专利名称：卵巢癌肿瘤标志物he4时间分辨荧光免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人卵巢癌肿瘤标志物(附睾分泌蛋白4，he4)的分析检测技术， 特别涉及一种he4的时间分辨荧光免疫分析方法及检测试剂盒，用于卵巢癌的临床辅助诊 断、疗效观察及预后判断，属于生物工程及疾病诊断方法技术领域。
背景技术：
卵巢癌发病隐匿，预后差，是女性最致命的恶性肿瘤之一。如果能在早期诊断卵巢 癌将大大提高治愈率，但是卵巢癌患者发现时往往已经到了晚期。目前诊断卵巢癌和监测 其复发最为敏感的指标是检测血清ca125。但ca125在卵巢癌早期往往检测不到，在晚期患 者中有80%能检测到，并且ca125在某些良性疾病中也会上升，导致一些不必要的手术，其 在临床应用具有一定局限性。于是，许多学者都致力于寻找更为有效的肿瘤标志物，以便早 日确诊卵巢癌。人附睾分泌蛋白4 (human epididymis protein 4，he4)最早在人附睾上皮细胞中 发现。1999年，schummer等发现he4的mrna在卵巢癌组织中高表达，而在正常组织中低表 达或不表达。2003年，hellstrom等发现he4在卵巢癌患者血清中含量也比正常人有明显 增高。因而，he4作为一个新的卵巢癌肿瘤标志物，得到了人们更加深入的研究。hellstrom 等人证实，在特异性为100%的情况下，he4检测卵巢癌的灵敏度为60%，而经典卵巢癌肿 瘤标志物ca125的灵敏度仅为13%，而且he4检测早期卵巢癌的敏感性也明显优于ca125。 为进一步证实和扩展he4在卵巢癌早期检测和病程监控方面的应用前景，在美国已有近十 项临床研究和临床试验正在进行。时间分辨荧光免疫分析(trfia)是一种以稀土离子为标记物，根据稀土离子螯合 物的发光特点，用时间分辨技术测量特异性荧光的分析方法。trfia同时检测波长和时间两 个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，具有灵敏度高、特异性和稳定性好 等优点，是检测人血清he4并实现卵巢癌早期诊断的一种优选方法。本发明采用dna重组技术，在大肠杆菌中表达he4蛋白，以此蛋白免疫balb/c小 鼠，制备抗人he4单克隆抗体，获得多株可分泌抗人he4单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过 配对实验，得到两株分泌抗he4单克隆抗体的杂交瘤细胞株，这两种抗体分别与he4抗原的 不同表位结合，使用双抗体夹心法实现本发明的时间分辨荧光免疫分析，为卵巢癌的早期 诊断、疗效观察及预后判断提供一种简便快捷、经济可靠的检测方法。
发明内容
本发明说明了一种新的检测人卵巢癌肿瘤标志物he4的方法，特别是一种检测 he4的时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒。本发明涉及构建he4重组质粒，表达纯化he4蛋白，以纯化的he4蛋白免疫balb/ c小鼠，制备单克隆抗体，对获得的单克隆抗体进行配对实验，得到两株杂交瘤细胞株(5a3 和6c2)，他们分泌的单克隆抗体可与he4抗原的不同表位结合。并用稀土元素eu3 标记5a3单抗作为检测抗体。以未作标记的6c2单抗做为捕获抗体包被固相载体，建立检测he4的 双抗体夹心方法，实现本发明的时间分辨荧光免疫分析。
图1是本发明的实施流程。图2是经pcr获得的he4基因dna片段及重组载体pet_32a-he4的双酶切鉴定结 果。其中，1 :he4 基因的 pcr 结果；2 =marker, dl2000 ；3 =marker, dl2000 ；4 :pet-32a_he4 双酶切结果。图3是trx-he4融合蛋白iptg诱导表达的sds-page电泳(12% )及酶切后he4 蛋白的纯化结果。其中，1 :pet-32a-he4诱导表达结果；2 :pet_32a空载体诱导表达结果； 3 蛋白marker ；4 蛋白marker ；5 :trx_he4融合蛋白酶切去除trx后的纯化结果。图4是人卵巢癌肿瘤标志物he4双抗体夹心时间分辨荧光免疫试剂盒的标准曲 线。