处理kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因时，其可以是本领域技术人员采用公知的技术从培养细胞等中获得的cdna,也可以是采用pcr法等通过酶学方法而合成的dna。在采用pcr法获得dna时，使用人染色体dna或cdna库作为模板，使用经设计的引物进行pcr扩增，以使得目标碱基序列可以得到扩增。pcr扩增得到的dna片断可以被克隆到适当的载体中，其中该载体在大肠杆菌等宿主中能够增殖。kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的检测探针或引物的制备、以及目标基因的克隆等操作对于本领域技术人员来说均是已知的，例如，可以参照1989年冷泉港实验室(冷泉港，纽约)编著的"molecularcloning:alaboratorymanual(第2版)"，或johnwiley&sons(19871997)年出版的"currentprotocolsinmolecularbiology,supplement138，，等记载的方法进行制备。kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因可以重组入载体中以重组载体的形式使用。载体为病毒载体或动物细胞表达用载体，优选使用病毒载体。作为病毒载体，可以列举逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体、牛痘病毒载体、慢病毒载体等。其中，由于逆转录病毒载体在感染细胞以后病毒基因组整合进入宿主染色体内，从而可以使整合进入载体内的外源基因能够稳定、长期地表达，所以特别优选使用逆转录病毒载体。动物细胞表达用载体例如可以采用pcxn2(gene,1991年第108巻第193-200页)、page207(日本特开平6-46841号公报)或其变体等。将上述重组载体导入到适当的宿主中进行转化，对得到的转化体进行培养即可以进行生产。当重组载体为病毒载体时，.导入该载体的宿主可以采用具有产生病毒能力的细胞，例如，cos-7细胞、cho细胞、balb/3t3细胞、hela细胞等。逆转录病毒载体的宿主可以使用甲cre、甲crip、mlv等；腺病毒载体及腺相关病毒载体的宿主可以是来源于人胎儿肾脏的293细胞等。可以采用磷酸钙法等将病毒载体导入到动物细胞内。而重组载体为动物细胞表达用载体时，导入该载体的宿主可以使用大肠杆菌k12菌株、hb101菌株、dh5a菌株等，大肠杆菌的转化是本领域技术人员公知的。所得到的转化体分别在合适的培养基、培养条件下培养。例如，大肠杆菌转化体的培养可以使用含有生长发育所必需的碳源、氮源、无机物以及其它物质的ph58左右的液体培养基来进行培养。通常在1543'c下培养约824小时左右。此时，在培养结束以后，目的重组载体可以通过通常的dna分离纯化方法制得。此外，动物细胞转化体的培养例如可以使用含有约5~20%胎牛血清的199培养基、mem培养基、dmem培养基等进行培养。培养基的ph优选为约68。通常在3040。c下培养约18~60小时。此时，由于含有该载体的病毒粒子释放于培养上清中，所以可以通过氯化铯离心法、聚乙二醇沉淀法、过滤浓縮法等对病毒粒子进行浓縮和纯化而获得目的重组载体。本发明的细胞增殖抑制剂可以通过将作为有效成分的上述基因与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合而制得。而且，当将上述基因重组整合进入病毒载体中时，制备含有重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂一起配合。为了配制作为有效成分的上述基因或蛋白质，所使用的基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、ph调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式配制为注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备为用时溶解的制剂。本发明的细胞增殖抑制剂的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等的全身给药方式，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。此外，当细胞增殖抑制剂在给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。本发明的细胞增殖抑制剂的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等而异，但一般来说，成年人每日摄入的重组基因的重量在1(ig/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内，优选为从10吗/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。给药次数不作特别限定。(5)细胞增殖的激活方法及细胞增殖激活剂根据本发明，提供一种激活细胞增殖的方法，其包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。而且提供一种含有上述sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因的细胞增殖激活剂。sirna为约20个碱基(例如为约2123个碱基)或者不足20个碱基长度的双链rna。