一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒的制作方法
【专利说明】一种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法及试剂盒 发明领域
[0001] 本发明属于生物技术工程及肿瘤医学领域，涉及一种高纯度循环肿瘤细胞的富集 方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肿瘤细胞发生转移是造成患者死亡的主要原因。在肿瘤转移的过程中，原发灶肿 瘤细胞侵袭到邻近组织后穿透基底膜并进入血循环，从而成为循环肿瘤细胞（circulating tumorcells，ctcs)。ctcs被认为是肿瘤发生远端转移的关键"参与者"，其临床应用价值 在近年来越来越受到关注，并已成为肿瘤研究领域的热点之一。
[0003] ctcs在血液中的存在数量非常少，每io6个白细胞中大约才有一个ctcs。因 此，检测ctcs需要首先分离和富集ctcs。由于ctcs缺乏特异性的标志物，目前普遍采用 epcam(上皮细胞粘附分子）进行磁性标记来分离ctcs，称为阳性-磁性分离。基于这一原 理发展起来的cellsearch、cellrich等仪器已经投入市场运作。然而，该方法排除了低表 达和不表达epcam的ctcs。已有研究指出，基于这一原理分离ctcs将低估其数量并丢失具 有高转移及增殖潜力的ctcs亚群。一个典型的例子就是，发生上皮-间质转化的ctcs低 表达或不表达epcam，这类epcam亚群因为具有高的迀移力和肿瘤干性而被认为是转移的 根源。因此，pantelk等2014年发表在naturereviewscancer期刊上的文章已经指出， 更可取的ctcs分离技术应当能够分离出全部类型的ctcs。
[0004] 在这方面，ctcs阴性-磁分离方法更为可取。该技术通过白细胞表面的⑶45抗原 (白细胞共同抗原）与cd45单克隆抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性 标记，并在磁场中去除白细胞，从而"无偏见"地富集出高表达、低表达以及不表达epcam抗 原的ctcs。该技术弥补了基于上皮标志物epcam磁分离ctcs技术在方法上的不足，因而更 加具有优越性。尽管这一技术已经有了商业化试剂盒，然而基于这一技术原理获得的ctcs 纯度仅在〇.1%~1%之间，甚至更低，难以满足ctcs进一步分子分型的要求，因而限制了 ctcs的临床应用。近来的研究已经显示，对ctcs做进一步的分子分型鉴定，将可能取代传 统的癌组织检测而能用于指导肿瘤的临床治疗当中。一个典型的例子就是，ctcs的egfr基 因突变检测可以取代肺癌组织的检测而能筛选患者用于肺癌的分子靶向治疗。然而，ctcs 的分子分型需要足够纯度的靶细胞才能被准确检测出。pantelk等的文章已经指出，难以 获得足够纯度的ctcs已经限制了其进一步的临床应用。因此，最佳的ctcs分离技术应当 不仅能够分离出全部类型的ctcs，而且能获得足够纯度的ctcs。遗憾的是，目前还没有任 何技术能够同时具备这两个优势。
[0005] 在这方面，ctcs阴性-磁分离技术在分离出全部类型的ctcs上具有技术优势。通 过这一技术能够去除99. 99%的白细胞，即富集效率高达10000倍。然而，ctcs在血中的数 量是白细胞数量的百万分之一或千万分之一。由于数量极其稀少，按照每毫升血液中白细 胞的标准数量为5x106个计算，目前的技术（包括阴性-磁分离法）分离ctcs后，依旧会 有大约2000~20000个白细胞无法被去除，从而仅能获得0. 1%~1%纯度的ctcs。因此， 进一步的技术改进以去除剩余的白细胞是提高ctcs纯度的关键。