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发 明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明技术j9九游会真人的解决方案的前提下，对本发明所作的 本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1 :he4抗原的制备1. pet-32a_he4重组载体的构建根据genbank中提供的人he4mrna序列(nm_006103)，去除n末端信号肽，设计一 对引物，在两个引物的5’端分别引入bamh i和xho i酶切位点，用常规pcr方法从人卵巢 癌细胞株sk0v3中调取he4基因，琼脂糖凝胶电泳显示，成功获得了 he4基因，片段长度与 预期一致(图2)。载体pet_32a ( )以及经琼脂糖凝胶纯化后的he4基因片段，用bamh i和xho i 双酶切处理，酶切产物经纯化后连接，得到重组质粒pet-32a-he4，重组质粒经双酶切鉴定 (图2)，同时将重组质粒送公司测序，测序结果表明重组的he4片段与设计序列完全一致。2. τγχ-ηε4融合蛋白的表达将重组质粒pet-32a_he4转化大肠杆菌，pet-32a_he4的重组表达菌在含100 μ g/ ml氨苄青霉素的lb培养基中培养，a600达到0. 5左右时，加入终浓度0. 5mmol/l的iptg， 于37°c诱导3h，诱导后的菌液于4000rpm离心lomin，收集菌体，pbs洗涤一次，湿菌沉淀用 pbs重悬，置于冰浴中，超声破菌后12000rpm离心20min，上清和沉淀分别进行sds-page电 泳，结果显示，表达的融合蛋白分子量约为30kd，为胞浆可溶性表达(图3)，将该融合蛋白 命名为trx-he4。3. τγχ-ηε4融合蛋白的纯化和定量收集诱导后的细菌，pbs洗涤一次，湿菌沉淀用纯化中的平衡缓冲液重悬，置于冰 浴中，超声破碎，12000rpm离心20min，上清为待纯化的蛋白样品。将his6oni superflow resin ±真料(购自clonetech公司)装于纯化柱中，将纯 化柱与akta纯化仪连接，用平衡缓冲液(按照说明书提供的方法配制)平衡5个柱体积，待纯化的蛋白样品以1.5ml/min速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基线，用蛋白洗脱缓 冲液洗脱，收集蛋白峰，洗脱液在pbs中4°c透析过夜。sds-page电泳分析显示，trx_he4融 合蛋白经his亲和纯化后，在分子量30kd左右有单一条带，与预期值相符，bradford法测 定蛋白浓度为2mg/ml。4. trx-he4融合蛋白的酶切与纯化按10u/mg的浓度向纯化的trx_he4融合蛋白中加入肠激酶，22°c酶切16h，经 his60ni superflow resin凝胶纯化，收集流出液，流出液进一步经离子交换法纯化去除其 中的肠激酶，得到高纯度的he4蛋白，sds-page电泳分析显示，酶切后he4蛋白分子量约为 iokd (图3)，bradford法测定蛋白浓度为lmg/ml。实施例2 鼠抗人he4单克隆抗体的制备1.杂交瘤细胞株的建立取纯化的he4蛋白ιοομι(约iooyg)与等量弗氏完全佐剂充分乳化，背部皮下 多点注射balb/c小鼠，两周后以50 μ g抗原剂量加等量弗氏不完全佐剂充分乳化后背部皮 下多点注射，以后隔两周免疫一次，每只小鼠免疫剂量为50 μ g，不用佐剂，免疫途径为腹腔 注射，从第二次免疫开始，每次免疫后的第七天尾静脉采集小鼠血，间接elisa方法检测血 清效价达到1 50000以上后准备融合，融合前3天，尾静脉注射加强免疫一次，抗原剂量 50 μ g0细胞融合时无菌分离小鼠脾细胞，在peg1450的作用下，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0 融合，融合细胞在hat筛选培养基中培养，2 3周后通过间接elisa方法筛选出能与he4 蛋白反应的杂交瘤细胞(以与阴性血清a45tl的比值大于2. 1判为阳性)，用有限稀释法连续 亚克隆3次(第1次亚克隆用ht选择培养液，第2和第3次改用普通rpmi-1640完全培养 基)，每次亚克隆后7-10天进行筛选，直至单克隆细胞阳性孔率为100%。共获得19株能 稳定分泌抗人he4单抗的杂交瘤细胞株。经过进一步的配对实验，得到两株杂交瘤细胞株 (5a3和6c2)，他们各自分泌的单克隆抗体可与he4抗原的不同表位结合。2.单抗亚型的鉴定应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(购自hycult biotechnology公司)鉴定 单抗亚型，按操作说明将三株杂交瘤上清分别用pbs (ph7. 