专利名称：ephb4作为诊断标记和作为卵巢癌的治疗靶标的用途的制作方法
ephb4作为诊断标记和作为卵巢癌的治疗靶标的用途相关申请该申请要求2007年3月12日提交的美国临时申请号60/906，727及2007年3月 12日提交的美国临时申请号60/906，764的优先权。该引用申请的全部教导此处以其整体 引入作为参考。
背景技术：
卵巢癌是妇女中第二常见的妇科癌，在2005年美国约有22，220例新病例 (american cancer society，2005)。卵巢癌比女性生殖系统的其它任何癌引起更高的死 亡。绝大多数卵巢癌起源于上皮。卵巢癌在携带brca或错配修复基因突变的妇女中具有 更高的发病率(matais-guiu，1998)。也已经研究了雌激素在卵巢癌发展中的作用。相信雌 激素的某些代谢物可能帮助肿瘤生长，而孕酮可能具有保护作用(seeger，2006)。不存在有 效的卵巢癌筛选工具，并且在超过80%的病例中，直至疾病晚期才能做出诊断，这使得治疗 非常具有挑战性。目前总体5年存活率是44% ；然而，患有该疾病的妇女的相对5年存活 率仅为29% (american cancer society, 2005) 0因此需要鉴定在卵巢癌发病机理中起作 用的新的分子标记，希望提供新的靶向生物疗法。本公开内容的目标是提供用于抑制卵巢癌的血管发生和肿瘤生长的试剂和治疗 性治疗。发明概述在某些方面，本公开内容提供了治疗卵巢癌的方法，所述方法包括向需要治疗卵 巢癌的患者施用有效量的ephb4抑制剂。在某些实施方案中，所述抑制剂可以是多肽、多 肽类似物、拟肽、抗体、核酸、rnai构建体、核酸类似物或小分子。在某些实施方案中，所述 ephb4抑制剂是抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段选自多克隆抗体、单克隆抗体或 抗体片段、双抗体、嵌合的或嵌合抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、去免疫化人抗 体或抗体片段、完全人类抗体或抗体片段、单链抗体、fv、fd、fab、fab，和f(ab，)2。在某些 实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体或其 抗原结合片段结合ephb4的胞外域。在某些实施方案中，ephb4的存在是ephb4的可检测水平。在某些实施方案中，样 品选自组织样品、血液样品或血清样品。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段共价连接额外的功能部分。在某些实 施方案中，所述额外的功能部分是可检测标记。在某些实施方案中，所述可检测标记选自荧 光标记或生色标记。在某些实施方案中，所述可检测标记选自辣根过氧化物酶或碱性磷酸 酶。在某些实施方案中，所述额外的功能部分包含聚乙二醇(peg)部分。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段抑制ephb4活性。在某些实施方案中， 抗体或其抗原结合片段激活ephb4激酶活性。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于ephb4胞外部分中的表位 上。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于人ephb4序列的氨基酸16-198内的表位上。在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段结合到位于人ephb4的氨基酸 327-427或428-537内的表位上。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，其中所述重链可变 区包含一个或更多个⑶r区，所述⑶r区具有选自seq idno 261, seq id no 262和seq id n0:263的氨基酸序列。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区，其 中所述轻链可变区包含一个或更多个⑶r区，所述⑶r区具有选自seq id no :264、seqid no 265和seq id no 266的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述人源化抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链和免 疫球蛋白轻链，其中所述重链包含包含seq id no :8的⑶rl、包含seq id no :9的⑶r2 和包含seq id no 10的⑶r3 ；并且其中所述轻链包含包含seq id no 11的⑶r1、包含 seq id no 12的⑶r2和包含seq id n0:13的⑶r3。在某些实施方案中，所述人源化抗 体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，其中所述重链包含包含seq id no 14 的 cdr1、包含 seq id no 15 的 cdr2 和包含 seq id no 16 的 cdr3 ；并且其中所 述轻链包含包含seq id no 17的cdrl、包含seq id no 18的cdr2和包含seq id no 19 的 cdr3。在另一实施方案中，ephb4抑制剂是可溶性多肽，其选自(i)包含ephb4蛋白质 胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述ephb4多肽是单体并特异性结合ephrin b2 多肽；和(ii)包含ephrin b2蛋白质胞外域的氨基酸序列的可溶性多肽，其中所述可溶性 ephrin b2多肽是单体并以高亲和力结合ephb4多肽。在某些实施方案中，所述可溶性多肽 包含ephb4蛋白质的球形结构域。在其它方面，所述可溶性多肽包含与ephb4氨基酸序列 的1-522残基至少90%同一的序列。在另一方面，所述可溶性多肽包含与ephb4氨基酸序 列的1-412残基至少90%同一的序列。在其它实施方案中，所述可溶性多肽包含与ephb4 氨基酸序列的1-312残基至少90%同一的序列。此外，所述可溶性多肽包含与ephb4氨基 酸序列的1-225残基至少90%同一的序列。所述可溶性多肽还可以是融合蛋白，或可以包 含一个或更多个修饰的氨基酸残基。在某些优选实施方案中，所述可溶性多肽抑制ephrin b2和ephb4之间的相互作用，或抑制ephrin b2和ephb4的聚集。在其它实施方案中，所述 可溶性多肽抑制ephrin b2或ephb4的磷酸化。在其它实施方案中，所述ephb4抑制剂选自核酸化合物和核酸类似物。在某些实 施方案中，所述核酸化合物的长度为约15-100个核苷酸，在生理条件下与seq id no 267 中阐明的ephb4核酸序列杂交并降低所述ephb4的表达。在某些实施方案中，所述核酸 选自rnai构建体和反义寡核苷酸。在某些实施方案中，所述rnai构建体选自dsrna或 sirna。在某一实施方案中，所述sirna的长度约为19-30个核苷酸。在某一实施方案中， 所述sirna的长度约为21-23个核苷酸。在某一实施方案中，所述反义寡核苷酸的长度约 为19-30个核苷酸。在某些方面，所述sirna序列选自seq id no 1和seq id no :2。在某些方面，ephb4抑制剂具有抗癌活性。在某些实施方案中，所述抗癌活性选自 抑制肿瘤生长、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞迁移、抑制癌细胞的转移、抑制血管发生和引 起肿瘤细胞死亡。