通过在细胞中表达这种sirna，即可以抑制作为该sirna的靶标的基因(在本发明中为kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf)的表达。只要能够引发rnai，本发明中所使用的sirna可以是任何形式。这里，所谓"sirna，，是"短干扰rna(shortinterferingrna)"的简称，或者是人工化学合成的，或者是生物化学方法合成的，或者是在生物体内合成的，或者是约40个碱基以上的双链rna在体内分解为10个碱基对以上的短双链rna。通常，其具有5'-磷酸、3'-oh的结构，3'末端有约2个突出的碱基。该sirna与特异性蛋白质结合，形成risc(rna诱导的沉默复合物，rna-induced-silencing-complex)。该复合物能够识别与该sirna具有相同序列的mrna并与之结合，通过rnaseiii样的酶活性，在sirna的中部将mrna切断。优选的是，sirna的序列与作为切断靶标的mrna的序列100%一致，但是，在sirna的中间断掉的位置上的碱基不一致的情形下，多数情况下rnai的切断活性还会部分残留，所以也可不必100%—致。优选的是，sirna的碱基序列与表达应该被抑制的kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的碱基序列之间具有同源性的区域不包含该基因的翻译起始区。原因在于由于预想到在翻译起始区中sirna会与各种转录因子、翻译因子结合，从而在效果上就会不能与mrna结合，可以预测其效果会降低。因此，具有同源性的序列，优选为距离该基因翻译起始区20个碱基，更优选为距离该基因翻译起始区70个碱基。具有同源性的序列例如可以是该基因3'末端附近的序列。根据本发明的另外一种实施形式，作为通过rnai抑制目标基因表达的因子，其还可以使用3'末端具有突出部的短的发卡式结构的shrna(shorthairpinrna)。所谓"shrna"是指通过在单链rna中包含部分回文结构的碱基序列、从而在分子内形成双链结构、形成类似于发卡一样的结构的约20个碱基对以上的分子。这样的shrna被导入细胞内以后，在细胞内被分解为约20个碱基(代表性地为例如21个碱基、22个碱基、23个碱基)的长度，与sirna—样可以引发rnai。如上所述，shrna由于可以与sirna—样引发rnai，在本发明中也可以有效地加以应用。shrna优选具有3'突出末端。虽然双链部分的长度并不做特别限定，但优选为约io个核苷酸以上，更优选为约20个核苷酸以上。这里，3'突出末端优选为dna，更优选为至少2个核苷酸以上的dna，进一步更优选为24个核苷酸的dna。如上所述，在本发明中，作为可以通过rnai来抑制kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的表达的因子，可以使用sirna或者shrna。sirna的优点在于o)即便是导入到细胞内部，rna本身也不会重组入正常细胞的染色体中，所以其不是一种能够引起遗传给后代的变异的治疗方法，安全性高；以及，(2)短双链rna的化学合成比较容易，形成双链形式更稳定，等等。而shrna的优点是通过长期抑制基因表达进行治疗时，可以制作在细胞内能转录shrna的载体，然后将其导入到细胞内部。通过本发明中所使用的rnai来抑制kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因表达的sirna或者shrna可以是人工化学合成，也可以将由正义链和反义链的dna序列反向连接形成的发卡结构的dna通过t7rna聚合酶在体外合成rna而制备。体外合成时，使用t7rna聚合酶和t7启动子，由模板dna可以合成反义和正义的rna。将它们在体外退火以后导入细胞内，即可以引发rnai，抑制目标基因的表达。这里，可以采用例如磷酸钙法、或者各种转染试剂(例如oligofectamine、lipofectamine禾口lipofection)将那些rna导入细胞内。上述sirna或者shrna可以作为细胞增殖激活剂使用。本发明的细胞增殖激活剂的给药方法可以是经口给药或非经口给药(例如静脉给药、肌肉给药、皮下给药、皮内给药、粘膜给药、直肠给药、阴道给药、患病部位的局部给药、皮肤给药等等)、患部直接给药等。本发明的制剂作为药物组合物使用时，必要时可以添加药学上许可的添加剂。药学上许可的添加剂的具体例子可以列举抗氧化剂、保存剂、着色剂、调味剂、以及稀释剂、乳化剂、悬浊剂、溶剂、填料、增量剂、缓冲剂、传输介质、稀释剂、载体、赋形剂和/或药学佐剂等。但并不仅限于这些。本发明的药剂的制剂形式不作特别限定。例如可以列举口服液剂、注射剂、缓释剂等等。将本发明的药剂作为上述制剂而用于处方时的溶剂可以是水性溶剂也可以是非水性溶剂。进一步，本发明的细胞增殖激活剂的有效成分sirna或者shrna可以以非病毒载体或病毒载体的形式给药。当为非病毒载体的形式时，可以使用脂质体导入核酸分子的方法(脂质体法、hvj-脂质体法、阳离子脂质体法、脂质体转染法、lipofectamine法等)、显微注射法、用基因枪(genegun)与载体(金属颗粒)一起将核酸分子转入细胞内的方法等。而当将sirna或者shrna以病毒载体形式给药于生物体时，可以使用重组腺病毒、逆转录病毒等病毒载体。在无毒化的逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、痘病毒、脊髓灰质炎病毒、辛德比斯病毒(sindbisvims)、仙台病毒、sv40等dna病毒或rna病毒中导入能够表达sirna或者shrna的dna，使细胞或组织被该重组病毒感染，即可以将基因导入细胞或组织中。