专利名称：抗人卵巢癌抗抗独特型抗体杂交瘤细胞系及其单克隆抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术及细胞工程领域，涉及分泌卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞系， 由其分泌的单克隆抗体(6blab3)及其在卵巢癌诊断和治疗中可能的应用。
背景技术：
卵巢癌是高度恶性的妇科肿瘤，其发病率在女性生殖道恶性肿瘤中占第2位，但死亡率居首位。 尽管肿瘤细胞减灭术和多药联合化疗提高了患者的5年生存率，但仍存在早期诊断困难和高复发性、 难治性等严峻问题。随着肿瘤生物治疗的迅速发展，免疫治疗有可能突破传统治疗的局限性，解决肿 瘤高复发性和难治性这一瓶颈。在免疫治疗方面，根据jerne的免疫网络学说，抗独特型抗体能够在结构或功能上模拟肿瘤抗原， 调节免疫应答，克服肿瘤抗原调变并打破机体的免疫耐受，在制备和纯化等方面均优于肿瘤来源的物 质。众多国内外研究证实抗独特型抗体疫苗对恶性黑色素瘤、结肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤具有一定疗 效，其中应用抗独特型抗体aca125治疗卵巢癌已经进入iib期临床实验，是目前国内外唯一获准进 行卵巢癌临床试验的抗独特型抗体。i、 h期临床试验结果提示aca125能够成功诱导部分晚期或复发 性卵巢癌患者产生体液免疫应答即抗抗独特型抗体ab3和淋巴细胞增殖效应，且ab3阳性者生存期显 著延长，与化疗等传统治疗相比副作用小。2004年rdnartz等报道了 i/ilb期多中心试验评价aca125 主动免疫治疗晚期卵巢癌的情况，u9例晚期卵巢癌患者，平均接受9.7次aca125治疗，其中81例 (68.1%)诱导产生ab3体液免疫应答；50.4%产生特异性结合ca125的abl样ab3， 26.9%诱导出针对 ca125表达阳性肿瘤细胞的adcc效应，中位生存19.4个月。在其他预后因素包括figo分期、 一线 化疗方案及疗效等具有可比性的前提下,ab3抗体阳性患者生存时间显著长于阴性患者(23.4个月vs4.9 个月)。(vaccination of patients with advanced ovarian carcinoma with the anti扁idiotype aca125: immunological response and survival (phasem[). cun cancer res 2004 mar 1; 10(5):1580-1587)。上述aca125是通过将卵巢癌抗原 ca125免疫balb/c小鼠后制备的单克隆抗体oc125 (abl)作为免疫原，免疫同系balb/c小鼠后筛选 得到的单克隆抗体ab2， ca125与aca125的关系详见以下附图1。尽管在应用抗独特型抗体ab2 (包括aca125)免疫治疗的大多数动物和临床试验中，均显示成功 诱导出特异性结合抗原的ab3抗体免疫应答与肿瘤的縮小和带瘤宿主生存期的延长相关，但截至目前有关卵巢癌单克隆抗体ab3的制备和细致深入研究国内外尚未见报道。本申请人通过多年的研究和实验，采用卵巢癌患者腹水抗原oc166-9，对balb/c小鼠进行免疫， 筛选获得单克隆抗体abl (coc166-9)，之后将coc166-9免疫同系balb/c小鼠，筛选获得单克隆抗 体ab2 (6b11)。在此基础上，本发明利用抗体6b11作为免疫原，通过杂交瘤技术成功制备出卵巢癌 抗抗独特型单克隆抗体ab3 (三个抗体之间的具体关系参见附图2)，所述ab3可以将其用于(1) 探索在卵巢癌免疫治疗中与治疗效果和生存时间相关的ab3发挥的作用及其意义，以及ab3 与ab2、 abl的相互关系(相互协同还是相互抑制)。(2) 利用ab3介导的adcc (抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)和/或cdc (补体依赖的细胞毒作 用)效应，探索ab3在开发卵巢癌治疗药物中的应用。利用ab3的抗原结合特异性，将该单克隆抗体 与化疗药物或细胞因子偶联，用于卵巢癌的耙向治疗。