专利名称：angptl3作为卵巢癌的诊断标记物的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域。具体地说，本发明涉及一种提高样本分类准确性 的方法、以及一种用于检测样本中angptl3蛋白的试剂盒。
背景技术：
上皮性卵巢癌(印ithelial ovarian cancer，e0c)在所有女性癌症死亡原因 中排名第五位。在我国卵巢恶性肿瘤的发病率在女性常见恶性肿瘤中所占的百分率为 2.4-5.6%。其发病在妇科恶性肿瘤中仅次于宫颈癌，居第二位。近年来其发病呈上升趋 势。在妇女生殖道癌瘤中，卵巢癌是造成死亡原因最高的一种肿瘤。美国癌症学会预计美 国2008年将会新增21650个卵巢癌病例，同时大约有15520例病患将死于该疾病(ymi cancer, org)。e0c的高死亡率都是发生在起始阶段，因为大部分妇女在诊断时已是晚期 (stage iii/iv)，其中15-20%的病人有5年的存活率(1)。相比较而言，被准确诊断为 stage i的小部分病人，超过90%有5年的存活率(2)。当前e0c检测的候选策略是建立 在生物化学肿瘤标志物的基础之上，例如ca125和通过超声或者卵巢的多普勒显像得到的 生物物理标记物。不幸的是，利用这些策略进行早期e0c检测的阳性预测值(ppv) —致性 小于 10% (3，4)。通过利用 ca125 复杂算法(complex longitudinal algorithms) (5-7)、 串联测试(sequential testing) (8,9)和全新生物标记物(10)的应用，在对上皮性卵巢癌 (e0c)早期诊断中得到了一定的提高。所以，现在仍非常需要继续发展新的血液循环系统中 的生物标志物对卵巢癌进行早期诊断。
发明内容
本发明部分地基于以下发现卵巢癌患者血清中的angptl3含量明显低于健康受 试者血清中的angptl3含量，并且具有统计学显著性，可用作卵巢癌的诊断标志物。因此，本发明提供了以下实施方案。[实施方案1]一种诊断受试者中的卵巢癌的方法，包括检测来自受试者的样本中的angptl3含量，对所述angptl3含量进行分析，和根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。[实施方案2]—种提高样本分类准确性的方法，包括检测所述样本中的angptl3含量，
对所述angptl3含量进行分析，和根据所述分析结果，对样本进行分类。[实施方案3]—种对受试者的卵巢癌进行诊断、预后评估、治疗效果监测或病程 监测的方法，包括检测受试者血液样本中angptl3的表达。[实施方案4]实施方案1-3之任一项的方法，其中所述样本选自由尿液、脑脊液、 唾液和眼泪所构成的组。
[实施方案5]实施方案1-3之任一项的方法，其中所述样本为血液样本。[实施方案6]实施方案1-3之任一项的方法，其中所述样本为血清样本。[实施方案7]实施方案1-6之任一项的方法，其中所述检测采用elisa或定量 western blot 进行。[实施方案8]实施方案1-7之任一项的方法，其中所述检测采用angptl3的特异 结合剂进行。[实施方案9]实施方案8的方法，其中所述angptl3的特异结合剂为angptl3的 抗体或其angptl3结合片段。[实施方案10]实施方案8的方法，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。[实施方案11]实施方案8的方法，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。[实施方案12]实施方案1-11之任一项的方法，其中所述分析包括绘制r0c曲线， 其中以angptl3为变量，根据不同的阈值绘制出r0c曲线，并计算曲线下面积auc，并且按照 期望的灵敏度和特异性进行判断。[实施方案13]实施方案1-11之任一项的方法，其中所述分析包括将所述 angptl3含量与来自健康受试者的参比值进行比较，如果明显低于所述参比值则确定所述 受试者患有卵巢癌。[实施方案14]用于实施实施方案1-13之任一项的方法的试剂盒，其包含 angptl3的特异结合剂。[实施方案15]实施方案14的试剂盒，还包含能够结合angptl3的标记抗体。[实施方案16]实施方案14-15之任一项的试剂盒，其中所述angptl3的特异结合 剂为angptl3的抗体或其angptl3结合片段。[实施方案17]实施方案16的试剂盒，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。[实施方案18]实施方案16的试剂盒，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。[实施方案19]实施方案15-18之任一项的试剂盒，其中所述标记抗体被辣根过氧 化物酶或者荧光标记。[实施方案20]实施方案14-19之任一项的试剂盒，还包含