根据使用目的、疾病的严重程度、患者年龄、体重、性别、既往史、或者作为有效成分的sirna或者shrna的种类，本领域技术人员可以决定本发明的细胞增殖激活剂的给药量。虽然sirna或者shrna的给药量不作特别限定，例如可为约0.1ng/kg/日约100mg/kg/日，优选为约lng/kg/日约10mg/kg/日。一般是给药后l3日可见rnai的效果。因此，优选以1日3日一次的频率给药。使用表达载体时，可以按一周左右给药一次。本发明中，也可以将反义寡核苷酸作为细胞增殖激活剂使用。本发明中所使用的反义寡核苷酸为与kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的dna序列中的连续5100个碱基序列互补的、或杂交的核苷酸，也可以是dna或rna任意一个，或者，只要在功能上没有损害，也可以是它们的修饰物。在本说明书中，所谓"反义寡核苷酸"，不仅指与构成dna或mrna的预定区域的核苷酸相对应的核苷酸完全互补的核苷酸，只要dna或mrna与寡核苷酸能够稳定杂交，也可以存在一些错配。另外，反义寡核苷酸也可以进行修饰。通过适当的修饰，该反义寡核苷酸在生物体内很难分解，更加稳定，从而可以阻碍itiia。这种修饰后的寡核苷酸可以列举为s-oligo型(硫代磷酸酯型)、c-5噻唑型、d-oligo型(磷酸二酯型)、m-oligo型(甲基磷酸酯型)、肽核酸型、磷酸二酯键型、c-5丙烯基嘧啶型、2-0-丙基核糖、2'-甲氧基乙氧基核糖型等修饰型的反义寡核苷酸。而且，反义寡核苷酸也可以是通过将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰。这种反义寡核苷酸的核酸酶耐受性、水溶性、对rna的亲和性特别优异。将构成磷酸基团的氧原子的至少一部分为硫原子取代而被修饰的反义寡核苷酸例如可以是s-01igo型等的寡核苷酸。反义寡核苷酸的碱基数优选为小于或等于50个，更优选为小于或等于25个。碱基数过多会导致寡核苷酸的合成的工夫与成本大大增加，收率也会降低。而反义寡核苷酸的碱基数为大于等于5个，优选为大于等于9个。碱基数小于等于4个时，对目标基因的特异性降低，所以是不优选的。反义寡核苷酸(或其衍生物)可以通过通常的方法合成，例如，通过市售的dna合成装置(例如appliedbiosystems公司制造的等等)即可以很容易地合成。作为合成法，采用phosphoroamidite的固相合成法、采用氢膦酸酯的固相合成法等等均可以获得。在本发明中，当反义寡核苷酸用作细胞增殖激活剂时，一般是以包含反义寡核苷酸和制剂用添加物(载体、赋形剂等)的药物组合物的形式提供的。可以对包括人在内的哺乳动物以药物形式给予反义21寡核苷酸。对反义寡核苷酸的给药途径不作特别限定，经口给药或非经口给药(例如肌肉给药、静脉给药、皮下给药、腹腔给药、鼻腔等粘膜给药、或者吸入给药等)中的任意一种均可。对反义寡核苷酸的制剂形式不作特别限定。经口给药的制剂例如可以列举片剂、胶囊剂、细粒剂、粉末剂、颗粒剂、口服液剂、糖浆剂等；非经口给药的制剂例如可以列举注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、黏膜吸收剂、皮肤吸收剂、滴鼻剂、滴耳剂等等。包含反义寡核苷酸的药剂的形式、可使用的制剂用添加物、制剂的制造方法等本领域技术人员均可适当地选择。反义寡核苷酸的给药量可以综合考虑患者的性别、年龄、体重、疾病的严重程度、给药目的为预防还是治疗、或者其它合并症状的有无等等而适当地选择，但一般给药量为约0.1pg/kg体重/日100mg/kg体重/日，优选为约0.1pg/kg体重/日10mg/kg体重/日。本发明中，也可以将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的功能缺陷型基因作为细胞增殖激活剂使用。所谓"功能缺陷型基因"是指在该基因中导入变异以使其功能缺失的基因。具体来说，与此相对应的基因为翻译一般被称为突变蛋白质的基因，突变蛋白质是指由该基因形成的氨基酸序列中至少一个组成氨基酸缺失、至少一个组成氨基酸被别的氨基酸取代、至少一个氨基酸被附加等原本的功能缺失的蛋白质。当功能缺失型基因作为细胞增殖激活剂使用时，可以通过将作为有效成分的上述基因与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合而制备。而且，当将上述基因重组入病毒载体时，制备含有该重组载体的病毒粒子，将其与基因治疗剂中通常使用的基剂共同配合。上述基剂可以使用通常注射液中使用的基剂，例如，蒸馏水、氯化钠或氯化钠与无机盐的混合物等的盐溶液、甘露醇、乳糖、葡聚糖、葡萄糖等的溶液、甘氨酸、精氨酸等的氨基酸溶液、有机酸溶液或盐溶液与葡萄糖溶液的混合溶液等。或者，根据本领域技术人员公知的常用方法，也可以在这些基剂中使用渗透压调节剂、ph调节剂、植物油、表面活性剂等佐剂，以溶液、悬浊液、分散液的形式配制成注射剂。这些注射剂可以通过粉末化、冻干等操作制备成用时溶解的制剂。功能缺失型基因的给药形式可以是通常的静脉内、动脉内等全身给药，或者也可以是局部注射或经口给药等局部给药方式。给药时，也可以采用与插管技术、基因导入技术、或者外科手术等的组合给药形式。功能缺失型基因的给药量因患者年龄、性别、症状、给药途径、给药次数、剂型等等而异，但一般成年人每日摄入的重组基因的重量在l貼/kg体重至1000mg/kg体重左右的范围内。优选为从10pg/kg体重至100mg/kg体重左右的范围内。给药次数不作特别限定。另外，上述本发明的各种基因治疗剂也可以在按常法制备的脂质体悬浊液中添加基因、通过冷冻后融解而制得。