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞死亡归因于程序性细胞死亡。在某些 实施方案中，所述ephb4抑制剂通过胱天蛋白酶-8的活化来引起程序性细胞死亡。在某些 实施方案中，卵巢癌包含一个或更多个表达ephb4的癌细胞。在某些实施方案中，用药学上可接受的载体配制所述ephb4抑制剂。在本公开内容方法的某些实施方案中，相比于来自相当组织的非癌细胞，卵巢癌 细胞表达更高水平的ephb4。在某些实施方案中，所述卵巢癌是转移的。在其它实施方案 中，所述卵巢癌依赖血管发生。在其它实施方案中，所述卵巢癌不依赖血管发生。在某些方面，本公开内容的方法还包括至少一种额外的抗癌化学治疗剂，其与 ephb4抑制剂以累加或协同方式抑制卵巢癌细胞。在某些实施方案中，所述化学治疗剂和所 述ephb4抑制剂顺序施用。在某些实施方案中，所述化学治疗剂和所述ephb4抑制剂同时 施用。在某些实施方案，本公开内容的方法还包括至少一种额外的抗血管发生剂，其与 ephb4抑制剂以累加或协同的方式抑制血管发生。在某些实施方案中，所述抗血管发生剂和 所述ephb4抑制剂顺序施用。在某些实施方案中，所述抗血管发生剂和所述ephb4抑制剂 同时施用。在某些方面，本公开内容提供了在受试者中降低卵巢癌生长速率的方法，所述方 法包括施用一定量的ephb4抑制剂以降低卵巢癌的生长速率。在其它方面，所述公开内容 提供了治疗患有卵巢癌患者的方法，所述方法包括(a)在患者中鉴定具有表达ephb4的大 量癌细胞的肿瘤；和(b)向所述患者施用ephb4抑制剂。在某些方面，本公开内容提供了在 受试者中降低卵巢癌生长速率的方法，所述方法包括施用足以降低卵巢癌生长速率的量的 ephb4抑制剂。在某些方面，本公开内容提供了 ephb4抑制剂在制备用于治疗卵巢癌的药物中的 用途。在另一方面，本申请提供了检测受试者是否患有卵巢癌或是否具有发生卵巢癌风 险的方法，所述方法包括(a)从所述受试者中获得样品；和(b)评估样品中ephb4蛋白质 和/或mrna的水平，其中ephb4蛋白质和/或mrna的水平升高表明所述受试者患有卵巢 癌或处于发生卵巢癌的风险中。在一些实施方案中，ephb4蛋白质或mrna的水平是正常卵 巢组织中水平的至少两倍。在某些实施方案中，哺乳动物是人类。在某些实施方案中，所述 卵巢癌是转移性卵巢癌。在一些方面，在基于抗体的测定中评估ephb4蛋白质的表达水平。 在某些实施方案中，所述方法可在处于发生卵巢癌风险的受试者、患有早期疾病的受试者 和患有晚期疾病的受试者中进行辨别。在某些方面，本公开内容提供对患有卵巢癌的患者进行预后的方法，所述方法包 括(a)从所述受试者中获得样品；(b)评估样品中ephb4蛋白质和/或mrna的表达水平， 其中ephb4蛋白质和/或mrna的水平升高表示预后不良。在某些实施方案中，ephb4蛋白 质和/或mrna的高水平是正常卵巢组织中ephb4水平的两倍。在某些实施方案中，ephb4 的高水平是正常卵巢组织中ephb4水平的四倍。在某些实施方案中，ephb4的高水平是正 常卵巢组织中ephb4水平的十倍。在某些实施方案中，ephb4的高水平是正常卵巢组织中 可检测水平的ephb4。在某些实施方案中，样品选自组织样品、血液样品或血清样品。在某些实施方案中，所述哺乳动物是人类。在某些实施方案中，所述卵巢癌是转移 性卵巢癌。在另一方面，本申请提供ephb4抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻 链可变区，其中所述重链可变区包含包含seq id no :261的⑶r1、包含seq id no 262的cdr2和包含seq id no 263的cdr3 ；并且其中所述轻链可变区包含包含seq id no 264 的cdr1、包含seq idno 265的cdr2和包含seq id no 266的cdr3。在某些实施方案中， 所述重链可变区包含seq id no :42的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含seq id no: 39的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述抗体是人源化抗体或其抗体片段。在另一方面，本申请提供用于诊断卵巢癌的试剂盒，其包含抗ephb4抗体或抗 ephb4结合抗体片段、可检测标记和使用所述试剂盒的说明书。在某些实施方案中，所述可 检测标记是荧光的或生色的。在某些实施方案中，所述试剂盒包含辣根过氧化物酶或碱性 磷酸酶。在某些实施方案中，所述抗体或其抗体片段结合ephb4的c末端部分。本申请涵盖了任何上述方面和实施方案的组合。附图简述
图1a-1c显示ephb4在人卵巢肿瘤样品中表达并与晚期、腹水存在及低存活率相 关。(a)阴性(缺少一级抗体)对照(a)、正常卵巢上皮(b)和侵入性卵巢癌(c)中ephb4 的代表性免疫组织化学过氧化物酶染色。在x200的原始放大倍数下获取所有图片。(b)临 床和病理学变量与卵巢癌中ephb4的过表达之间的相关性。(c)患有侵入性卵巢癌的患者 使用log-rank统计方法，基于ephb4染色强度的kaplan-meier存活。图2a-2d显示卵巢癌细胞系表达受孕酮下调的功能ephb4。(a)来自各卵巢癌细 胞系的20 μ g总细胞裂解物在4-20% tris-甘氨酸凝胶上跑胶并转移到pvdf膜上。该膜 依次用抗ephb4、抗ephrinb2和抗β肌动蛋白抗体探测。(b)hey细胞血清饥饿过夜并在所 示的多个时期用3 μ g/ml聚集的ephrinb2/fc或单独用fc进行刺激。ephb4从100 μ g全 细胞裂解物中免疫沉淀下来并通过抗磷酸酪氨酸抗体免疫印迹(上图)分析磷酸化状态。 以一式两份的膜探测ephb4，以记载免疫沉淀作用的效率(下图)。(c)用不同剂量的孕酮 和雌激素处理hoc-7 (卵巢癌)和mcv-50 (卵巢囊腺瘤)细胞36小时并通过免疫印迹分析 细胞裂解物的ephb4、ephrinb2和β肌动蛋白的表达。(d)将ixlo4 hoc-7细胞接种于 48孔板的各孔中并用不同剂量的孕酮和雌激素处理72小时。通过mtt测定评估细胞活力 并将存活表述为相对于未处理细胞的吸光度的百分比。图3a-3e显示ephb4击倒(knockdown)导致肿瘤细胞程序性死亡。(a)用ephb4 特异性sirna (ephb4-sirna)瞬时转染hev细胞，并在48小时后，通过免疫印迹分析20 μ g 全细胞裂解物的ephb4和β肌动蛋白水平(上图)。用突变的ephb4 sirna δ或天然的 ephb4-sirna转染1 x io4hey细胞并接种于48孔板中。在48小时，通过mtt测定评估细 胞活力，并将存活表述为吸光度相对于未处理细胞的百分比(下图)。(b)用多种剂量的 ephb4特异性odn(as-io)处理hey细胞。72小时后，通过免疫印迹分析20 μ g总细胞裂解 物的ephb4和β肌动蛋白水平(上图)。用乱序的或as-io odn处理ix io4 hey细胞。在 72小时，通过mtt测定评估细胞活力，并将存活表述为吸光度相对于未处理细胞的百分比。 (c)用 ephb4 特异性 sirna(ephb4-sirna)或突变的 sirna (ephb4_sirna δ )瞬时转染hey 细 胞。如方法部分中详细说明，使用全细胞裂解物通过elisa分析程序性细胞死亡的胞质核 小体。(d)在这些细胞中通过比色分析法测定胱天蛋白酶_8和胱天蛋白酶-9的激活并将其 表述为相对于脂质转染胺(lipofectamine)处理细胞的百分比活性。