包含已知量angptl3溶液的标准样；以及用于检测的抗体标记物，其可以与抗体结合形成偶联物。[实施方案21]实施方案20的试剂盒，其中所述抗体标记物为辣根过氧化物酶或 者荧光物质。[实施方案22]实施方案14-21之任一项的试剂盒，还包含任选的抗体偶联物(antibodyconjugates)；任选的选自由显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂构成的组的辅 助试剂；和任选的说明书。[实施方案23]实施方案14-22之任一项的试剂盒，其中所述angptl3的特异结合 剂被固定于固相载体上。[实施方案24]angptl3的特异结合剂在制备用于诊断卵巢癌的试剂中的用途。[实施方案25]实施方案24的用途，其中所述angptl3的特异结合剂为angptl3
5的抗体或其angptl3结合片段。[实施方案26]实施方案25的用途，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。[实施方案27]实施方案25的用途，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。[实施方案28]angptl3作为卵巢癌诊断标志物的用途。[实施方案29]—种提高样本分类准确性的方法，其包括测定样本中angptl3的含量，和angptl3的含量在时间上的变化；以angptl3含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和 特异性绘制出r0c曲线，并计算曲线下面积auc ；按照auc值、灵敏度和特异性对样本进行分类。[实施方案30]—种提高样本分类准确性的方法，其包括测定样本中angptl3和任一在卵巢癌中高表达蛋白的含量，以及它们各自的含量 在时间上的变化；以angptl3和该高表达蛋白含量的比值在时间上的变化为变量，根据不同的阈值 对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出r0c曲线，并计算曲线下面积auc ；按照auc值、灵敏度和特异性对样本进行分类。研究表明，采用本发明的方法及试剂盒对个体的样本中蛋白angptl3进行联合检 测，可以有效提高癌症诊断的灵敏度、特异性和准确率，并且可以推广至许多疾病的诊断、 预后评估、治疗效果评估及病程监测。
图1是一幅柱状图，显示了在健康志愿者血清(m-n10)和卵巢癌患者血清样品 (c1-c10)中angptl3的表达水平的比较，t-检验具有统计学显著性(t_test，p = 0. 0009， tail l,type 3)。横坐标为样品id (c =癌症，n =正常)；纵坐标为浓度，单位为纳克每毫 升(柱形图加标准误差的error bar)；标题为人血管生成素样蛋白3 (卵巢癌vs正常血清)。
具体实施例方式术语本文所用的术语“angptl3”是指血管生成素样蛋白3 (angiopoietin-like protein 3，简称angptl3)，其含义是本领域公知的。angptl3是分泌蛋白的血管生成素样 家族的成员(11)。它具有血管生成素的特征性结构，包括信号肽、n-末端无规卷曲结构域 以及c-末端纤维蛋白原(fbn)-样结构域。angptl3可能在血管生成的调节中发挥作用 (11)。angptl3是脂类代谢的调节物(12)，但是它在癌症中的作用还没有被研究。本文中使用的术语“受试者”，指任意哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、牛，特 别是灵长类动物，如人。在本发明的某些优选实施方式中，“受试者”是人。在本文中，术语 “受试者”和“个体”有时可互换使用。本文中使用的术语“血液样本”，指来自受试者的血液的样本，例如全血、血浆或者 血清样本。本文中使用的术语“angptl3的特异结合剂”，指能够特异结合angptl3的试剂，例如angptl3的抗体、结合配体(如aptmer)等。本文中使用的术语“特异结合”指本发明的特异结合剂专一性地结合angptl3抗 原。例如，通常情况下，angptl3抗体结合angptl3抗原的亲和力是结合angptl3抗原之外 的非特异抗原(例如，bsa、酪蛋白)的亲和力的至少2倍。angptl3抗体的“angptl3结合片段”是指angptl3抗体的一个或多个片段，其保 留结合angptl3抗原的能力，例如fab、f(ab’)2、fv或单链fv片段。已经表明通过全长抗 体的片段可以实施抗体的抗原结合功能。抗体的“angptl3结合片段”包括(i)fab片段， 其是由\、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，其是含有在铰链区通过 二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由 抗体的单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v) dab片段(ward等人，(1989) nature 341 544-546)，其由乂11结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(⑶r)。此外，尽管fv片段的两 个结构域vl和vh由不同的基因编码，它们可以经重组方法通过合成的接头连接，所述接头 使得vl和vh成为一条蛋白质链，其中vl和vh区配对形成单价分子(称作单链fv(scfv)； 见，例如，bird 等人(1988)science242 :423_426 ；和 huston 等人(1988)proc. natl. acad. sci.usa 85 5879-5883)。