调制脂质体的方法有薄膜震荡法、超声波法、逆相蒸发法、表面活性剂去除法等。优选的是，在超声波处理脂质体悬浮液以后，添加基因可以提高基因的包封率。包封有基因的脂质体可以直接或与水、生理盐水等混悬后静脉给药。(6)抗肿瘤物质的筛选方法如上所述，对于卵巢癌，kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf基因的失活是主要的原因，因此，可以认为，使这些基因的作用正常化的药物可用作卵巢癌的抗肿瘤制剂。特别是，在该失活的主要原因是由于ctgf基因的cpg岛发生甲基化的情况中，使这些主要原因得以解除、缓和的药剂即可以用作抗肿瘤制剂。作为进行这种筛选方法的前提，需要确保在样本中存在ctgf基因的表达量被抑制的卵巢癌细胞。即，本发明的筛选方法中，需要的是"由于ctgf基因的cpg岛发生甲基化而引起的ctgf基因表达被抑制的卵巢癌细胞"。在基于如上所述见解的基础上，采用常法就可以建立这些细胞株。例如，从至少已经被确认为ctgf基因失活的细胞中，选择使该细胞与已知的脱甲基化试剂(如5-氮脱氧胞嘧啶)进行作用后ctgf基因水平得以恢复的细胞，将该细胞继代培养，即可以建立"由于ctgf基因的cpg岛发生甲基化而引起的ctgf基因表达被抑制的卵巢癌细胞"(以下也称为甲基化癌细胞株)。本发明的筛选方法中，需要将上述甲基化癌细胞株与待测物质相接触。对该接触的方式不作特别限定，可以将待测物质以适当的稀释倍数进行稀释后添加到甲基化细胞株的培养基中，接着进行培养，从而使它们接触。然后，定量测定添加待测物质前甲基化癌细胞株中的ctgf基因的表达量，以及适当地间隔一定的时间定量测定添加待测物质后的ctgf基因的表达量，将添加待测物质前、后所测定的ctgf基因的表达量之差，与不添加待测物质而在相同条件下进行培养后的对照培养物进行比较，当与对照培养物相比，如果添加待测物质后的培养基中的ctgf基因表达量增加时，则将该待测物质筛选作为在使用甲基化癌细胞株的试剂中的"通过使ctgf基因的cpg岛脱甲基化而可以使ctgf基因得以活化的抗肿瘤物质"。.另外，进行本筛选方法时，也可以将筛选出来的有希望成为卵巢癌的抗肿瘤成分的物质进一步进行体内筛选，例如，适宜的是，以卵巢癌的增殖抑制效果和裸鼠的生存率得以提高为指标，在植入有上述甲基化癌细胞株的裸鼠体内进行筛选，将范围縮小到最终的候选物质。下面通过实施例进一步详细地说明本发明，但本发明并不因这些实施例而受到特定限制。实施例实施例l:卵巢癌中基因的变化为了检测出卵巢癌中的新型基因变化，采用由24种卵巢癌细胞株(ht、htoa、huoa、kf28、mh、ovtoko、ovsaho、kfrl3、hmkoa、mcas、rmug國l、rmug-s、kk、ovise、ovmana、ovtoko、rmg-i、rmg-ii、es-2、w3uf、hioanu、hmoa、hnoa、htboa)制备的基因组dna，采用mcgcancerarray-800来进行cgh阵列分析(图la)。以来源于正常的卵巢上皮的细胞株(ose-2a)所提取的基因组dna为对照用cy5进行标记；以由卵巢癌细胞株所制备的基因组dna为被检dna采用cy3进行标记。具体来说，将dpnii消化的基因组dna(0.5pg)、分别在0.6mmdatp、0.6mmdttp、0.6mmdgtp、0.3mmdctp、0.3mmcy3-dctp(卵巢癌细胞)或者0.3mmcy5-dctp(正常细胞)的存在下，用bioprimearraycghgenomiclabelingsystem(invitrogen公司生产)进行丰示记。cy3禾口cy5标记的dctp购自gehealthcare公司。在cot-1dna(invitrogen公司生产)的存在下将两种标记的基因组dna加入乙醇中使其沉淀，然后溶解于120"1的杂交混合液(50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖(dextransulfate)、2xssc(1xssg150mmnacl/15mm柠檬酸钠)、4%十二烷基硫酸钠、ph7.0)中，在37"c孵育30分钟以后，将所得物加入在杂交仪(genetac;八一"'一卜"、'<才廿<工>^公司)上设置的cgh阵列上，孵育4872小时。然后，将cgh阵列在50%甲酰胺/2xssc溶液(ph7.0)中在5(tc下清洗15分钟，接下来在2xssc/0.1%sds中于50'c下清洗15分钟。风干以后，将cgh阵列用genepix4000b扫描仪(美国加利福尼亚州axoninstruments公司制造)监测来源于cy3和cy5的荧光。得到的结果用genepixpro6.0成像软件(美国加利福尼亚州axoninstruments公司制造)进行分析。将来源于cy3的荧光强度的平均值和来源于cy5的荧光强度的平均值调整为相同值，求得cy3/cy5的比值。当在基因组中没有异常时，cy3/cy5的比值为1(log2比值=0)，而该比值为1.32以上(log2比值为0.4以上)时判定为存在基因组扩增，该比值为4以上(1og2比值为2以上)时判定为显著扩增。当比值为0.75以下(log2比值为-0.4以下)时可判断基因组有可能发生杂合子缺失，当比值为0.25以下(1og2比值为-2以下)时可判定发生纯合子缺失的可能性极大。其结果如表1和表2所示。在24种卵巢癌中，发生高水平的基因扩增的为2种，可以确认2个基因座。而在24种卵巢癌中，发生基因缺失的为3种，可以确认4个基因座。表1使用mcgcancerit!cghm測分析所濺定的在24.种卵巢浇细胞株中的為'水平扩(l邻2比値>2.0)ib纯ff缺火《tog2比镇<-2.0)tableseeoriginaldocumentpage26