(e) wit脂质转染胺单 独处理(对照)或 25nm ephb4 特异性 sirna (ephb4 sirna)或突变体 sirna (ephb4sirna δ ) 处理36小时的hey细胞的细胞周期分析。指出了 go、gl、s、g2和m期中细胞的％。在三组独立实验中获得了类似的结果。图4a-4b显示ephb4有助于肿瘤细胞迁移和侵入。(a)用塑料巴斯德吸管刮hey 细胞的汇合培养物，以产生3mm宽的单层无细胞区。超过9小时后评估转染25nm ephb4特 异性(ephb4 sirna)或突变体sirna(ephb4 sirnaa)后细胞迁移并闭合伤口的能力。(b) 如方法中所述，研究了 hey细胞向基质胶(matrigel)包被的inserts的侵入。将响应下层 室中loyg/ml egf侵入insert下面的细胞固定并用吉姆萨(giemsa)染色。显示了代表 性的显微照片。图5a-5b显示ephb4特异性反义odn在鼠类卵巢癌异种移植模型中抑制肿瘤生 长。㈧将2x106 hey细胞植入10到12周大雌性balb/c裸鼠的胁腹中，并如方法部分详 细说明来测定肿瘤体积。从细胞植入后第4天开始每天经腹膜内向小鼠单独施用载体(载 体)，或10mg/kg乱序odn (乱序的)或ephb4特异性反义odn(as-io)。5周后处死动物并 收集肿瘤。(b)用苏木精/曙红对福尔马林固定的石蜡包埋切片的5μπι切片进行染色并 通过免疫组织化学分析ki-67和⑶31的表达。使用原位程序性细胞死亡染色试剂盒通过 tunel来评估程序性细胞死亡。不知情的观察者在5个随机高倍视野下将阳性染色的细胞 数进行平均，并在各显微照片中进行了说明。as-io与对照组之间* ρ <0.05。左下图中的 标尺在h/e中表示200 μ m，在⑶31中表示100 μ m，在其它显微照片中表示75 μ m。图6显示mab265可变轻链序列与种系序列的比对。图7显示mab265可变重链序列与种系序列的比对。图8显示针对ephb4产生的单克隆抗体和这些抗体表位作图。显示了 ephb4胞外 域的拓扑结构，包括球形结构域(g)、富含半胱氨酸的结构域(c)和两个纤连蛋白类型3结 构域(fl和f2)。图9显示了 b4ecv3蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割eph b4前导肽的前 体序列)。图10显示了 b4ecv3nt蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割ephb4前导肽的 前体的序列)。图11显示了 b4ecv3-fc蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割eph b4前导肽 的前体的序列)。图12显示了 b2ec蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割ephrinb2前导肽的 前体的序列)。图13显示了 b2ec-fc蛋白质的氨基酸序列(显示了包括未切割ephrin b2前导 肽的前体的序列)。图14显示了人ephrin b2的氨基酸序列。发明详述i.综述本发明部分基于这样的发现，通过印hrin/印hrin受体(印hrin/印h)途径的信号 转导促进卵巢肿瘤发生。申请人检测了卵巢肿瘤组织中ephb4的表达，并开发了用于阻断 通过eph的信号转导的抗肿瘤治疗剂。因此，在某些方面，本公开内容提供了可用于治疗卵 巢癌的许多化合物(试剂)。卵巢癌是由一个或两个卵巢生殖腺内细胞快速生长和分裂产生的疾病，在所述生殖腺中产生卵，或卵子和雌性激素。卵巢含有在正常环境下生殖以维持组织健康的细胞。当 失去了生长控制并且细胞分裂太多并太快时，就会形成细胞块或肿瘤。如果所述肿瘤限制 在少数细胞层中，例如表面细胞中，并且它并不侵入周围组织或器官，认为它是良性的。如 果所述肿瘤扩散到周围组织或器官中，认为它是恶性的或癌性的。当癌细胞从最初的肿瘤 中逃选出来，经血液或淋巴管前进，并在身体其它部分内生长时，该过程称作转移。可以将卵巢肿瘤广义地分为三种类别，来自表面上皮、生殖细胞和特化基质的那 些肿瘤。来自卵巢表面的肿瘤占卵巢肿瘤的绝大多数(大约80%)并被称作表面上皮肿 瘤。这些肿瘤组成了通常认为的“卵巢癌”。表面上皮肿瘤进一步细分为三种类别良性的、 边缘的(低恶性潜在性[lmp]或不规则增殖)和侵入性癌。良性肿瘤和侵入性癌的行为是 很好理解的，但围绕中间(边缘)组的诊断、预后和治疗却有大量的争论。这些肿瘤倾向于 在更年轻的妇女中发生并可经常进行保守治疗。保守治疗允许妇女保持她们的生育力并保 留卵巢激素的产生，在侵入性癌治疗进行时，如果去除两个卵巢，则所述卵巢激素的产生将 会丧失。然而，保守治疗依赖于正确的组织学(病理学)诊断。卵巢肿瘤诊断的大多数失 误发生在“边缘”肿瘤范畴内。表面上皮肿瘤基于细胞分化模式和肿瘤级别也可进行细分。 最后，手术后残留肿瘤的阶段和量提供了用于预测行为并设计后续治疗的重要信息(交叉 参考)。生殖细胞肿瘤是最不常见的卵巢肿瘤，占卵巢肿瘤的大约10-15%。它们来自卵 母细胞(卵子)。这些肿瘤，像表面上皮肿瘤也可以是良性的或恶性的。然而没有中间组。 良性肿瘤几乎总是成熟的囊性畸胎瘤或所谓的“皮样囊肿”，并通过去除肿瘤的同时保留未 涉及的卵巢组织而得到成功治疗。其它治疗不是必需的。恶性生殖细胞肿瘤在去除后需要 加强的多剂化学疗法。所述治疗与手术治疗表面上皮肿瘤后施用的化学治疗完全不同。最后，占卵巢肿瘤大约5-10%的最少见类型的卵巢肿瘤是来自卵巢基质成分的那 些肿瘤。因为激素的产生(雌性激素如雌二醇和孕酮，雄性激素如睾酮、脱氢表雄酮[dhea] 和androstendione)在基质中发生，来自卵巢该部分的肿瘤可与性类固醇激素的异常产生 相关。这可导致在生殖年龄和绝经后妇女中异常的阴道出血和儿童的性早熟。产生雄性激 素的卵巢肿瘤可引起多毛症(身体多个部位毛发生长增快)，并且在极端情况下会引起男 性化，其特征在于体毛增多、声音深沉、秃头、肌肉块增大和阴蒂增大。 如此处所用，术语“ephrin”和“eph”分别用于指配体和受体。它们可来自多种动 物(例如，哺乳动物/非哺乳动物、脊椎动物/无脊椎动物，包括人类)中的任何一种。此处描述的工作(尤其是在实施例中描述的工作)指ephrin b2和ephb4。然 而，本发明涵盖了它们各自家族中的任何ephrin配体和/或eph受体，所述家族在卵巢肿 瘤中表达。所述ephrin (配体)有两种结构类型，其在序列关系的基础上可进一步细分，并 且在优先结合的基础上，它们在功能上显示出两种相应的受体亚组。在结构上，有两种类型 的^hrin 通过甘油磷脂酰肌醇(gpi)连接膜锚定的那些类型和通过跨膜结构域锚定的那 些类型。通常，配体分成ephrin-a亚类，其为优先结合epha受体的gpi连接的蛋白质，和 ephrin-b亚类，其为一般优先结合ephb受体的跨膜蛋白质。eph家族受体是受体蛋白酪氨酸激酶家族，其与eph相关，所述eph以其在产生促 红细胞生成素的人类肝细胞癌细胞系中的表达命名。在它们胞外域序列的亲缘关系和优先 结合ephrin-a蛋白质或ephrin-b蛋白质的能力的基础上，可将它们分成两个亚组。优先与ephrin-a蛋白质相互作用的受体是epha受体，优先与ephrin-b蛋白质相互作用的那些 受体是ephb受体(参阅出版的美国专利申请20050164965和20050249736)。eph受体具有胞外域，其由配体结合球形结构域、富含半胱氨酸区域后连一对纤连 蛋白类型iii重复序列组成。胞质区由含有两个保守酪氨酸残基的近膜区域；蛋白质酪氨 酸激酶结构域；无效的α-基序(sam)和pdz-结构域结合基序组成。