文中所用术语“单克隆抗体”指单一分子成分的抗体分子的制备物。单克隆抗体 成分显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。因此，术语“单克隆抗体”指显示出单 一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括 从转基因非人动物，例如，转基因小鼠中获得的、与永生化细胞融合的b细胞，所述动物的 基因组包含人重链转基因和轻链转基因。抗体的制备是本领域公知的，本领域技术人员可 以容易地制备angptl3的抗体。文中所用术语“标记抗体”指通过标记分子进行标记的抗体，例如由荧光团、化学 发光物质、辣根过氧化物酶等标记的抗体。本文所用的术语“任选” (optionaloptionally) 表示“可有可无”或“非必需”等含义。例如，“任选的携带工具”是指可以有该携带工具，也 可以没有该携带工具。这可以由本领域技术人员根据情况进行选择。试剂盒在一个优选实施方案中，本发明的elisa使用试剂盒完成，这样可以实现快捷操 作，从而避免常规实验检测的繁琐。本发明的优选的elisa试剂盒包括angptl3检测试剂 盒。为提高疾病诊断的灵敏度、特异性和准确率，优选使用angptl3检测试剂盒，其可以分 别或同时测得两组检测结果，以达到快捷功效。本发明的一种特别优选的angptl3elisa检 须iji式齐购自 immuno-biologicallaboratories co. ltd.。在一个优选实施方案中，本发明的angptl3检测试剂盒至少包含(1)能够结合angptl3的抗体；以及(2)当angptl3结合于(1)中限定的抗体时，能够结合于angptl3的标记抗体。上述试剂盒还可包含(3)由含有已知量angptl3的溶液组成的标准样，该标准样可以来源于基因工程 菌表达、动物或人的体液；以及(4)用于检测的抗体标记物，例如，作为报告方法的酶标签比如辣根过氧化物酶， 或者荧光标记，其可以与抗体结合形成偶联物。
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更优选地，试剂盒还可进一步包括下述物品中的至少之一 (5)携带工具，其空间 划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条等的限定空间，该容器例如是药瓶、试管 和类似物，每样容器都可含有一个单独的用于本发明方法的组分；(6)辅助试剂，比如，显 色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂以及类似物；(7)说明书，其可以写在瓶 子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部；也可以是多媒 体的形式，比如⑶、电脑光盘、录像等等。优选抗体可以固定于固相载体上，形成捕获抗体。捕获抗体在操作上特别方便。所含抗体包括任何能够结合angptl3的抗体片段，并且可以是重组体、嵌合抗体、 人源化抗体和鼠源性抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，优选单克隆抗体。优选抗体偶联物能够用elisa阅读机，比如，酶标仪进行光度测定。样本本发明所用样本可以包含多种形式，比如全血、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液、或 眼泪。其中优选血清。样本制备可根据普通方法比如离心等进行，例如，参见如下文献young，d. s. & bermes,e. ff. “ specimen collection andprocessing" in tietz textbook of clinical chemistry 2nd edition" eds. burtis, c. a. & ashwood, e. r. , saunders(1994) ；methods inenzymology, h.van vunakis and j.j.langone(eds),1981,72(b) ；practice and theory of enzyme immunoassays, p tijssen, laboratorytechniques in biochemistry and molecular biology, r. j. burden and p. h. van knippenberg (eds), elsevier, 1985 ；introduction toradioimmunoassay and related techniques, t.chard, ibid,3rd edition, 1987 ；methods in enzymology, h. van vunakis and j. j. langone(eds)1981, 74(c)。检测方法本发明可以使用elisa或其它蛋白定量技术对个体的样本进行蛋白angptl3的检 测。优选地，可以采用angptl3的特异结合剂，例如angptl3的抗体进行检测。在一个优选 实施方式中，angptl3的抗体被固定在固相载体上，例如作为捕获抗体使用。酶联免疫吸附剂测定(enzymelinked immunosorbentassay, elisa)是分子生物 学领域常用的蛋白质含量分析方法，其可用于测定抗原，也可用于测定抗体。