11报据ucscgtm(加ebrowser(2加4年5月版)i'位干bac周醜的可能的致癌sm或肿瘤'抑制蓰因表:2补充衮s2在使用mcgcweera0鹏cgh阵,分折中发埂的频舉溢處的瑜益靡缺失的究g
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分别裉据kg2比值的阈谊0.4和-0,4来定义变化类型为拷贝数據益或缺失..在该表中,拷贝数纖益的爽隆*缺失翁鬼a按照染色偉的位a来徘列，这fi克隆在超过40%的细胞株,表现出拷li数的傰差，实施例2:卵巢癌中6q23(6q23.1-23.2)染色体缺失区域中所含有的基因的分离为了详细确定在卵巢癌细胞株中(rmug-s)中新检测出的6q23(6q23.1-23.2)染色体纯合缺失区域中所包含的基因，首先，以从rmug-s细胞中提取的基因组dna为模板进行基因组pcr，由此确定纯合缺失区域的范围。基因组pcr中所使用的引物序列如表3所示。表3补充:农si本研究中所用的引物序列方法靶港h正向引物反向引物sh组pcrcobra和亚k酸^盐溯序gtgfk域'k域k域^嵌套式!x:域"兹k域^"嵌套式5'-aggagcactaatttattc丁3ataaaag■5'-a66gaacoctcigasgtaaag.5'-eit::3casosta;ti3tttaagw^gcgc了《3tctc秘3tgat5'-ca(3-4丁ca了g'scatggaacaa5'-tc站sa丁sac丁ot3gaa丁cact5'-ttqa'i5ai3c，a'3at泌ttaatg5义tcgtgagaga'cogaetgc改-teggccattcttutttcatc'^"acctttcccaa4ggtt3c丁s^cacqaacaaccacaacatc5'《^ctaactatctcgtctcaa^5:'-tc:catagtacacpaaaagatac4acc由cgh阵列的结果及人基因组数据库(http:〃genome.ucsc.edu/)可以确认缺失区域中存在的基因(图1b、图1c)。结果显示，该缺失区域存在有10种基因(图1b)。其中，在rmug-s细胞(1/24，4.2%;图1c)中，可以确认ctgf基因、enpp1基因、enpp3基因、crsp3基因、arg基因、akap7基因、epb4l2基因、kiaa1913基因发生纯合缺失。实施例3:卵巢癌细胞株中ctgf基因表达的消失以及dna脱甲基化后的恢复为了了解上述7个基因(ctgf基因、enpp1基因、enpp3基因、crsp3基因、arg基因、akap7基因、epb41l2基因、kiaa1913基因)的表达水平，对24种卵巢癌细胞株、正常卵巢细胞、来自正常卵巢上皮细胞的不死化细胞株(ose-2a)进行了反转录pct(rt-pcr)。具体来说，从培养的细胞株中提取rna，采用superscriptfirst-strandsynthesissystem(invitrogen公司)，合成单链cdna，采用表3所示的引物序列进行pcr。另外，采用3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gapdh基因)作为对照物。其结果发现，尽管ctgf基因、enpp1基因、kiaa1913基因在6q23.1-23.2染色体区域中并不存在纯合缺失，但与正常卵巢和ose-2a细胞相比，其显示出表达量减少(图id)。可以认为，这种现象是由于卵巢癌细胞株中除基因组缺失以外的机制(例如后生遗传现象)所致。另外，在上述试验中，根据基因表达数据库(ncbi.nlm.nih.gov禾nhttp:〃www.lsbm.org/database/index.html)的分析结果，arg1基因在卵巢中并不表达，所以其不在研究之列。为了研究ctgf基因的表达抑制是否是由于dna甲基化的原因所致，采用ctgf基因不表达的卵巢癌细胞株(hnoa、rmg-ii)，用5|lim的脱甲基化试剂5-aza-dcyd处理5天，或者用100ng/ml的脱乙酰化抑制剂tsa处理12小时。从这些细胞中提取rna，用rt-pcr检测ctgf基因的表达(图1d)。其结果是，5-aza-dcyd处理以后，ctgf基因的基因表达得以恢复。由该结果可以明显地推定，ctgf基因的表达抑制与dna甲基化相关。而且，tsa处理后，并未见到ctgf基因的表达存在差异，由此明显可以看出，ctgf基因的表达调节受组蛋白脱乙酰化的影响小。实施例4:卵巢癌细胞株中ctgf基因的cpg岛的甲基化cpg岛的甲基化是抑制基因表达的机制之一。采用cpgplot程序(http:〃www.ebi.ac.uk/emboss/cpgplot)分析了ctgf基因的cpg岛，结果显示，在ctgf基因的外显子1、2的周围存在有cpg岛(图2a)。为了确认卵巢癌细胞株中ctgf基因表达的有无所导致的ctgf基因的cpg岛的甲基化状态，对三个区域(区域l、区域2、区域3)进行了亚硫酸氢盐测序分析。具体来说，使用ezdna甲基化试剂盒(美国加利福尼亚州的zymoresearch生产)，将源自卵巢癌细胞株的基因组dna(2叫)在亚硫酸氢钠中于5(tc下处理过夜，采用经设计的引物(表3)进行pcr以扩增目标区域。将这些序列亚克隆入topota克隆载体(invitrogen公司)中，确定其碱基序列。其结果是，在ctgf基因表达减少的细胞株(htoa、huoa、rmug-l、rmg-i、hnoa、kf28)中，区域2和区域3被极度地甲基化(图2a)。另外，在ctgf基因表达的细胞株(kk、ovise)中，区域2的3'部分、区域2b和区域3也被甲基化。为了进一步确定卵巢癌细胞株中ctgf基因的表达状态与甲基化状态之间的关联性，采用cobra法进行了解析。具体来说，将上述得到的pcr产物用bstui限制性内切酶(newenglandbiolabs)进行消化，然后电泳检测。利用bstui不消化未被甲基化的但被亚硫酸氢钠修饰的序列，而可消化发生甲基化的但未被亚硫酸氢钠修饰的序列的性质，检测甲基化的程度。将pcr片段进行电泳以后，采用multigauge2.0(富士7