(3) 利用ab3、 abl能够识别肿瘤抗原决定簇的特性，制备用于临床检测卵巢癌肿瘤相关抗原的 酶联免疫试剂盒，尝试对卵巢癌的早期诊断。发明内容本发明的目的是提供两种分泌卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体的新的杂交瘤细胞系ovcamab3d12 和ovcamab32f2，其保藏号分别为cgmccno.2144， cgmcc no.2145。本发明的另一目的是提供上述细胞系分泌的卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体6bllab3(igm和igg)。 本发明的另一目的是提供上述卵巢癌抗抗独特型抗体在卵巢癌诊断治疗中可能的应用。 根据第一目的，通过杂交瘤技术以6b11作为免疫原免疫同系balb/c小鼠，建立杂交瘤细胞系。 其特征为系免疫后的balb/c雌鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞杂交形成的鼠鼠杂交瘤细胞(保藏号分别 为cgmccno.2144, cgmcc no.2145)，能在体外长期生长和稳定传代；能稳定分泌卵巢癌抗抗独特 型单克隆抗体6bllab3。杂交瘤细胞的染色体核型见以下附图3、附图4。根据第二目的，分别用上述细胞系制备卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体6bllab3，方法为小鼠腹水 法制备卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体6buab3。所制备6bllab3分别为igm和igg，效价均达到 l:l,28x105，抗体亲和力分别约为8.34xl07l/mol和2.31xl07l/mol。根据第三目的，利用上述卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体6bllab3与abl能够识别肿瘤抗原决定簇 的特性，制备用于临床检测卵巢癌肿瘤相关抗原的酶联免疫试剂盒，尝试对卵巢癌的早期诊断。利用 该抗体介导的adcc (抗体依赖细胞介导的细胞毒作用)禾tl/或cdc (补体依赖的细胞毒作用)效应直接 杀伤肿瘤细胞，探索ab3在开发卵巢癌治疗药物中的应用。利用ab3的抗原结合特异性，将该单克隆 抗体与化疗药物或细胞因子偶联，用于卵巢癌的靶向治疗。探索该抗体在卵巢癌免疫治疗中的作用和 意义，以及与ab2、 abl的相互关系。
附图1为卵巢癌抗原ca125与单克隆抗体aca125的关系；附图2为卵巢癌单克隆抗体coc166-9 (abl)、 6b11 (ab2)、 6bllab3之间的关系； 附图3为分泌卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体igm (ovcamab3d12)的杂交瘤细胞的染色体核型照片。附图4为分泌卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体igg (ovcamab32f2)的杂交瘤细胞的染色体核型照片。
具体实施方式
实施例l一建立细胞系1. 抗原制备无血清培养经我室建立并冻存的分泌卵巢癌抗独特型抗体6b11的杂交瘤细胞，亲和 层析制备抗体，经直接elisa方法测定6b11与coc166-9 (卵巢癌单克隆抗体abl)有很好的结合活 性。然后将6b11 (5mg/ml) .ml与klh (钥孔嘁血蓝蛋白5mg/ml) 2ml混合，加入50% (w/v)碳二亚 胺40ul,室温混匀反应2小时，4。c过夜。反应物对0.9%nacl进行透析过夜，4小时换液一次。genequant 测定蛋白浓度。针式滤器过滤除菌制备免疫原6b11-klh。竞争抑制试验显示6b11-klh基本保留了6b]1 的抗体活性。2. 免疫方案分泌igm抗体的杂交瘤细胞ovcamab3d12免疫方案为6-8周龄雌性balb/c纯系小鼠(军事医 学科学院实验动物研究所)数只，每只皮下多点注射6b11-klh 100ug加完全福氏佐剂，进行基础免疫。 2周后皮下多点注射6b11-klh 100ug，加不全福氏佐剂进行第二次免疫。再2周后采用与第二次免疫相 同的方法进行第三次免疫。