ephb4对膜结合配体 ephrin b2 是特异性的(sakano，s.等 1996 ；brambiila r.等 1995)。ephrin b2 属于 eph 配体类，所述配体具有跨膜结构域和具有5个保守酪氨酸残基和pdz结构域的胞质区。eph 受体通过结合聚集的膜附着的^hrin而被激活(davis s等，1994)，这说明eph的激活需 要表达受体的细胞与表达配体的细胞之间的接触。配体结合后，eph受体二聚体化并将近膜酪氨酸残基自磷酸化，以获得完全的激活 (kalo ms等，1999，birms ks, 2000) 0除上述通过eph受体的正向信号转导外，反向信号转 导可通过印hrin b发生。ephrin的eph衔接导致保守胞内酪氨酸的快速磷酸化(bruckner k，1997)和pdz结合蛋白质的些许较慢募集(palmer a 2002)。近来，若干研究已经显示 eph/ephrin的高表达可能与肿瘤生长、致肿瘤性和转移的潜力提高相关(easty dj, 1999 ； kiyokawa e,1994 ；tang xx，1999 ；vogt t,1998 ；liu w,2002 ；stephensonsa, 2001 ；steube kg 1999 ；berclaz g, 1996)。ii.核酸治疗剂本公开内容涉及用于抑制或降低卵巢癌中印hrin和/或^hrin受体(eph)的基 因表达的方法。“抑制”或“降低”指基因的表达，或核酸或编码一种或更多种蛋白质或蛋白 质亚基(如ephrin b2和/或ephb4)的等同核酸的水平降低到在本公开内容核酸治疗剂 缺失下观察到的水平之下。“基因”指编码rna的核酸，例如核酸序列，包括但不限于编码多 肽的结构基因。如此处所用，术语“核酸治疗剂”或“核酸试剂”或“核酸化合物”指任何基于核酸 的化合物，其含有核苷酸并对靶基因上具有想要的作用。核酸治疗剂可以是单链、双链或多 链的，并可包含修饰的或未修饰的核苷酸或非核苷酸或多种混合物，及其组合。本公开内容 的核酸治疗剂的实例包括，但不限于，反义核酸、dsrna、sirna和酶核酸化合物。在一个实施方案中，本公开内容描述了一种或更多种核酸治疗剂，所述核酸治疗 剂单独或组合调节编码ephrin b2蛋白质(例如，genbank登录号np_004084)的ephrin b2基因或编码ephb4蛋白质(例如，genbank登录号np_004435)的ephb4受体基因的表 达。在出版的美国专利申请20050164965和20050249736中列出了可根据该申请的方法使 用的核酸构建体的实例，如下文列出的那些在本文中以其整体引入作为参考。表1.通过ephb4反义探针抑制ephb4基因表达 a.反义核酸在某些实施方案中，本公开内容涉及反义核酸。“反义核酸”指非酶核酸化合物，其 通过rna-rna、rna-dna或rna-pna (蛋白质核酸)相互作用结合靶核酸并改变所述靶核酸 的活性(对于综述，参阅stein和cheng，1993 science 261，1004和wool等，美国专利号 5，849，902)。通常，反义分子沿反义分子的单一相邻序列与靶序列互补。然而，在某些实施 方案中，反义分子可形成环并结合形成环的底物核酸。因此，反义分子可与两个(或更多) 不相邻的底物序列互补，或者反义分子的两个(或更多)不相邻的序列部分可与靶序列互 补，或者两者均可。对于目前反义策略的综述，参阅schmajuk等，1999，j.biol· chem.，274， 21783-21789，delihas 等，1997，nature,15，751-753，stein 等，1997，antisense n. a. drug dev.,7,151, crooke,2000, methods enzymo1. ,313,3—45 ；crooke,1998, biotech. genet. eng. rev.，15，121—157，crooke,1997，ad.pharmacol.，40，1-49 此外，反义dna通过dna-rna相互作用可用于靶定核酸，由此激活rna酶h，其消化 双链体中的靶核酸。反义寡核苷酸可包含一个或更多个rna酶h激活区，其能够激活rna 酶h以切割靶核酸。可以化学合成反义dna或通过使用单链dna表达载体或其等同物表达 反义dna。“rna酶h激活区”指能够结合靶核酸以形成被细胞rna酶h酶识别的非共价复 合体的核酸化合物的区域(通常长度大于或等于4-25个核苷酸，优选长度为5-11个核苷 酸)(参阅例如arrow等，美国专利号5，849，902 ；arrow等，美国专利号5，989，912)。所述 rna酶h酶结合核酸化合物-靶核酸复合体并切割所述靶核酸序列。rna酶h激活区包含，例如磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、5 ‘-硫代磷酸 酯、氨基磷酸酯或甲基膦酸酯骨架化学或其组合。除上述一种或更多种骨架化学外，rna酶 h激活区还可包含多种糖化学。例如，所述rna酶h激活区可包含脱氧核糖、阿拉伯糖、氟代 阿拉伯糖或其组合、核苷酸糖化学。本领域技术人员将认识到上述为非限制性实例，并且核 酸的磷酸、糖和碱基化学的任何组合(其支持rna酶h酶的活性)处于rna酶h激活区的 定义和本公开内容的范围内。因此，本公开内容的反义核酸包括天然类型的寡核苷酸和修饰寡核苷酸，其包括 硫代磷酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、二硫代磷酸酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、甲基膦酸 酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、氨基磷酸酯_类型的寡脱氧核糖核苷酸、h膦酸酯类型的寡脱 氧核糖核苷酸、三酯类型的寡脱氧核糖核苷酸、α异头物类型的寡脱氧核糖核苷酸、肽核 酸、其它人造核酸和核酸修饰的化合物。
其它修饰包括寡核苷酸分子内部的或末端的那些修饰，并包括向分子添加核苷酸 间磷酸键，如胆固醇、胆固醇基或在氨基和末端核糖之间具有不同数目碳残基的二胺化合 物、脱氧核糖和磷酸修饰，其切割或与相反链或结合的酶或结合基因组的其它蛋白质交联。 这种修饰的寡核苷酸的实例包括具有修饰碱基和/或糖(如阿拉伯糖替代核糖)的寡核苷 酸，或3' ,5'取代的寡核苷酸，其具有在其3'和5'位置附着到除了羟基(在其3'位 置)和磷酸基团(在其5'位置)之外的化学基团的糖。糖修饰的其它实例包括核糖部分2'位置的修饰，其包括但不限于用含有1-6个 饱和或不饱和碳原子的一o-低级烷基、或--o-芳基、或具有2-6碳原子的烯丙基取代的 2' -0-，其中该一o-烷基、芳基或烯丙基可以是未被取代或被取代的(例如被卤素、羟基、 三氟甲基、氰基、硝基、酰基、酰氧基、烷氧基、羧基、烷氧羰基或氨基取代)，或被氨基或卤素 取代。本公开内容的十分重要的寡核苷酸的非限制性实例在其3'、5'或31和5'末端具 有2' -0-烷基化的核糖核苷酸，其中至少4个或5个相邻核苷酸被如此修饰。2' -0-烷 基化基团的实例包括，但不限于，2' -0-甲基、2' -0-乙基、2' -0-丙基和2' -0-丁基。在某些情况下，例如可利用abi (applied biosystems inc.)制造的381adna合 成仪或394dna/rna合成仪，根据亚磷酰胺方法进行天然类型反义核酸和修饰的反义核 酸的合成(参阅从 abi,或 f. eckstein, oligonucleotidesand analogues :a practical approach, irl press (1991)获得的说明书)。