根据试剂的 来源、样本的性状以及检测的具体条件，本发明可以采用多种不同类型，比如双抗体夹心 法、双位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法测igm抗体、以及应用亲和素和生物素的 elisa等。定量western blot也是分子生物学领域常用的蛋白质含量分析方法。还可以采用通过化学方法测定angptl3酶的活性程度的定量分析如明胶原位酶 谱(gelatin zymography)或荧光法检测。r0c 曲线在用elisa检测出样本中angptl3的浓度后，可用数学分析方法对测得的样本中 angptl3浓度进行统计学处理，在此基础上获得具有样本分类意义的分级标准。这样的数 学方法优选由计算机完成，比如用这些数据绘制r0c曲线，从而对个体的样本进行分类。例 如，可以将个体分为癌症或健康，治疗反应好和坏，预测存活期长和短等。roc ffi _ ^禾尔力 gi式 # 工 # 牛寺 ffi ffi _ (receiver operatorcharacteristiccurve)，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。r0c曲线是反映真阳性 率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(1_特异性，specif icity)连续变量的 综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值 (阈值或临界值，cut-off value，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量， 从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制曲线，曲 线下面积(auc)越大，诊断准确性越高。在r0c曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度 和特异性均较高的临界值。r0c曲线auc值在1. 0和0. 5之间。在auc > 0. 5的情况下， auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0. 5 0. 7时有较低准确性，auc在0. 7 0. 9 时有一定准确性，auc在0. 9以上时有较高准确性。r0c曲线的评价方法与传统的评价方法不同，根据实际情况，允许有中间状态，可 以把试验结果分为多个有序分类，比如正常、大致正常、可疑、大致异常和异常五个等级。上述有序分类，对于疾病的诊断而言，可分为阴性、不确定、阳性。进一步地，对于 癌症诊断而言，可分为癌症、健康。在一个实施方式中，本发明提高样本分类准确性的方法，可以包括如下步骤(1)分别测定样本中蛋白angptl3的含量；(2)以angptl3蛋白含量的比值为变量，根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和 特异性绘制出r0c曲线，并计算曲线下面积auc ；以及(3)按照期望的灵敏度和特异性，对测定样本进行分类(癌症或健康)。r0c曲线的绘制可以使用现有技术中的软件或系统，比如medcalc 9. 2. 0. 1医学 统计软件、spss 9. 0、r0cp0wer. sas、designroc. for、multireader_power. sas、create_ r0c.sas、gb stat v10. 0 (dynamic microsystems, inc. silver spring, md, usa)等等。jl巢痛的i会iff、予页后i平估、治疗z效果监测丨或病禾g监测丨本发明还提供了一种用于卵巢癌的诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测的 联合测试试剂盒，其至少包含(1)能够结合angptl3的抗体；以及(2)当angptl3结合于 ⑴中限定的抗体时，能够结合于angptl3的标记抗体。在一个优选实施方式中，本发明提供了一种对受试者的卵巢癌进行诊断、预后评 估、治疗效果监测或病程监测的方法，包括检测受试者血液样本中angptl3的表达量和 angptl3的含量在时间上的变化(如，不同癌症发展时期，治疗前和治疗后等)。本发明还提 供了一种提高样本分类准确性的方法，其包括测定样本中angptl3的含量，和angptl3的 含量在时间上的变化(如，不同癌症发展时期，治疗前和治疗后等)；以angptl3蛋白含量 在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出r0c曲线， 并计算曲线下面积auc ；按照auc值、灵敏度和特异性对样本进行分类。例如，可以将个体 分为癌症或健康，治疗反应好和坏，预测存活期长和短等。在一个优选实施方式中，例如，可 以将angptl3含量与来自健康受试者的参比值进行比较，如果明显低于所述参比值则确定 所述受试者患有卵巢癌。在另一个优选实施方式中，进一步结合angptl3的低表达和任一 在卵巢癌中高表达的蛋白的联合检测，计算他们的比值的差异，并以比值在时间上的变化 为变量，根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异性绘制出r0c曲线，并计算曲线下面 积auc,进而对样本进行分类。