准备融合前四天脾内注射6b11 30ug进行第四次免疫。分泌igg抗体的杂交瘤细胞ovcamab32f2免疫方案为6-8周龄雌性balb/c纯系小鼠(军事医学 科学院实验动物研究所)数只，每只皮下多点注射6b11-klh 100ug加完全福氏佐剂，进行基础免疫。4 周后皮下多点注射6b11-klh 100ug，加不全福氏佐剂进行第二次免疫。再分别间隔2周采用与第二次 免疫相同的方法进行第三、第四次免疫，再间隔l个月进行第五次免疫，最后间隔l个月进行融合，融 合前3天腹腔加强免疫6b11 100ug腹腔注射每天1次，共3次。3. 杂交瘤细胞的制备 1)饲养细胞的制备以balb./c纯系老雌鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前一天，拉颈处死balb/c老雌鼠，75% 酒精全身浸泡，超净台内，无菌条件下暴露小鼠腹膜，腹腔注入rpmi1640培养液约6ml，反复抽吸数 次，并用无菌棉球轻揉腹部，最后吸出冲洗液，1000转/分，离心5分钟，弃上清，沉淀用含16%小牛 血清的rpmi1640培养液重悬，调整细胞浓度为2*105个/ml,接种于2块96孔板，每孔100ul，置5�237x:培养箱培养过夜。
2) 免疫脾细胞的制备
脾内加强免疫后第3日，无菌条件下摘除小鼠脾脏，置于平皿中，rpmi1640培养液洗净血迹，注 射器多点穿刺吹出脾细胞，然后轻轻在不锈钢纱网上研磨制成脾细胞悬液，计数，取l)d08， rpmi1640 培养液洗涤2次(活细胞比例为95%)，用于细胞融合
3) 骨髓瘤细胞培养制备
小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 (医科院基础所)，经8-氮鸟嘌呤筛选后培养至日取对数生长期，1000转/ 分，离心5分钟，弃上清，用rpmi1640培养液重悬细胞后计数，取lxlo卩个(活细胞占95%)，用rpmi1640 培养液洗涤2次，用于细胞融合。
4) 细胞融合及hat筛选杂交瘤细胞
将计数好的脾细胞(108个)悬液与骨髓瘤细胞(107)悬液按细胞数10: l混合，在50ml离心管 内用rpmi1640培养液洗涤一次，1000转/分，离心5分钟。弃上清，用滴管小心吸净残留液体，轻轻 敲打离心管底，使细胞沉淀略松散。室温下，1分钟内缓慢逐滴加入lml 37'c预热的含5%二甲基亚砜 的50%聚乙二醇(merck公司，分子量4000)，边加边转动离心管，静置90s，然后每隔2分钟缓慢加入 预温的rpmi1640培养液lml、 2ml、 3ml、 4ml、 5ml及10ml，终止聚乙二醇作用。轻轻敲击管底使呈 细胞悬液，800转/分，离心5分钟，弃上清，用20ml含16。/。小牛血清的rpmi1640培养液重悬细胞， 轻轻混匀，接种于已铺好饲养细胞的2块96孔板，每孔100ul，置5�2 37'c培养箱培养。每板设2 孔sp2/0细胞作对照。
24小时后，补充含3xhat (次黄嘌呤-氨基嘌呤-胸腺嘧啶核苷)及16。/o小牛血清的rpmi1640培养 液，每孔100ul。其后根据细胞生长状况酌情半量更换hat培养液，维持培养约2周左右，待对照孔细 胞死亡，换为ht(次黄嘌呤-胸腺喷啶核苷)培养液继续培养2周，最后换为含16%小牛血清的rpmi1640 培养液继续培养。 4.抗体的检测
当细胞克隆生长至孔底面积约1/3时，吸取培养上清釆用elisa法检测抗体与oc166-9抗原及与抗 独特型抗体sbllscfv的特异性结合。分别包被卵巢癌病人的腹水抗原oc166-9(lug/ml)及纯化的 6bllscfv (2ug/ml)， 4'c过夜，次日加入培养上清100ul， 37。c温育1小时，加入3%羊血清稀释的生物 素化羊抗鼠igg (1:1000稀释度)100ul， 37匸温育1小时，加入3%羊血清稀释的辣根酶标记链亲和素 (1:1000稀释度)100ul， 37'c温育30分钟。。每次加样前pbs-t洗板3次，显色，读a^值。阳性对 照为我室曾用6b11微抗体100ug免疫的小鼠血清，阴性对照为正常鼠血清。
