用于胃癌诊断的mirna生物标志物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测，具体设及用于人胃癌诊断的microrna生物标志物及检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胃癌作为全球第四大癌症，严重威胁到人类健康。世界每年胃癌新发病例近百万， 发展中国家占近2/3,其中42%发生在中国。胃癌的早期诊断与治疗对患者的病情及预后 至关重要，也是国内胃癌领域有待突破的主要研究方向。胃癌的发生发展设及多基因异常 调控、多步骤参与，最终使细胞生物学行为由正常演变为异常。当细胞行为异常是基于基因 水平发生变化时，便可引发细胞结构和功能的不可逆性改变，很大可能造成细胞癌变。
[0003] 实现胃癌的早期诊断可w大大提高患者长期生存率及生活质量。目前常用的癌症 诊断方法有病理学诊断、物理学诊断和血清学检查癌症相关标志物等，运些方法是在细胞 及其代谢物水平进行筛查，对于诊断出阳性结果的患者，体内已出现细胞癌变及癌细胞的 异常增殖，严格意义上看并非属于癌症的早期诊断。最新研究较多关注癌症的基因诊断与 治疗，基因诊断着眼于细胞基因水平的变化，在细胞形态与功能改变之前进行探索，使得癌 症的早发现与早治疗成为可能。目前胃癌的基因诊断主要有胃癌特异癌基因的检测及胃癌 相关病因检测。
[0004]microrna(iiiirna)是最新发现的长约18-25个核巧酸的非编码小分子rna，在进 化上高度保守，数量约占基因组的1 %，现已普遍认为mirna与人类疾病的发生有密切的联 系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。mirna在转录或转录后水平负调控蛋 白质编码基因的表达：通过与其祀基因mrna非完全互补或近似完全互补结合，导致mrna降 解或抑制其翻译。人类基因组约30%的基因受mirna调控，在细胞的生长、增殖、分化和调 亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实mirna的异常调控与肿瘤形成及进展 关系密切。mirna的祀基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随 着mirna与癌症关系的不断深入研究，发现mirna并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还 设及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于mirna的癌症基因 治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
[0005]mirna在胃癌中的研究显示了mirna在胃癌诊治中的研究价值及应用前景。不少 文献已掲示了特定mirnas在胃癌发生发展中的作用。化nlugunlu,etal. 2005)等对 人类多种癌症中的microrna表达做了分析，发现mirna表达谱可用于区分诊断不同类型 的癌症。他们发现胃肠道癌症（胃癌、结肠癌等）的mirna表达谱聚集在一起，与其它类 型癌症mirna表达谱距离很远，可w区分癌细胞的大致来源。xiao狂iaob，etal. 2009) 等研究显示胃癌与正常组织中mirna存在差异，同时发现癌症组织中mir-106a水平要高 于非癌症组织，并且mir-106表达水平的变化与肿瘤分期、肿瘤大小及分化程度等特性相 关，提示mir-106a可作为胃癌诊断及病情预测的潜在标志物。运些研究为寻找胃癌特异性 mirna作为胃癌诊断生物标记物提供帮助。在胃癌侵袭和转移方面，song灯ongxisong,et al. 1999)等研究显示胃癌组织中mir-194的表达量与胃癌的侵袭程度成反比。他们发现iv型胃癌患者肿瘤组织中mir-194表达量比型的表达量低；体外侵袭实验证实转染 了mir-194模拟物的胃癌细胞株侵袭率降低，提示mirna的表达量与癌症病情进展相关。亦 有研究显示mirna在胃癌中的异常改变与癌症的预后相关。2009年的一项研究分析了 100 名胃癌患者mirna表达谱，筛选出一组含7个异常mirnas的表达谱，可作为独立预测患者 预后的相关指标，其预测率在后续的50名胃癌患者得到进一步验证狂li,etal. 2009)。提 示对于mirna在胃癌中的研究，有助于提供胃癌诊断、病情判断、预后评估等多方面信息。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供用于胃癌诊断的microrna生物标志物及检测试剂盒。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得w实现的：
[0008] -组用于人胃癌诊断的microrna生物标志物，所述microrna生物标志物由如 下microrna组成：has-mir-lob-sp、has-mir-loo-sp、has-mir-206、has-mir-155-5p 和has-mir-224-5p;所述has-mir-10b-5p的核巧酸序列如沈qidno.i所示；所述 has-mir-100-5p的核巧酸序列如沈qidno. 2所示；所述has-mir-206的核巧酸序列 如seqidno. 3所示；所述has-mir-155-5p的核巧酸序列如seqidno. 4所示；所述 has-mir-224-5p的核巧酸序列如沈qidno. 5所示。