此处所用的术语“在卵巢癌中高表达蛋白”是指该蛋白在卵巢癌患者中的表达量显著高于正常受试者。“在卵巢癌中高表达的蛋白”的实例包括ca125，mesothelin(hassan r, remaley at, sampson ml, zhang j, cox dd, pingpank j, alexander r, ffillingham m, pastan i, onda m :detection and quantitation of serum mesothelin, a tumor markerfor patients with mesothelioma and ovarian cancer. clin cancer res 2006, 12(2) :447-453.)，he4, m-csf，osteopontin, kallikrein (s)，和可溶性 egf 受体(soluble egf receptor, bast rc, jr. , badgwell d, lu z, marquez r, rosen d, liu j, baggerly ka,atkinson en,skates s,zhangz et al :new tumor markers :ca125 and beyond. int j gynecol cancer2005,15suppl 3:274-281.)。以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应当理解，以下实施例仅用于说明 本发明而不以任何形式用于限定本发明的范围。实施例1以下以个体的血清为样本进行卵巢癌诊断为例，对本发明作进一步详细说明。样本的采集收集卵巢癌患者的术前血清样本和年龄匹配的(34-82岁范围)的健康女性的血 清用作对照。在静脉穿刺取血的2小时内，通过离心收集血清，并将等分样品储存在_80°c 直至使用。测angptl3 含量elisa分析-运用了 immuno-biological laboratories co. ltd.开发的人血管生 成素样蛋白3(angptl3)elisa试剂盒(cat#27409)。elisa分析可根据生产商的说明书操 作。利用dynamicmicrosystems公司开发的gb stat统计包来分析r0c曲线。并且使用bio-rad 680型酶标仪(美国)进行elisa操作，包括1、取出冷藏储存的试剂盒，放置，恢复温度至室温(20_25°c )。计算要检测的标本 总数和质控数。每个标本需要一个抗原包被孔。每次实验都要做阳性对照、阴性对照和校 准品。确定需要的微孔数量。当板条温度至室温时，打开板条的保护袋，拿出抗原包被的微 孔板条。本次实验不需要使用的试剂条应放入这个可重新密封的袋子，密封，重新存放在 2-8 °c。2、依次在微孔板上加入20 ii l的标准液、对照液和血清样本。此过程务必在三十 分钟内完成。3、在每个微孔中加入100 y l的捕获液，用移液器在孔中反复吹打进行混勻。4、用微孔板盖盖好板，在室温下(18_25°c )进行温育55-65分钟。5、按下述步骤手工洗板3次a、剧烈摇动并倒掉板中的液体；b、在孔中加满洗液。保证孔中无残余气泡。c、再重复前两步骤两次。d、摇动并去除孔中的洗液。把板翻转，在纸巾上轻拍，以便能拍干所有洗液。观察 微孔板，确保无残留的洗液。6、在酶标抗体复合物的瓶子里加入7ml的再生缓冲液，存放于室温下待用。7、按照同样的次序把稀释好的酶复合物加100yl到微孔板上8、用微孔板盖盖好板，在室温下(18-28°c )进行温育55-65分钟。
9、配制底物，在底物缓冲液中加入一片底物固体，30-60分钟后溶解，强烈摇晃，使
溶液完全混合。10、按照步骤5中a到d的方法进行洗板。11、以同样的速度和次序把底物液加100yl到每孔中。12、微孔板在室温下(18-28°c )进行温育55-65分钟。13、以同样的速度和次序在每个孔中加入100 y l的终止液。加了终止液后应轻轻 敲打微孔板，确保样品全部混勻。14、设置酶标仪的检测波长在405nm处。检测每个孔的0d值。应在加了终止液的 15钟之内进行读数。15、用一线性校准曲线“y = mx b”来分析angptl3的结果。16、通过标准曲线来读出血清样本和对照液中angptl3的浓度。mm经上述步骤，得到的检测结果如表1所示。表1. angptl3在正常人群和卵巢癌病人血清中的表达
0128]样品浓度(ng/ml)0129]cl25.060130]c2ill860131]c314.210132]c475.690133]c5343330134]c6412040135]c764.840136]c893.780137]c928.680138]clo129940139]nl419280140]n2260140141]n3549480142]n4307160143]n5415660144]n6278230145]n7701380146]n890.160147]n9357790148]nlo45183*c代表癌症样品，n代表正常样品由表1可以看出，angptl3的浓度与卵巢癌症状有密切的相关性，即卵巢癌患者血 清中angptl3蛋白的含量明显低于健康志愿者血清中的含量。我们发现，与所述10个正常个体相比，所述10个卵巢癌血清样本中血管生成素样 蛋白 3 (angptl3)的表达量更低(t-test，p = 0. 0009，tail 1，type 3)(图 1)。结果表明angptl3的浓度与卵巢癌症状有密切的相关性，本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式