在所述亚磷酰胺方法中，通过使用含受基 团(如氰基乙基)保护的亚磷酰胺的试剂，在修饰的脱氧核糖核苷或修饰的核糖核苷的 3'-末端与另一修饰的脱氧核糖核苷、修饰的核糖核苷、修饰的寡脱氧核糖核苷酸或修饰 的寡核糖核苷酸的5' _末端之间进行缩合来合成核酸相关分子。完成该合成的最后一个 循环，以产生具有结合到糖部分5'-末端的羟基上的保护基(例如，二甲氧基三苯甲基基 团)的产物。在室温下合成的寡聚物从支持物上切割下来，并且其核苷酸和磷酸部分被去 保护。在该方式中，天然类型的寡核酸化合物以原始形式获得。也可以通过亚磷酰胺方法， 使用来自abi的合成仪以类似于上述天然类型的方式合成硫代磷酸酯类型的核酸。合成的 最后一个循环后的程序也与天然类型的相同。可以常见方式，例如乙醇沉淀，或反相层析、高效液相层析(hplc)中的离子交 换层析和凝胶过滤层析、超临界流体层析来纯化因此获得的原始核酸(天然类型或被修 饰的)，并可以通过电泳进一步纯化。也可以使用用于反相层析的柱体，如tcls-packed seppak plus (long body/env) (waters)。可通过hplc来分析天然类型的和被修饰的(例 如，硫代磷酸酯类型的)核酸的纯度。在某些实施方案中，本公开内容的反义核酸例如可以作为表达质粒进行递送， 当在细胞中转录时，所述表达质粒产生与细胞mrna的至少独特部分互补的rna，所述细 胞mrna编码印hrin b2或ephb4多肽。或者，所述构建体是寡核苷酸，其离体产生，并且 当引入细胞中时，通过与编码^hrin b2或ephb4多肽的mrna和/或基因组序列杂交引 起对表达的抑制。这种寡核苷酸探针是任选被修饰的寡核苷酸，其对内源核酸酶(例如 外切核酸酶和/或内切核酸酶)有抵抗力，并因此在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸 的示例性核酸化合物是dna的氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯类似物(也参阅美 国专利号 5，176，996 ;5，264，564 ；和 5，256，775)。此外，例如，van der krol 等，(1988) biotechniques 6 :958_976 ；和 stein 等，(1988)cancer res 48 :2659_2668 已经综述了构建用于核酸疗法的寡聚体的一般方法。b. dsrna 和 rnai 构津体在某些实施方案中，本公开内容涉及双链rna (dsrna)和rnai构建体。如此处所 用，术语“dsrna”指能够rna干扰(rnai)的双链rna分子，包括sirna(参阅例如，bass, 2001，nature,411,428-429 ；elbashir 等，2001，nature，411，494-498 ；和 kreutzer 等， pct 公布号 wo 00/44895 ；zernicka-goetz 等，pct 公布号 wo 01/36646 ；fire, pct 公布 号 w099/32619 ；plaetinck 等，pct 公布号 wo 00/01846 ；mello 和 fire, pct 公布号 wo 01/29058 ；deschamps-depaillette, pct 公布号 wo 99/07409 ；和 li 等，pct 公布号 wo 00/44914)。此外，rnai是最初应用于在植物和蠕虫中观察到的现象的术语，在所述植物和 蠕虫中双链rna(dsrna)以特异的和转录后的方式阻断基因表达。rnai提供了在体外或在 体内抑制基因表达的有用方法。如此处所用，术语“短干扰rna”、“sirna”或“短干扰核酸”指当适当处理细胞时能 够介导rnai或基因沉默的任何核酸化合物。例如，所述sirna可以是包含自身互补的有义 和反义区的双链多核苷酸分子，其中所述反义区包含与靶核酸化合物(例如ephrin b2或 ephb4)的互补性。所述sirna可以是具有自身互补的有义和反义区的单链发夹多核苷酸， 其中所述反义区包含与靶核酸化合物的互补性。所述sirna可以是环形单链多肽，其具有 两个或更多个环结构和包含自身互补的有义和反义区的茎，其中所述反义区包含与靶核酸 化合物的互补性，并且其中可以在体内或在体外处理所述环形多核苷酸，以产生能够介导 rnai的活性sirna。所述sirna也可包含与靶核酸化合物具有互补性的单链多核苷酸，其 中所述单链多核苷酸可进一步包含末端磷酸基，如5'-磷酸基(参阅例如martinez等， 2002，cell.，110,563-574)，或 5'，3' -二磷酸基。任选地，本公开内容的sirna含有核苷酸序列，所述核苷酸序列在细胞生理条件 下与待抑制的基因(“靶”基因)的mrna转录物至少一部分的核苷酸序列杂交。双链rna 仅需要与具有介导rnai能力的天然rna足够类似。因此，本公开内容具有能够承受可能由 于遗传突变、品系多态性或进化趋异而造成序列变异的优势。靶序列与sirna序列之间耐 受的核苷酸错配的数目不超过5个碱基对中1个、或10个碱基对中1个、或20个碱基对中1 个、或50个碱基对中1个。sirna双链体中心的错配是最重要的并可能基本上破坏靶rna的 切割。相反，与靶rna互补的sirna链3'末端的核苷酸并不显著促进靶标识别的特异性。可 通过本领域已知的序列比较和比对算法(参阅gribskov和devereux，sequence analysis primer, stockton press，1991，及其中引用的参考文献)并通过如bestfit软件程序中实 现的 smith-waterma 算法(例如 university of wisconsin genetic computinggroup)使 用默认参数计算核苷酸序列之间的百分比差异来优化序列同一性。优选sirna和靶基因 部分之间高于90%的序列同一性，或甚至100%的序列同一性。或者，rna的双链体区可在 功能上被定义为核苷酸序列，其能够与靶基因转录物的部分进行杂交(例如，400mm nacl, 40mm pipesph 6. 4，imm edta，50°c或 70°c杂交 12-16 小时，然后进行洗涤)。可通过单条自身互补的rna链、两条互补rna链，或dna链和互补rna链形成dsrna 的双链结构。任选地，可在细胞内或细胞外开始rna双链体形成。可以以允许递送每个细 胞至少一个拷贝的量引入rna。更高剂量(例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000个拷 贝)的双链材料可产生更有效的抑制，而更低剂量也可用于特定应用。因为对应于rna双链体区的核苷酸序列是遗传抑制的靶标，所以抑制是序列特异性的。如此处所用，目的sirna长度大约19-30个核苷酸，甚至更优选长度为21_23个核 苷酸。所述sirna理解为募集核酸酶复合体并通过与特异性序列配对将所述复合体引至靶 mrna。结果，所述靶mrna被蛋白质复合体中的核酸酶降解。在特定实施方案中，21-23个核 苷酸的sirna分子包含3'羟基。在某些实施方案中，可通过更长双链rna，例如在切丁酶 的存在下进行加工产生所述sirna构建体。在一个实施方案中，使用果蝇体外系统。在该 实施方案中，dsrna与来自果蝇胚胎的可溶性提取物混和，由此产生混合物。在将dsrna被 加工成约21到约23个核苷酸的rna分子的条件下维持所述混合物。可使用本领域技术人 员已知的许多技术来纯化所述sirna分子。例如，凝胶电泳可用于纯化sirna。或者，非变 性方法，如非变性柱层析可用于纯化sirna。此外，层析(例如，大小排阻层析)、甘油梯度 离心、使用抗体的亲和纯化可用于纯化sirna。