在制备分泌igm抗体的杂交瘤细胞中，检测结果为4孔阳性，其/{49[(值达到阴性对照的2.3-3.5倍， 筛选其中山so值最高且特异性最好的一孔细胞，扩大培养后得到杂交瘤细胞系ovcamab3d12 (保藏号为cgmccno.2144)。另三孔细胞扩大培养后直接冻存。在制备分泌igg抗体的杂交瘤细胞中，检测结果为9孔阳性，其屮2孔为igg，筛选其中aso值最 高且特异性最好的一孔细胞，扩大培养后得到杂交瘤细胞系ovcamab32f2 (保藏号为cgmcc no.2145)。5. 杂交瘤的克隆化和冻存1) 克隆化方案为有限稀释法于克隆化前一天制备饲养细胞，(方法同前述)，细胞浓度为2xl()s个/ml，加入96孔板，每孔100ul， 置5n/。ccb37'c培养箱培养过夜。克隆化过程为将培养的山m值最高的阳性孔细胞计数，调整细胞浓度为1(^个/ml，然后用含16% 小牛血清的rpmi1640培养液依次倍比稀释至103个/1111、 102个/1111、 20个/ml、 10个/ml。在铺好饲养细 胞的96孔板的a、 b、 c3排按20个/ml的细胞浓度每孔加入100ul，在d、 e、 f、 g、 h排按10个/ml 的细胞浓度每孔加入looiil， 5237匸培养箱培养。5-7天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆， 补加培养液至200ul/孔。第10-12天肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。同法共进行2次克隆化。2) 杂交瘤细胞的冻存细胞冻存液50。/。小牛血清 40。/。rpmi1640培养液(内含16%小牛血清) 10%二甲基亚砜 细胞冻存方法lxl()s个细胞悬于lml含16。/。小牛血清的rpmi1640培养液中，加入等量细胞冻存 液，转移入冷冻管，放置在异丙醇冰盒中-8(tc低温冰箱过夜，次日转入液氮中。第一次克隆化后即进行 冻存及扩大培养后冻存1支作为原始细胞;第二次克隆化后冻存。目前体外已连续培养2月，传代16次， 多次检测均能比较稳定地分泌抗体。6. 杂交瘤细胞的检定附图3显示了所述分泌igm抗体的杂交瘤细胞的染色体核型，平均有93条染色体。 附图4显示了所述分泌igg抗体的杂交瘤细胞的染色体核型，平均有103条染色体。实施例2—单克隆抗体制备1. 采用小鼠腹水法生产单克隆抗体8周龄balb/c小鼠腹腔注射降植烷0.5ml做预处理，7天后腹腔注射2-2.5^06个上述杂交瘤细胞， 密切观察动物的健康状况和腹水征象，7-10天后小鼠腹部膨隆呈明显消耗状态时，眼球取血，拉颈处死 小鼠，75%酒精消毒腹部皮肤，无菌条件下暴露小鼠腹膜，用无菌滴管将腹水吸出，3000转/分，离心 15分钟，弃上层油脂，沉淀细胞加完全1640培养。中间层腹水分装，-20'0保存。 一般每只小鼠可获2-5ml 腹水。2. 单克隆抗体的鉴定1) 抗抗独特型单克隆抗体特异性的鉴定
① 间接elisa方法检测与oc166-9抗原和与抗独特型抗体(ab2)的特异性结合，方法同前所述的抗体 检测方法
② 竞争抑制试验检测ab3与coc166-9 (abl)识别oc166-9抗原决定簇的关系
包被卵巢癌抗原oc166-9 (lug/ml) 4。c过夜，次r加含10%bsa的pbs 100ul/孔，37。c温育1 小时，加不同稀释度的收获到的小鼠腹水，95ul/孔，37'c温育1小时。加辣根过氧化物酶(hrp)标 记的coc166-9(20ug/ml)5ul/孔，37'c温育1小时。除最后一步外，每次加样前均用pbs-t洗板3次， 显色，读^49o值。阴性对照为(pbs)、阳性对照为单纯辣根过氧化物酶标记coc166—9 (lug/ml)，不 加小鼠腹水。计算竞争抑制率，抑制率大于30%为阳性。结果显示上述单克隆抗体能够部分抑制coc166-9 (abl)与原始抗原oc166-9的结合，抑制率虽腹水稀释度的增加逐渐下降，抗体igm在1:160稀释度 时抑制率可达到30%以上，抗体igg在1:320稀释度时抑制率可达到47%以上
③ 免疫组化检测与卵巢浆液性乳头状癌组织切片oc166-9抗原的特异性结合
