一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学检测技术领域，更为具体地说，涉及一种人乳头瘤病毒荧光定量 pcr检测试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（human papillomavirus，hpv)是一类分子量较小的无包膜的双链 环状dna病毒，专性侵染和寄生人体生殖器官及其它组织器官的上皮细胞。在临床上，根据 hpv不同亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将hpv分为高危型和低危型两大类。低 危型hpv主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣 类病变和低度子宫颈上皮内瘤。高危型hpv除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生 殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤变，其病毒亚型主要有hpv16、18、31、33、35、39、45、 51、52、53、56、58、59、66、68 型。
[0003] hpv在人群中极易传播扩散，可通过直接或间接接触交叉传染，其感染部位隐蔽， 发病隐匿，不易早期发现，可致多种增生性病变，在女性生殖系统所引起的最常见的恶性肿 瘤为宫颈癌。对宫颈癌的病因学研究可知，高危hpv持续感染是子宫颈癌的主要致病因素， 99. 7 %宫颈癌患者存在hpv感染。临床研究显示，从hpv的持续感染到一般的宫颈癌前病变 并最终发展为宫颈癌大约需要8-10年，因此筛查是目前预防和早期诊断宫颈癌的主要手 段。美国国立综合癌症网络（nccn)宫颈癌筛查实践指南等明确指出，即使宫颈细胞学无异 常而hpv阳性的30岁以上女性，如其为hpv16、hpv18感染者，应立即进行阴道镜检查。早 期宫颈病变的治疗效果远比宫颈癌的治疗效果要好得多，且快速、准确的检测出hpv高危 型的感染并同时分型鉴别hpv16、hpv18型对于早期治疗和降低宫颈癌的发病率和死亡率 等具有重要的意义。
[0004] 而目前在临床检测高危hpv-dna的方法中，主要是采用基于实时荧光定量 pcr(polymerase chain reaction，即聚合酶链式反应）的技术及其改进。实时焚光定量pcr 技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的pcr扩增仪， 荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号， 通过检测荧光信号的动态变化实时反映 pcr的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软 件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点（即ct值）以及扩增曲线的 形状，可以判断阴阳性结果，并得知样本浓度的定值结果。因此，该技术在靶多核苷酸样品 的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的pcr方法，得到十分广泛的应用。但是，仅有极少 量荧光pcr诊断试剂盒在hpv诊断中使用，且缺乏完善的质控体系，操作比较繁琐，灵敏度 不高，检测范围小，因此，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准 确快速诊断的需要。
[0005] 国内已有多种基于实时荧光定量pcr技术定量检测高危hpv-dna的方法，这些试 剂盒所提供的hpv-dna提取方法主要是煮沸法，然而煮沸法存在很多不足之处：1)核酸提 取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集dna等多 个步骤，样本中的dna存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成 dna的大量丢失导致样本定量偏低，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造 成气溶胶污染。2)检测灵敏度不高，约在loooocopies/ml左右；3)没有设置阳性内对照 (即内标），无法监控假阴性；4) 一般没有预防pcr产物污染的措施。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法， 以解决【背景技术】所述的现有hpv检测方法灵敏度低的问题。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒，所述检测试剂盒包 括pcr反应液，且所述pcr反应液包括pcr缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核 苷酸的上下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针；所述用于检测靶多核苷酸的探针具有 hpygi-p1、hpygl-p2、hpygl-p3、hpyg2-p、hpyg2-p1、hpyg3-p1、hpyg3-p2、hpyg4-cy5 和 hpyg5-r0x 的序列。
[0009] 优选地，所述用于扩增靶多核苷酸的上下游引物具有hpyg1-f、hpygl-rl、 hpyg1-r2、hpyg2-f、hpyg2-r1、hpyg2-r2、hpyg3-f1、hpyg3-f2、hpyg3-r1、hpyg3-r2、 hpyg4-f、hpyg4-r、hpyg5-f、hpyg5-r 的序列。
[0010] 优选地，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为球蛋白。
[0011] 优选地，所述pcr反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针具有 gb-p的序列。
[0012] 优选地，所述pcr反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上 下游引物具有gb-f、gb-r序列。
[0013] 优选地，所述pcr缓冲液包括ph为7. 5的200mmol/l的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 溶液、30mmol/l的氯化镁溶液、500mmol/l的氯化钾溶液、体积比为0. 2%的曲拉通溶液和 体积比为10%的甲酰胺溶液。
[0014] 优选地，所述脱氧核糖核苷三磷酸包括datp、dctp、dgtp和dutp。
[0015] 优选地，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液为iu/ μ 1~5u/ μ i taq 酶和 0· 05u/ μ 1 ~0· 2u/ μ i ung 酶。
[0016] 优选地，所述检测试剂盒还包括核酸释放剂，所述核酸释放剂包括质量浓度为 0. 01~0.5禮/1的莎梵婷，质量浓度为50~200禮/1的氯化钾，质量浓度为0.01%~2% 十二烷基磺酸钠，体积分数为0. 05 %~1 %的乙醇。
[0017] 优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照是浓度为1.00~ 5. 00e 05copies/ml的hpv16型/18型混合强阳性样本。
[0018] 优选地，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌生理盐水。
[0019] 优选地，所述检测试剂盒还包括定量参考品，所述定量参考品是浓度梯度为 1. 00 ~5. 00e 07copies/ml、l. 00 ~5.00e 06copies/ml、l. 00 ~5.00e 05copies/ml 和 l 00 ~5. 00e 04copies/ml 的 hpv16/18 型强阳性质粒。
[0020] 本发明还提供了一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒的使用方法，所述使 用步骤包括：
[0021] soi :取体积比为38-44 :1-2的pcr反应液和酶混合液，混和均匀并形成pcr-mix， 瞬时离心后备用；
[0022] s02 :在pcr反应管中加入2~5 μ 1的核酸释放剂，深吸浅打后加入3~5 μ 1待 测样本、阴性对照或阳性对照，形成混合液；
[0023] s03 :在上述混合液中加入40~45 μ 1的pcr-mix，盖好管盖，形成待测样品；
[0024] s04 :将待测样品放置在荧光定量pcr扩增仪上进行测试。
[0025] 本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒包括pcr反应液，且所述 pcr反应液包括pcr缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下 游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试 剂盒能够对人或动物生殖道分泌物中的hpv进行定量分析，且仅能检测出hpv的dna，而不 能检测出其它病原体的dna，进而说明本发明所提供的检测试剂盒具有很好的特异性。本发 明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒在提取dna时使用核酸快速释放法，该 法能够有效地去除复杂样本中的pcr抑制物，从而获得高纯度和高得率的dna，大大提高了 检测灵敏度、准确度和稳定性。同时，本发明所提供的人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂 盒还具有操作快速、方法简便、灵敏度高的特点。
【附图说明】
[0026] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使 用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动 的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0027] 图1是本发明实施例提供的人乳头瘤病毒荧光定