可通过化学合成方法或通过重组核酸技术进行目的dsrna(例如，sirna)的制备。 被处理细胞的内源rna聚合酶可介导体内转录，或者克隆的rna聚合酶可用于体外转录。如 此处所用，本公开内容的dsrna或sirna分子不必局限于仅含有rna的那些分子，还包含化 学修饰的核苷酸和非核苷酸。例如，所述dsrna可包括对磷酸-糖骨架或核苷的修饰，例如 以降低对细胞核酸酶的敏感性、提高生物利用率、改善配制特性，和/或改变其它药物代谢 动力学性质。为了说明，可修饰天然rna的磷酸二酯键以包括至少一个氮或硫杂原子。可对 rna结构中的修饰进行定制，以避免在对dsrna —般性响应的同时允许特异性的遗传抑制。 同样，可修饰碱基，以阻断腺苷脱氨酶的活性。可通过酶促产生dsrna或通过部分/完全的 有机合成产生dsrna，可通过体外酶促合成或有机合成引入任何被修饰的核糖核苷酸。可 调整化学修饰rna分子的方法用于修饰dsrna (参阅，例如，heidenreich等(1997) nucleic acids res，25:776-780 ;wilson 等(1994)jmol recog 7 :89_98 ;chen 等(1995)nucleic acids res 23 :2661_2668 ;hirschbein 等(1997) antisense nucleic acid drug dev 7 55-61)。仅为了说明，可使用硫代硫酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯、嵌合甲基膦酸酯-磷 酸二酯、肽核酸、含5-丙炔基嘧啶的寡聚体或糖修饰(例如，2’-取代的核糖核苷，a-构型) 修饰dsrna的骨架。在某些情况下，本公开内容的dsrna缺少含2'-羟基(2' -0h)的核 苷酸。在特定实施方案中，sirna分子的至少一条链具有长度约1到约6个核苷酸的3' 突出端，然而也可以为2到4个核苷酸长。更优选地，所述3'突出端长度为1-3个核苷酸。 在某些实施方案中，一条链具有3'突出端，另一条链是平末端或也可以具有突出端。对于 每条链，突出端的长度可以相同或不同。为了进一步提高sirna的稳定性，可将3'突出端 稳定化以防止降解。在一个实施方案中，通过包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟苷核苷酸来稳定 rna。或者，通过修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如2' _脱氧胸苷取代3'突出端尿苷核 苷酸可被耐受并且不影响rnai的效率。2'羟基的缺失显著增强了组织培养基中突出端的 核酸酶抵抗力，并可能在体内是有益的。在另一特定实施方案中，目的dsrna也可以是长双链rna的形式。例如，所述dsrna 为至少25、50、100、200、300或400个碱基。在一些情况下，所述dsrna长度为400-800个 碱基。任选地，所述dsrna在细胞内被消化，例如以在细胞中产生sirna序列。然而，在体 内长的双链rna的使用并不总是现实的，可能是因为由不依赖序列的dsrna响应引起的有害作用。在这样的实施方案中，优选使用降低干扰素或pkr效应的局部递送系统和/或试 剂。在其它特定实施方案中，dsrna是发夹结构形式(命名为发夹rna)。可外源合成 发夹rna或通过在体内从rna聚合酶iii启动子转录来形成发夹rna。例如在paddison 等，genes dev, 2002，16 :948_58 ；mccaffrey 等，nature，2002，418 :38_9 ；mcmanus 等，rna， 2002，8 :842-50 ;yu 等，procnatl acad sci u s a，2002，99 6047-52)中描述了产生和使 用这种发夹rna用于哺乳动物细胞中基因沉默的实例。优选地，在细胞或动物中改造这种 发夹rna，以保证对想要基因持续并稳定的抑制。本领域已知的是可通过在细胞中加工发夹 rna来产生sirna。pct申请wo 01/77350描述了用于转基因双向转录以在真核细胞中产生同一转基 因的有义和反义rna转录物的示例性载体。因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了具 有以下独特性质的重组载体其包含具有以相反方向排列的两个重叠转录单位并位于目的 dsrna的转基因侧翼的病毒复制子，其中所述两个重叠转录单位在宿主细胞中从同一转基 因片段产生有义和反义rna转录物。c.酶核酸化合物在某些实施方案中，本公开内容涉及酶核酸化合物。“酶核酸化合物，，指在底物结 合区与特定靶基因具有互补性，并还具有有效地特异性切割靶核酸的酶促活性的核酸化合 物。理解所述酶核酸化合物能够在分子间切割核酸，并由此灭活靶核酸化合物。这些互补 区允许酶核酸化合物与靶核酸之间充分杂交，并因此允许切割。优选100%互补性(同一 性)，但低至50-75 %的互补性也可用于该公开内容(参阅例如werner和uhlenbeck，1995， nucleic acids research,23,2092-2096 ；hammann 等，1999, antisenseand nucleic acid drug dev.，9，25-31)。可在碱基、糖和/或磷酸基处修饰酶核酸。如此处所述，术语“酶核 酸”与短语如核酶、催化性rna、酶rna、催化性dna、aptazyme或适配体结合核酶、调节性核 酶、催化性寡核苷酸、nucle0zyme、dna酶、rna酶、内切核糖核酸酶、内切核酸酶、“小”核酶、 leadzym^oligozyme或dna酶可互换使用。所有这些术语均描述了具有酶促活性的核酸化 合物。本申请中描述的特异性酶核酸化合物不限于在本公开内容中，并且本领域技术人员 将认识到在本公开内容的酶核酸化合物中重要的是它具有与一个或更多个靶核酸区互补 的特异性底物结合位点，并且它在赋予核酸分子核酸切割和/或连接活性的底物结合位点 内或周围具有核苷酸序列(cech等，美国专利号4，987，071 ；cech等，1988，260 jama3030)。目前已知若干种天然发生的酶核酸。每种均可在生理条件下反式催化核酸磷酸二 酯键的水解(并因此切割其它核酸化合物)。通常，酶核酸首先通过结合到靶核酸上起作 用。这种结合通过酶核酸的靶结合部分发生，所述酶核酸保持在切割靶核酸的分子的酶促 部分附近。因此，所述酶核酸首先识别靶核酸，然后通过互补碱基配对结合靶核酸，并且一 旦结合到正确的位点上，其酶促切割所述靶核酸。这种靶核酸的策略切割将破坏其指导编 码蛋白质进行合成的能力。酶核酸已经结合并切割其核酸靶标后，所述酶核酸从该核酸释 放，以寻找另一靶标并可以重复结合并切割新靶标。在特定实施方案种，目的酶核酸是设计来催化切割mrna转录物以防止mrna翻译 的核酶(参阅，例如pct国际公开w090/11364，1990年10月4日公开；sarver等，1990， science 247 =1222-1225 ；和美国专利号5，093，246)。尽管在位点特异性识别序列处切割mrna的核酶可用于破坏特定mrna，但是优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在与靶mrna 形成互补碱基对的侧翼区域指出的位置处切割mrna。唯一需要的是所述靶mrna具有以 下两碱基序列5' -ug-3 ‘。锤头状核酶的构建和产生为本领域所熟知并在haseloft 和gerlach，1988，nature, 334 585-591中有更详尽的描述。