4)适当稀释，加500 μ 1试剂盒中 提供的稀释液至含一条κ型试纸条的检测管中，再加500 μ 1稀释好的待检样品至检测管 中，将试纸条完全浸入并轻轻搅动，再向检测管中加入iml试剂盒中提供的ram-kappa，使 试纸条打印面朝下，室温振荡30min左右，结果显示，5a3和6c2杂交瘤上清的单抗亚型均为 iggl类，轻链亚型均为κ链。3.腹水制备与纯化弗氏不完全佐剂致敏balb/c小鼠，500 μ 1/只。致敏一周后腹腔注射杂交瘤细胞 悬液，细胞数5 x io6 1 x io7, 7 10天后采集小鼠腹水，12000rpm，离心5min收集上清， 用proteing sepharose (购自ge公司)进行纯化将proteing填料装于纯化柱中，将纯化 柱与akta纯化仪连接，用平衡缓冲液(按照说明书提供的方法配制)平衡5个柱体积，待 纯化的腹水用平衡缓冲液稀释20倍后以1. 5ml/min速度上样，上样后用平衡缓冲液洗至基 线，用洗脱缓冲液洗脱抗体，收集抗体峰，洗脱的抗体立即用tri-hcl (ph9. 0)中和，然后用 pbs溶液透析。bradford法测定抗体浓度。纯化抗体于_70°c保存。
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4. eu3 标记纯化的5a3单抗取纯化的5a3 单抗 iml (2mg)，在 il 标记缓冲液(50mmol/lna2c03-nahc03ph9. 0) 中，于4°c搅拌透析过夜，将透析后的5a3单抗加入1. 5ml的eppendorf管中，再加入0. 5mg 的eu3 -dtta,充分混勻，4°c旋转混勻反应12h，标记完成后将反应液加入到s印hadex g-50 层析柱中分离纯化，用洗脱缓冲液(50mmol/l tris-hcl,0. 9% nacl)洗脱，用分光光度计 监测a28tl,收集洗脱峰，将标记抗体在ilpbs中，于4°c搅拌透析过夜，测定抗体浓度，同时 以eu3 标记试剂盒中的eu3 标准测定洗脱峰中的eu3 浓度，经计算得出标记率(eu3 hiol/ iggmol)为7. 9，标记后抗体的浓度为1. 2mg/ml，抗体回收率为90%。将标记好的抗体分装 后-70°c保存。实施例3 人卵巢癌肿瘤标志物he4双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析方法的建 、,1.检测方法在本实施例中，应用实施例2中获得的6c2单抗作为捕获抗体，以eu3 标记的5a3 单抗作为检测抗体，建立检测卵巢癌肿瘤标志物he4的双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析 方法。2.酶标板包被用包被液(0. 05mol/l的碳酸盐缓冲液，ph 9. 6)将6c2单抗稀释成10 μ g/ml，混 勻，96孔酶标板中每孔加入100 μ 1稀释好的单抗溶液，将酶标板密封于4°c过夜。3.酶标板封闭用含有20%胎牛血清的pbs作为封闭液。将包被过夜的酶标板拍干，每孔加入 200 μ 1封闭液，37°c封闭lh，用洗板液洗板3次后将酶标板拍干。酶标板干燥后密封入装 有干燥剂的金属箔袋内，4°c保存。4.被检血清的处理被检血清用分析缓冲液(含0. 2 % bsa和0. 1 % nan3的50mmol/l的tris-hcl ph7. 8)做适当比例的稀释。100μ 1/孔，37°c反应ih后用洗板液洗板3次后将酶标板拍干。5. eu3 标记的5a3单抗的处理eu3 标记的5a3单抗保存于含50%甘油的pbs中，用分析缓冲液做1 100稀释 后使用，现用现配。 οομ 1/孔，37°c反应ih后用洗板液洗板3次后将酶标板拍干。6.检测结果向酶标板中加入增强液(邻苯二甲酸氢钾15 μ m β-萘甲酰三氟丙酮(β-ντα)， 50 μ m三正辛基氧化磷(topo) ,0.1% triton x-100，醋酸)，200 μ 1/孔，振摇5min后在时 间分辨荧光检测仪上按标准程序测定。实施例4 人卵巢癌肿瘤标志物he4双抗体夹心时间分辨荧光免疫试剂盒的组成l.elisa板已包被6c2单抗，并已进行了封闭。2.分析缓冲液含 0. 2% bsa,0. 1% nan3 和 50mmol/l tris-hcl (ρη7· 8)。3. eu3 标记的5a3单抗保存于含50%甘油的pbs中。4. 10x 洗板液0· 2mol/l tris-hcl, 1. 5mol/lnacl,0. 5%吐温-20。5.增强液含 β-ντα、τ0ρ0、triton x-100 和醋酸。6.阳性标准品纯化的he4蛋白。