富士胶片株式会社国立大学法人东京医科齿科大学<120〉卵巢癌的检测方法及抑制方法〈130〉f卜080773-59:56<150>jpno.2007-143川a<151>2007-05-30<160〉48<170>patentinversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉dna<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400>1ttccagagcagctgcaagta20<210〉2<211>20〈212>■〈213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述合成dna<400>2aaggaaggaaaggcacacaa20<210〉3<211〉19<212>隱<213>人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成dna〈400〉3gcatggaacaaggcagttg19<210>4〈211〉27<212〉隱<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成dna〈400>4aggagcactaatttattctgataaaac27<210>5〈211>20<212〉dna<213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成dna〈400〉5agggaacgctccaggtaaag20<210>6<211>23<212>陽<213>人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成dna<400>6ttccctcttggtgtaaaattcaa23〈210>7<211>20<212〉隨〈213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400>7cttgcagcgtgctgtttaag20〈210〉8<211>2036<212>dna<213〉人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成dna<400〉8tc3cacaggtttgaggatgc20<210〉9〈211>20〈212〉dna〈213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉9atgaaacgtttttgcccttg20<210〉10<21d20<212〉dna<213〉人工序列〈220><223;>人工序列的描述合成dna<400〉10agagcgctgtctcaggtcat20<210〉11<211〉20<212>隨<213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成dna<400〉11ttccagagcagctgcaagta20〈210〉12<211〉20<212>,<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400>12cagatcatggcatggaacaa20〈210〉13<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400〉13gc3gctaccaggacaatgga20〈210〉14〈211〉20<212>dna<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400〉14ggcaaacttccacactggtt20<210〉15〈211〉22<212>隱<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述合成dna<400>15tcaggatgactgtggaatcact22<210>16<211〉24<212〉瞧<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna页〈400〉16ggggaagattaagtaagaaagtca24〈210〉17<211>22〈212〉dna〈213〉人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成dna<400>17cagctggtgtgtgctagaagag22<210>18<211>19〈212〉dna〈213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述合成dna〈400>18gtaggaaggtggggaggaa19<210>19<211〉30<212〉隱〈213〉人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉19ggaatgttgagtgttaaggggttaggatta30<210>20<211>