本公开内容的核酶也包括 rna内切核糖核酸酶(下文称“cech-类型核酶”)，如在嗜热四膜虫中天然存在并已经 被广泛描述的一种酶(称作ivs或l-19ivsrna)(参阅，例如，zaug，等，1984，science, 224 574-578 ；zaug 和 cech，1986，science,231 :470_475 ；zaug,等，1986，nature,324 429-433 ；universitypatents inc.的国际专利申请号 w088/04300 ；been 和 cech, 1986， cell,47 207-216)。在另一特定实施方案中，主题酶核酸是dna酶。dna酶整合了反义和核酶技术的 一些机械学特征。设计dna酶，使得它们识别特定靶核酸序列，十分像反义寡核苷酸，然而 更像核酶，它们催化性并特异性切割靶核酸。简言之，为了设计特异性识别并切割靶核酸的 理想dna酶，本领域技术人员必须首先鉴定独特的靶序列。优选地，独特地或大体上序列是 富含g/c的大约18到22个核苷酸。高g/c含量帮助保证dna酶与靶序列之间更强的相互 作用。当合成所述dna酶时，将靶定酶到信息上的特异性反义识别序列被分开，使得其包含 dna酶的两个臂，并且所述dna酶环置于所述两个特异性臂之间。制备和施用dna酶的方法 可见于例如美国专利号6，110,462中。在某些实施方案中，本公开内容的核酸治疗剂长度可以在12到200个核苷酸之 间。在一个实施方案中，本公开内容的示例性酶核酸化合物长度在15到50个核苷酸之间， 包括例如长度在25到40个核苷酸之间(例如参阅jarvis等，1996，j. biol. chem.，271， 29107-29112)。在另一实施方案中，本公开内容的示例性反义分子长度在15到75个核 苷酸之间，包括例如长度在20到35个核苷酸之间(参阅例如woolf等，1992，pnas.，89， 7305-7309 ；milner 等，1997，nature biotechnology, 15，537-541)。在另一实施方案中，本 公开内容的示例性sirna长度在20到27个核苷酸之间，包括例如长度在21到23个核苷 酸之间。本领域技术人员将认识到所有需要的是主题核酸治疗剂的长度和构型足够并适合 催化此处涵盖的反应。本公开内容的核酸治疗剂的长度不限于所述的一般极限。iii.核酸靶位点可以如draper 等 30w0 93/23569 ；sullivan 等，wo 93/23057 ；thompson 等，wo 94/02595 ；draper 等，wo 95/04818 ；mcswiggen 等，美国专利号 5，525，468 中描述来确定本 公开内容的有用的核酸化合物(例如，反义核酸、dsrna和酶核酸化合物)的靶标。其它实 例包括疾病相关基因表达灭活的以下pct申请wo 95/23225,wo 95/13380,wo 94/02595。 此处并非重复那些文件中提供的指导，下文提供了这些方法的特定实例，不限于本领域中 的那些。如那些申请中描述来设计这些靶标的酶核酸化合物、sirna和反义，并同样如所述 来合成以在体外和体内进行检测。例如，使用计算机折叠算法来筛选人ephrin 82和/或 ephb4rna的序列的最佳核酸靶标位点。鉴定了潜在的核酸结合/切割位点。例如，对于本 公开内容的酶核酸化合物，通过计算机折叠(jaeger等，1989proc. natl acad. sci. usa,86, 7706)分别对所述核酸化合物进行了分析，以评估所述序列是否折叠成正确的二级结构。如 在结合臂与催化中心之间具有不利分子内相互作用的那些核酸化合物可以不予考虑。
鉴定了目的核酸(例如，反义、rnai和/或酶核酸化合物)结合/切割位点并将其 设计以退火至核酸靶标(例如ephrin b2和/或ephb4)中的多个位点。本公开内容的酶 核酸化合物的结合臂与上述靶位点序列互补。设计反义和rnai序列，以与所述核酸靶标具 有部分或完全互补性。可化学合成所述核酸化合物。所用的合成方法遵循如下文及usman 等，1987j am. chem. soc. , 109, 7845 ；scaringe 等，1990 nucleic acids res.，18，5433 ； 和 wincott 等，1995 nucleic acids res. 23，2677-2684 ;caruthers 等，1992，methods in enzymology 211,3-19中所述的用于正常dna/rna合成的程序。此外，预计具有cpg基序的核酸治疗剂引起非特异性免疫应答的可能性增加。通 常，cpg基序包括与5’方向的一个或更多个嘌呤及3’方向的一个或更多个嘧啶相邻的 cg(胞嘧啶-鸟苷)。在本领域中可获得已知cpg基序的列表。将选择优选的核酸疗法，以 对靶基因具有选择性效应(可能影响其它紧密相关的基因)，而不触发全身免疫应答。通过 避免具有cpg基序的核酸治疗剂，降低特定核酸将触发免疫应答的可能性是可能的。iv.核酸治疗剂的合成使用自动化方法合成长度超过100个核苷酸的核酸是困难的，并且这些分子的治 疗成本令人望而却步。在本公开内容中，小核酸基序(小是指长度少于约100个核苷酸，优 选长度少于约80个核苷酸，并更优选长度少于约50个核苷酸的核酸基序(例如，反义寡核 苷酸、酶核酸和rnai构建体))优选用于外源递送。这些分子的简单结构增强了核酸侵入 rna结构靶区域的能力。化学合成本公开内容的示例性分子，并且可类似地合成其它分子。为了说明，如 caruthers 等，1992，methods in enzymology 211,3-19, thompson 等，国际 pct 公布号 wo 99/54459，wincott 等，1995，nucleicacids res.23，2677-2684，wincott 等，1997，methods mol. bio.，74，59，brennan 等，1998，biotechnol bioeng.，61，33-45，和 brennan，美国专利 号6，001，311中所述，使用本领域已知的方案合成寡核苷酸(例如，dna)。寡核苷酸的合 成利用常见的核酸保护和偶联基团，如5'末端的二甲氧基三苯甲基，和3'末端的亚磷酰 胺。在非限制性实例中，在394 appliedbiosystems, inc.合成仪上，以2' 甲基化核 苷酸的2. 5分钟偶联步骤和2' _脱氧核苷酸的45秒偶联步骤进行小规模合成。或者，可 在96孔板合成仪(如由protogene (palo alto, ca)生产的仪器)上，对循环做最小修改后 进行合成。任选地，可分别合成本公开内容的核酸化合物，并且例如通过连接在合成 后连接在一起(moore 等，1992，science 256，9923 ；draper 等，国际 pct 公布号 wo 93/23569 ;shabarova 等，1991， nucleic acids research 19，4247 ;bellon 等，1997， nucleosides&nucleotides,16,951 ；bellon 等，1997, bioconj ugate chem. 8,204)。优选地，广泛修饰本公开内容的核酸化合物，以通过用核酸酶抗性基团，例如 2'-氨基、2' -c-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -h进行修饰来提高稳定性(对于 综述，参阅 usman 和 cedergren，1992，tibs 17，34 ;usman 等，1994，nucleic acids symp. ser.31，163)。使用普通方法通过凝胶电泳来纯化核酶或通过高压液相层析(hplc;见 wincott等，上文，此处其整体引入作为参考)来纯化核酶，并在水中将其重悬浮。v.