实施例5 人卵巢癌肿瘤标志物he4双抗体夹心时间分辨荧光免疫试剂盒的技术 指标1.试剂盒的标准曲线和线性范围用6c2单克隆抗体包被酶标板，并用封闭液封闭，加入梯度稀释的he4蛋白标准 品，每个样品做三复孔，每孔加100μ1，37 反应lh，洗板3次，将酶标板拍干，加入1 100 稀释的eu3 标记的5a3单抗，每孔加100 μ 1，37°c反应lh，洗板3次，将酶标板拍干，每孔 加增强液200μ1，振摇5min后检测，标准曲线(图4)由仪器系统自带的双对数函数处理， 从标准曲线可以看出荧光计数与he4抗原标准浓度之间存在良好的线性关系，线性范围为 5pm 1500pm，如果被检血清的he4浓度高于此测量范围，则应使用分析缓冲液稀释样品后 再检测。2.试剂盒的精密度采用4份人血清标本进行测试，每份标本复孔检测，在20天内每天不同时间内进 行2次检测。本检测试剂盒精密度的总变异系数cv值< 10%。3.试剂盒的灵敏性检测限代表区别于零浓度的可检测到的he4抗原的最低浓度。采用不含he4蛋白 的样品稀释液和4份来源于健康人的血清，后者用样品稀释液稀释至5pm，在两个独立日内 进行4次检测，每次重复24次检测。本试剂盒的灵敏性< 5pm。4.试剂盒的准确性将已知浓度的he4蛋白加入到正常人血清标本中，对标本进行稀释，测定he4的浓 度。回收率=测得的he4浓度(pm)/(内源性he4浓度(pm) 加入的he4浓度(pm))*100%。 计算本试剂盒的回收率为(100士 15)%。
权利要求
一种检测人附睾分泌蛋白4(he4)的方法，它的特征是采用双抗体夹心法，包括(1)可与he4抗原结合的第一株单抗并用该单抗包被固相载体；(2)待检样品和对照标准品；(3)可与he4抗原结合并标记有稀土离子的第二株单抗；(4)检测可与he4抗原结合的第二株单抗的稀土离子发射的荧光值；(5)以测得的待检样品的荧光值与对照标准品的荧光值比较，以确定待检样品中he4的存在及含量。
2.如权利要求1所述的第一株单抗和第二株单抗，其特征在于它们是分别可与he4蛋 白的不同抗原表位特异性结合的单克隆抗体。
3.如权利要求1所述的第一株单抗和第二株单抗，其特征在于它们是用大肠杆菌表达 的he4蛋白免疫动物后制备的。
4.如权利要求1所述的待检样品为血清。
5.如权利要求1所述的稀土离子为eu3 。
6.如权利要求1所述的检测是用时间分辨荧光免疫技术完成的。
7.一种时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒，其特征在于，用权利要求1所述的第一株 单抗作为捕获抗体，以权利要求1所述的第二株单抗作为检测抗体，用双抗体夹心法实现 时间分辨荧光免疫分析检测。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，它还含有阴性对照、阳性对照及其它相关 试齐lu
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，它可检测人卵巢癌肿瘤标志物he4。
全文摘要
本发明涉及一种人卵巢癌肿瘤标志物(附睾分泌蛋白4，he4)的分析检测技术，特别涉及一种he4的时间分辨荧光免疫检测方法及试剂盒，用于卵巢癌的临床辅助诊断、疗效观察及预后判断。发明内容包括构建he4重组质粒，表达纯化he4蛋白，以纯化的he4蛋白免疫balb/c小鼠，制备单克隆抗体，对获得的单克隆抗体进行配对实验，得到两株分泌抗he4抗原不同表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(5a3和6c2)，并用稀土元素eu3 标记5a3单抗。以未作标记的6c2单抗做为捕获抗体包被固相载体，以标记有eu3 的5a3单抗作为检测抗体，建立检测he4的双抗体夹心方法，实现本发明的时间分辨荧光免疫分析。
文档编号c12n15/70gk101949937sq20101025864
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月20日 优先权日2010年8月20日
发明者吴芬芳, 王华颖, 陈立勇 申请人:大连美亿德生物科技有限公司