11将其全部内容包括在本文中。应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以 在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。参考t献[l]greenlee，r. t.，hill-harmon, m. b.，murray, t.，thun，m.，cancer statistics，2001. ca cancer j clin 2001，51，15-36.[2] young, r. c.，walton, l. a.，ellenberg，s. s.，homesley, h. d.，et al.， adjuvant therapy in stage i and stage ii epithelial ovarian cancer. results of two prospective randomized trials. n engl j med 1990,322,1021-1027.[3] van nagell, j. r. , jr. ，depriest，p. d. , reedy, m. b. gallion h. h. ，et al.， the efficacy of transvaginal sonographic screening inasymptomatic women at risk for ovarian cancer. gynecol oncol 2000，77，350-356.[4]kyrgiou, m.，tsoumpou，i.，martin-hirsch，p.，arbyn，m.，et al.，ovarian cancer screening. anticancer res 2006,26,4793-4801.[5]skates，s. j.，xu，f. j.，yu，y. h.，sjovall，k.，et al.，toward anoptimal algorithm for ovarian cancer screening with longitudinal tumormarkers. cancer 1995，76，2004-2010.[6]zhang, z.，barnhill，s. d.，zhang，h.，xu, f.，et al.，combination of multiple serum markers using an artificial neural networkto improve specificity in discriminating malignant from benign pelvicmasses. gynecol oncol 1999，73， 56-61.[7]mcintosh，m. w.，urban，n.，karl an, b.，generatinglongitudinal screening algorithms using novel biomarkers for disease. cancer epidemiol biomarkers prev 2002，11，159-166.[8]berek, j. s. , bast, r. c. , jr. , ovarian cancer screening. the useof serial complementary tumor markers to improve sensitivity andspecificity for early detection. cancer 1995，76，2092-2096.[9] jacobs, i. j. , skates, s. j.，macdonald，n.，menon，u.，et al.，screening for ovarian cancer :a pilot randomised controlled trial. lancetl999,353,1207-1210.[10]kim，j. h.，skates，s. j.，uede，t.，wong, k. k.，et al.，osteopontin as a potential diaghostic biomarker for ovarian cancer. jama2002,287,1671-1679.[ll]hato，t.，tabata，m.，oike，y.，the role of angiopoietin-likeproteins in angiogenesis and metabolism. trends cardiovasc med 2008，18，6—14.[12]koishi，r.，an do, y.，0no，m.，shimamura，m.，et al.，angptl3regulates lipid metabolism in mice. nat genet 2002，30，151—157.