优化核酸化合物的活性具有修饰(例如，碱基、糖和/或磷酸)的核酸化合物可防止被血清核糖核酸酶降解，并由此提高它们的效能。本领域中有若干实例描述糖、碱基和磷酸修饰，其可被引 入核酸化合物，显著提高它们的核酸酶稳定性和功效。例如，通过用核酸酶抗性基团，例如 2'-氨基、2' -c-烯丙基、2'-氟、2' -0-甲基、2' -h、核苷酸碱基修饰来修饰寡核苷 酸，以提高稳定性和/或增强生物活性(对于综述，参阅usman和cedergren，1992，tibs 17, 34 ；usman 等，1994, nucleic acids symp. ser. 31,163 ；burgin 等，1996, biochemistry, 35，14090)。已经在本领域中广泛描述了核酸化合物的糖修饰(参阅eckstein等，pct公 布号 wo 92/07065 ；perrault 等 nature, 1990，344，565-568 ；pieken 等 science, 1991，253， 314-317 ；usman 和 cedergren, trends in biochem. sci. ,1992,17,334-339 ；usman 等 pct 公布号 w093/15187 ；sproat，美国专利号 5，334，711 和 beigelman 等，1995，j. biol. chem.， 270,25702 ；beigelman 等，pct 公布号 wo 97/26270 ；beigelman 等，美国专利号 5，716，824 ； usman 等，美国专利号 5，627，053 ；woolf 等，pct 公布号 wo 98/13526 ；thompson 等，在 1998 年 4 月 20 日提交的 u. s. s no. 60/082，404 ；karpeisky 等，1998，tetrahedron lett.，39， 1131 ；earnshaw和 gait, 1998, biopolymers (nucleic acid sciences), 48, 39—55 ；verma和 eckstein, 1998，annu. rev. biochem.，67，99-134 ；和 burlina 等，1997，bioorg. med. chem.， 5，1999-2010)。类似的修饰可用于修饰本公开内容的核酸化合物。虽然用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯和/或5'-甲基膦酸酯键进行寡核苷酸核苷酸间 键的化学修饰提高了稳定性，但过度修饰可产生毒性。因此，当设计核酸化合物时，应评估 这些核苷酸间键的量并适当将其降到最少。这些键浓度的降低应降低毒性，引起这些分子 的功效提高并且特异性更高。在一个实施方案中，本公开内容的核酸化合物包括一个或更多个g-夹环核苷 酸。g-夹环核苷酸是被修饰的胞嘧啶类似物，其中所述修饰赋予双链体内互补性鸟嘌呤 watson-crick 和 hoogsteen 面形成氢键的能力，参阅例如，lin 和 matteucci，1998，j. am. chem. soc.，120,8531-8532。寡核苷酸内单个g-夹环类似物取代可导致当与互补性寡核苷 酸杂交时实质提高的螺旋热稳定性和错配辨别。本公开内容的核酸化合物中这些核苷酸的 包含导致与核酸靶标的亲和力和特异性增强。在另一实施方案中，本公开内容的核酸化合 物包括一个或更多个lna(锁定核酸)核苷酸，如2' ,4' -c亚甲基二环核苷酸(参阅例如 wengel 等，pct 公布号 wo 00/66604 和 w099/14226)。在另一实施方案中，本公开内容描述了靶向ephrin b2和/或ephb4的核酸化合 物的缀合物和/或复合物。这种缀合物和/或复合物可用于促进核酸化合物递送至生物系 统，如细胞中。本公开内容提供的缀合物和复合物可通过细胞膜转移治疗化合物、改变药物 代谢动力学和/或调整本公开内容的核酸化合物的定位来赋予治疗活性。本公开内容包括设计并合成用于跨细胞膜递送分子的新缀合物和复合物，所述分 子包括但不限于小分子、脂类、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、带负电荷的聚合物和 其它聚合物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或多胺。通常，设计所述转运子以 单独使用或作为多组分系统的一部分使用，其具有或没有可降解接头。预计这些化合物能 在血清存在或缺失的情况下提高本公开内容核酸化合物的递送和/或定位至来自不同组 织的许多细胞类型中(参阅sullenger和cech，美国专利号5，854，038)。此处所述的分子 的缀合物可经接头附着到生物活性分子上，所述接头是生物可降解的，如生物可降解的核 酸接头分子。
如此处所用，术语“生物可降解核酸接头分子”指设计用作生物可降解接头以连 接一个分子与另一分子(例如，生物活性分子)的核酸化合物。可通过使用核糖核苷酸、 脱氧核糖核苷酸和化学修饰的核苷酸，例如2' -0-甲基、2'-氟、2'-氨基、2' -0-氨 基、2' -c-烯丙基、2' -0-烯丙基和其它2' _修饰的或碱基修饰的核苷酸的多种组合来 调节生物可降解核酸接头分子的稳定性。所述生物可降解核酸接头分子可以是二聚体、三 聚体、四聚体或更长的核酸化合物，例如长度约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19或20个核苷酸的寡核苷酸，或可以包含具有基于磷连接，例如氨基磷酸酯或磷酸 二酯键的单个核苷酸。所述生物可降解核酸接头分子也可包含核酸骨架、核酸糖，或核酸碱 基修饰。如此处所用，术语“生物可降解的，，指生物系统中的降解，例如酶促降解或化学降 解。外源递送的治疗性核酸化合物，如此处所述的分子在细胞内最理想为稳定的，直 至靶rna的翻译已被抑制到足以降低不想要的蛋白质的水平。该时间期间根据疾病状态为 数小时到数天之间。这些核酸化合物应该对核酸酶具有抗性，以作为有效的细胞内治疗剂 起作用。在本公开内容和本领域中所述的核酸化合物的化学合成的改进已经增强了通过引 入核苷酸修饰来修饰核酸化合物以如上所述提高它们的核酸酶稳定性的能力。在另一方面，所述核酸化合物包含5'和/或3'帽结构。“帽结构”指已经 整合到寡核苷酸任一末端的化学修饰(参阅例如wincott等，w097/26270)。这些末 端修饰保护核酸化合物免受外切核酸酶的降解，并可帮助在细胞内的递送和/或定 位。所述帽子可存在于5'末端(5'帽子)或3'末端(3'帽子)或存在于两个末 端。在非限制性实例中，所述5'帽子包括反向的无碱基残基(部分)、4' ,5'-亚 甲基核苷酸；1- ( β -d-erythrofuranosyl)核苷酸、4 ‘-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1， 5-脱水己糖醇核苷酸；l-核苷酸；α -核苷酸；修饰的碱基核苷酸；二硫代磷酸酯连接； threo-pentofuranosyl核苷酸；无环3 ‘，4' -seco核苷酸；无环3，4-二羟基丁基核 苷酸；无环3，5_ 二羟基戊基核苷酸、3' -3'-反向核苷酸部分；3' -3'-反向无碱 基部分；‘-2'-反向核苷酸部分；3' -2'-反向无碱基部分；1，4_磷酸丁二醇； 3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；二硫 代磷酸酯；或桥或非桥甲基膦酸酯部分(对于更多细节参阅wincott等，pct
发明者a·k·索德, p·吉尔, v·卡拉斯诺佩洛夫 申请人:瓦斯基因治疗公司;德克萨斯州大学系统董事会