[0009] 进一步地，所述microrna生物标志物为人血清microrna生物标志物。
[0010] 所述的microrna生物标志物在筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
[0011] 一组人胃癌诊断用microrna引物、探针的组合，所述microrna引物、探针的组合 包括：has-mir-10b-5p引物、探针；has-mir-100-5p引物、探针；has-mir-206 引物、探针； has-mir-155-5p引物、探针；has-mir-224-5p引物、探针。
[0012] 进一步地，所述microrna引物包括反转录引物、定量pcr前引物和定量pcr后引 物。
[0013] 进一步地，11日3-11111?-1013-5口的反转录引物序列如569 10^.6所示，定量口〇?前引 物序列如沈q idno. 7所示，定量pcr后引物序列如沈q idno. 16所示；has-mir-100-5p 的反转录引物序列如seqidno.8所示，定量pcr前引物序列如seqidno.9所示，定量 pcr后引物序列如seqidno. 16所示；has-mir-206的反转录引物序列如seqidno. 10所 示，定量pcr前引物序列如seqidno. 11所示，定量pcr后引物序列如seqidno. 16所示； has-mir-155-5p的反转录引物序列如seqidno. 12所示，定量pcr前引物序列如seqid no. 13所示，定量pcr后引物序列如seqidno. 16所示；has-mir-224-5p的反转录引物序 列如seqidno. 14所示，定量pcr前引物序列如seqidno. 15所示，定量pcr后引物序列 如沈q idno. 16所示；各microrna探针的核巧酸序列如沈q idno. 17所示。
[0014] 所述的人胃癌诊断用microrna引物、探针的组合在制备或筛选人胃癌的肿瘤诊 断药物中的用途。
[0015] 一种人胃癌的肿瘤诊断试剂盒，包括所述的mirna引物、探针的组合。
[0016] 进一步地，所述的人胃癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dntps、 mgclz、depc水、taq酶w及标准品和/或对照品。
[0017] 本发明的优点：
[0018] 本发明将胃癌与癌旁组织表达差异明显（差异表达量大于2个化id,rt-pcr中ct 值小于 30)的 5 种mirnahas-mir-10b-5p、has-mir-100-5p、has-mir-155-5p、has-mir-206 及has-mir-224-5p进行血清学表达分析，结果表明运5种mirna在血清中稳定表达，血清 mirna的表达与组织具有很好的一致性，has-mir-10b-5p、has-mir-100-5p和has-mir-206 表达下调，has-mir-155-5p和has-mir-224-5p表达上调。运5种mirna可w作为胃癌诊 断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一mirna诊断的灵敏度和特异 性。
【附图说明】
[0019]图 1-图 5 分别显示has-mir-10b-5p、has-mir-100-5p、has-mir-206、 has-mir-155-5p和has-mir-224-5p单独用于区分胃癌样本和正常对照的roc曲线；
[0020] 图6显示为has-mir-10b-5p、has-mir-100-5p、has-mir-206、has-mir-155-5p和 has-mir-224-5p联合用于区分胃癌样本和正常对照的roc曲线。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不w此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可w对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 实施例1 :胃癌组织差异性mirna的筛选
[002引 1对象和方法
[0024] 1. 1标本来源
[00巧]在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年1月-2014年1月经病理证实 为胃癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本w及配对的距离癌组织3厘米w上范围的癌 旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
[0026] 1. 2主要仪器设备
[0027]台式离屯、机：e卵endo;rfminispin(美国化卵endo;rfcentrifuge5810r(美国）
[0028]核酸浓缩仪：e卵endo;rfconcentrator5301 (美国）
[0029] 紫外分光光度计：du640、天平度ec