20〈212〉隨<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉20ttgagaggagatagttagtg20<210>21<211〉18〈212〉dna<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成dna〈400>21ggttgttagggaggg3tt18〈210〉22<211〉24〈212〉陽<213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉22gtataagggtttattttgttattt24<210>23〈211〉17〈212〉dna<213>人工序列<220〉〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉23gggtcgtgtcggtgttc17<210>24〈211>19<212>瞧<213>人工序列〈220〉<223>人工序列的描述合成dna<400>24gttgtgttggtgtttggat19〈210>25〈211>19〈212>dna<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉25ctcgtcacacacccactcc19〈210〉26〈211〉20〈212〉dna〈213〉人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成dna〈400〉26tttccaaggggctggagtat20〈210>27<211>20<212>瞧〈213〉人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400>27gggacatcagagggtctcaa<210>28〈211〉24〈212〉dna<213〉人工序列〈220><223>人工序列的描述合成dna〈400>28gtgttcttcttaacaggttgttcc24<210>29〈211〉20<212>dna<213>人工序列〈220〉〈223>人工序列的描述合成dna<400>29cctcttcgaaaatgctctgc20<210>30〈211>20<212>dna〈213〉人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成dna〈400〉30gggggcttatgtaagtgtgc20<210>31〈211>20〈212>dna〈213>人工序列<220〉<223〉人工序列的描述合成dna<400>31tgggccattcttctttcatc20<210>32<211>20〈212〉dna<213〉人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400>32tagggtcaaaggcaaaggaa20<210>33<211>20<212>隱<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成dna<400>33acctttcccaaacctttgct20〈210〉34<211>20〈212〉■<213>人工序列〈220>〈223〉人工序列的描述合成dna<400>34aatccttccaaaacggaggt20〈210>35〈211>20〈212〉陽<213>人工序列〈220〉〈223〉人工序列的描述合成dna〈400>35ccaggcagttggctctaatc20<210>36<211〉20〈212>dna<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成dna<400>36gggacatcagagggtctcaa20<210>37<211〉20〈212>dna<213>人工序列〈220>〈223>人工序列的描述合成dna<400>37gcaagaagaacaatgcaagc20<210>38〈211〉20<212〉dna<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400〉38atccctggaataaggctgct20〈210〉39<211〉21〈212〉dna〈213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述合成dna<400>39tgaaaggaaccatcactgacc21〈210>40<211〉20〈212〉隐<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述合成dna<400>40aggtttggtgttggc3tttt20<210〉41<211〉20<212〉dna<213>人工序列<220><223〉人工序列的描述合成dna〈400〉41ccacgaacaaccacaacatc20<210>42<211>21〈212〉dna<213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成dna〈400〉42cactaactatctcctctcaac21〈210〉43<211〉30〈212〉隱<213>人工序列〈220〉<223〉人工序列的描述合成dna<400>43atcaaacattaaaacactctcacatccaaa30<210>44〈211〉20<212>dna<213〉人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