将卵巢浆液性乳头状癌的组织石蜡切片，采用常规免疫组织化学染色程序进行免疫染色， 一抗为上 述杂交瘤培养上清，二抗为生物素标记羊抗鼠igg，三抗为过氧化物酶标记链亲和素(中杉金桥生物技 术有限公司)，dab显色，光镜下观察。以10%羊血清及完全1640培养液为阴性对照，以coc166-9(abl ) 鼠腹水1: 400稀释为阳性对照，组织阴性对照选择正常卵巢组织。结果与coc166-9相似，上述单克 隆抗体能够使卵巢浆液性乳头状癌组织特异性染色，止常卵巢组织未见明显着色。
2) 抗抗独特型舉克隆抗休亲和力和效价测定
采用前述间接elisa方法检测，单克隆抗体igm腹水效价l丄28x105，抗体亲和力约8.34xl07l/mol。 单克隆抗体igg腹水效价l:1.28x105，抗体亲和力约2.31xl07l/mol
3) 抗抗独特型单克隆抗体ig类别的鉴定
按照iso-2抗体亚类鉴定试剂盒(sigma公司)说明，采用间接elisa方法:将收获的鼠腹水1:5000稀 释包被酶标板，3厂c1小时，pbs稀释的特异性抗免疫球蛋白类及亚类抗体包括羊抗鼠iggl、 igg2a、 igg2(3、 igg3、 iga和igm抗体(1:1000稀释度)，室温反应30分钟。加入pbs-t稀释的辣根酶标记兔 抗羊igg (1:5000稀释度)，室温反应15分钟，显色。结果显示两种单克隆抗体分别为igm和igg。
实施例3—6bllab3与coc166-9 (abl)双抗体夹心法进行检测
采用酶联免疫吸附方法，将coc166-9 (abl)包被酶标板，加入患者血清抗原或组织抗原进行反应， 然后加入辣根过氧化物酶或生物素等标记的6bllab3,最后加入反应底物显色，读取光吸收度值。通过 大样本检测，获得该检测方法的灵敏度，特异度，阳性预测值和阴性预测值等参数，有可能制成试剂盒 用于临床早期检测卵巢癌。
权利要求
1、一种分泌抗人卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体ab3的杂交瘤细胞系，其保藏号为cgmcc no.2144。
2、 一种分泌抗人卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体ab3的杂交瘤细胞系，其保藏号 为cgmcc no.2145。
3、 如权利要求l所述细胞系分泌的单克隆抗体，所述抗体为igm类。
4、 如权利要求2所述细胞系分泌的单克隆抗体，所述抗体为iggl亚类。
5、 用于诊断卵巢癌的酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要 求1或2所述的单克隆抗体。
6、 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，采用双抗体夹心法检测卵巢癌抗 原。
7、 如权利要求3或4所述细胞系分泌的单克隆抗体在开发卵巢癌治疗药物中的 应用。
8、 如权利要求7所述的应用，其中该单克隆抗体与化疗药物或细胞因子偶联， 制成靶向治疗药物。
全文摘要
本发明属于生物技术及细胞工程领域，涉及两种分泌卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立，其主要技术特征为以鼠源性抗人卵巢癌抗独特型抗体作为免疫原，免疫balb/c小鼠，运用杂交瘤技术经融合、筛选、反复克隆化，获得稳定分泌抗人卵巢癌抗抗独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该两种杂交瘤细胞系分别命名为ovcamab3d12和ovcamab32f2，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号分别为cgmccno.2144，cgmccno.2145。本发明也公开了用该两种杂交瘤细胞系分别制备的单克隆抗体6b11ab3(igm)和6b11ab3(igg)。该抗体可用于检测卵巢癌肿瘤相关抗原的酶联免疫试剂盒，对卵巢癌进行早期诊断。同时该抗体可用于卵巢癌治疗药物特别是靶向治疗药物的开发，应用于卵巢癌的治疗。
文档编号g01n33/577gk101307304sq200710165269
公开日2008年11月19日 申请日期2007年11月2日 优先权日2007年11月2日
发明者付天云, 俊 倪, 捷 冯, 雪 叶, 恒 崔, 超 张, 成夜霞, 昌晓红, 程洪艳 申请人:北京大学人民医院