[0006]目前普遍使用的ctcs阴性-磁分离法的原理是：磁性标记白细胞表面的特异性 抗原cd45并在磁场中去除白细胞，从而富集出ctcs。运用同样的原理，对剩余的白细胞做 进一步的特异性抗原磁性标记并在磁场中予以去除是一个显而易见的方法能进一步提高 ctcs纯度。然而，该技术改进的原理并不是一个简单的方法叠加。因为：（1)能够进一步用 于磁性标记白细胞的抗原种类十分有限：目前基于cd45的阴性-磁性法去除白细胞后，剩 余的白细胞只能选择其它的白细胞抗原进行磁性标记才能在磁场中被去除。并且这些抗原 需要满足以下两个方面的要求：首先，仅在白细胞表面表达，并在血液其它组成部分（例如 红细胞以及血小板等）中不表达，以降低对分离的干扰；其次，肿瘤细胞不表达或与肿瘤细 胞不能间接连接，以保证分离方法的特异性。尽管目前已经发现超过150种白细胞的分化 抗原，但符合上述条件的白细胞抗原种类非常有限。（2)基于cd45磁性去除白细胞后，进 一步磁性标记白细胞的次数并不是越多越好：理论上，磁性标记白细胞并在磁场中去除的 次数越多，ctcs的纯度将越高。然而，ctcs的回收率也将越低。我们与其他学者以前的研 究已经显示，每一次的磁分离将损失10~20%的ctcs。因此，多次的磁分离将损失大部分 ctcs而使检测结果失去代表性，并且多次的磁分离将延长分离时间并增加检测成本，难以 在临床上推广应用。
[0007] 目前尚没有适于临床应用的高纯度ctcs的富集方法。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种高纯度ctcs的富集方法。
[0009] 本发明的第二个目的是提供运用上述方法富集ctcs的试剂盒。
[0010] 鉴于每一次的磁分离将损失10~20%的ctcs，过多的磁分离将损失大部分ctcs 而使检测结果失去代表性，并且多次的磁分离将延长分离时间并增加检测成本，难以在临 床上推广应用。阴性-磁分离法富集ctcs的效率能达到10000倍，两次的阴性-磁分离连 用技术的富集效率理论上将能达到1〇8,足以获得满足分子分型要求的ctcs纯度，并且能够 保证足够的回收率。因此，发明人通过外周血中白细胞表面的两个特异性表达的抗原cd45 和cd53通过抗体复合物与纳米磁性粒子结合，以磁性标记白细胞，并先后在磁场中去除白 细胞，建立了一种基于阴性-磁分离方法的高纯度ctcs富集技术和流程，并研制出可便于 临床应用的ctcs富集试剂盒。该方法不仅能够实现循环肿瘤细胞的"无偏见"富集，而且 能同时获得高纯度和高回收率的ctcs，为进一步的基因分型鉴定及相关科学研究提供了技 术平台。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0012] -种高纯度循环肿瘤细胞的富集方法，该方法采用2次磁分离技术，一次对白细 胞进行⑶45抗原磁性标记与磁场去除，一次对白细胞进行⑶53抗原磁性标记与磁场去除， 得到高纯度循环肿瘤细胞ctcs。
[0013] 上述方法中磁分离技术为ctcs阴性-磁分享技术。
[0014] 上述方法中：
[0015] 对白细胞进行⑶45抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的⑶45抗原与⑶45 抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞；
[0016] 对白细胞进行⑶53抗原磁性标记与磁场去除是通过白细胞的⑶53抗原与⑶53 抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，然后在磁场中去除白细胞。
[0017] 所述的方法，该方法包括将血样品中红细胞去除，然后先对白细胞进行cd45抗原 磁性标记与磁场去除，再对白细胞进行⑶53抗原磁性标记与磁场去除。
[0018] 所述的方法，其中cd45抗体为单克隆抗体，cd53抗原为单克隆抗体。
[0019] -种用于富集循环肿瘤细胞的试剂盒，该试剂盒含有cd45单克隆抗体、pe标记的 cd53单克隆抗体、纳米磁珠、用于连接cd45单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物、以及用 于连接pe标记的cd53单克隆抗体和纳米磁珠的抗体复合物。
[0020] 所述的试剂盒还含有白细胞磁性标记的溶液体系，和/或白细胞在磁场中去除的 溶液体系。
[0021] 所述的试剂盒，其中白细胞磁性标记的溶液体系为：ph7. 4pbs，10%胎牛血清， 2mmedta;白细胞在磁场中去除的溶液体系为：ph7. 4pbs，0. 1%胎牛血清，2mmedta。
[0022] 更进一步，本发明的目的是基于下列几步技术方案实现的：
[0023] 第一步：筛选适合与⑶45连用进一步磁性标记白细胞的抗原。发明人通过以下步 骤筛选出候选靶抗原：
[0024] ①筛选仅在白细胞特异性表达的抗原：发明人根据目前公布的cd