成dna〈400>44aacaaaataaacccttatac20<210>45〈211>26<212>隨〈213>人工序列<220>〈223>人工序列的描述合成dna〈400>45tcc3t3ct3c3c33333c3t3c33cc26<210>46<211>24<212>隨<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成dna<400>46gtataagggtttattttgttattt<210>47<211>19<212>dna<213>人工序列<220〉〈223>人工序列的描述合成dna〈400>47gtccaacacgaaactcacg19〈210>48<211〉20〈212>dna<213>人工序列<220>〈223〉人工序列的描述合成dna<400〉48catccaacacaaaactcaca20权利要求1.一种癌症的检测方法，该方法通过检测存在于样本的染色体区域2q14.2、3p24.1、3q26.2、3q29、4q34.2、6q23、9p21.3、11q13.3、13q22.1、13q33.1、13q33.3、15q12、15q15.1、17p12、17p13.1、17p13.3、18q21.1、18q21.2、18q21.31、18q21.32、18q21.33、18q23、20q13.13、20q13.2、20q13.31、20q13.33、xp11.23、xp13.1、xp13.3、xp26.2、xp26.3、或xp28中的基因发生的至少一种变化，来检测样本的癌化，并包括检测样本的癌化的恶性程度。2.权利要求1所述的癌症的检测方法，其中所述基因为gli2、ccndl、fgf3、tgfbr2、cdkn2a、mtap、smad4、evil、muc4、ptpn1、znf217、bcas1、tfap2c、birc7、tnfrsf6b、vegfc、klf12、fgf14、efnb2、gabrb3、rad51、rh68621、pmp22、rcv1、hsxiapaf1、abr、hic1、madh4(smad4)、dcc、malt1、grp、serpinb5、fvt1、bcl2、serpinb3、bcl2、ctdp1、shgc-145820、ssx1、ar、mllt7、abcb7、gpc3、fgf13、magea2、kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、ctgf中的至少一个。3.权利要求1或2所述的癌症的检测方法，其中所述基因变化为扩增、缺失和失活中的至少一种。4.权利要求1至3中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述基因的变化是由cpg岛的甲基化而引起的失活。5.权利要求2所述的癌症的检测方法，其中在样本中，通过检测由权利要求2所述的基因所翻译的蛋白质的量来检测样本的癌化，并包括检测样本的癌化的恶性程度。6.权利要求5所述的癌症的检测方法，其中通过免疫组化法来检测所述蛋白质的量。7.—种癌症检测方法，其通过检测ctgf基因的缺失或失活来检测样本的癌化，并包括检测样本的癌化的恶性程度。8.权利要求1至7中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述样本为源自卵巢的组织。9.权利要求1至8中任意一项所述的癌症的检测方法，其中所述癌症为卵巢癌。10.权利要求1至9中任意一项所述的癌症的检测方法，其中采用dna芯片法、southern印迹法、northern印迹法、实时rt-pcr法、fish法、cgh法、或阵列cgh法、亚硫酸氢盐测序法、cobra法对所述基因的变化进行检测。11.一种抑制细胞增殖的方法，其包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因、或者将作为该基因的表达产物的蛋白质，在体外导入到细胞中。12.—种细胞增殖抑制剂，其含有kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因、或者作为该基因的表达产物的蛋白质。13.—种激活细胞增殖的方法，其包括将kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因在体外导入到肿瘤细胞中。14.一种细胞增殖激活剂，其含有kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因的sirna、shrna、反义寡核苷酸或功能缺失型基因。15.—种物质的筛选方法，其为针对由于其中的kiaa1913、epb42l2、akap7、crsp3、arg1、enpp3、enpp1、或ctgf基因的cpg岛发生甲基化而导致基因表达被抑制的卵巢癌，使该卵巢癌与待测物质接触以检测所述基因的表达，当与未接触待测物质的体系相比较，发现所述基因表达增加时，可将该待测物质筛选为可以通过将所述基因的cpg岛脱甲基化而使该基因活化的抗肿瘤物质。全文摘要本发明通过以卵巢癌中基因组结构的变化为指标来提供一种检测包括恶性程度在内的卵巢癌的方法。本发明发现以卵巢癌的基因组结构变化为指标，可以检测包括恶性程度在内的卵巢癌。另外本发明还发现，在卵巢癌中，通过使失活的基因恢复，可以抑制卵巢癌的增殖。文档编号a61k48/00gk101314793sq200810108639公开日2008年12月3日申请日期2008年5月30日优先权日2007年5月30日发明者井本逸势,稻泽让治,菊池良子申请人:富士胶片株式会社;国立大学法人东京医科齿科大学