1权利要求
一种诊断受试者中的卵巢癌的方法，包括检测来自受试者的样本中的angptl3含量，对所述angptl3含量进行分析，和根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。
2.一种提高样本分类准确性的方法，包括 检测所述样本中的angptl3含量， 对所述angptl3含量进行分析，和根据所述分析结果，对样本进行分类。
3.一种对受试者的卵巢癌进行诊断、预后评估、治疗效果监测或病程监测的方法，包 括检测受试者血液样本中angptl3的表达。
4.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述样本选自由尿液、脑脊液、唾液和眼泪所构 成的组。
5.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述样本为血液样本。
6.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述样本为血清样本。
7.权利要求1-6之任一项的方法，其中所述检测采用elisa或定量westernblot进行。
8.权利要求1-7之任一项的方法，其中所述检测采用angptl3的特异结合剂进行。
9.权利要求8的方法，其中所述angptl3的特异结合剂为angptl3的抗体或其angptl3 结合片段。
10.权利要求8的方法，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。
11.权利要求8的方法，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。
12.权利要求1-11之任一项的方法，其中所述分析包括绘制r0c曲线，其中以angptl3 为变量，根据不同的阈值绘制出r0c曲线，并计算曲线下面积auc，并且按照期望的灵敏度 和特异性进行判断。
13.权利要求1-11之任一项的方法，其中所述分析包括将所述angptl3含量与来自健 康受试者的参比值进行比较，如果明显低于所述参比值则确定所述受试者患有卵巢癌。
14.用于实施权利要求1-13之任一项的方法的试剂盒，其包含angptl3的特异结合剂。
15.权利要求14的试剂盒，还包含能够结合angptl3的标记抗体。
16.权利要求14-15之任一项的试剂盒，其中所述angptl3的特异结合剂为angptl3的 抗体或其angptl3结合片段。
17.权利要求16的试剂盒，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。
18.权利要求16的试剂盒，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。
19.权利要求15-18之任一项的试剂盒，其中所述标记抗体被辣根过氧化物酶或者荧 光标记。
20.权利要求14-19之任一项的试剂盒，还包含 包含已知量angptl3溶液的标准样；以及用于检测的抗体标记物，其可以与抗体结合形成偶联物。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述抗体标记物为辣根过氧化物酶或者荧光物质。
22.权利要求14-21之任一项的试剂盒，还包含任选的抗体偶联物；任选的选自由显色剂、酶抑制剂、缓冲液、稳定剂、稀释剂、洗涤试剂构成的组的辅助试 剂；和任选的说明书。
23.权利要求14-22之任一项的试剂盒，其中所述angptl3的特异结合剂被固定于固相 载体上。
24.angptl3的特异结合剂在制备用于诊断卵巢癌的试剂中的用途。
25.权利要求24的用途，其中所述angptl3的特异结合剂为angptl3的抗体或其 angptl3结合片段。
26.权利要求25的用途，其中所述angptl3的抗体为单克隆抗体。
27.权利要求25的用途，其中所述angptl3的抗体为多克隆抗体。
28.angptl3作为卵巢癌诊断标志物的用途。
29.一种提高样本分类准确性的方法，其包括测定样本中angptl3的含量，和angptl3的含量在时间上的变化；以angptl3含量在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌症诊断的灵敏度和特异 性绘制出roc曲线，并计算曲线下面积auc ；按照auc值、灵敏度和特异性对样本进行分类。
30.一种提高样本分类准确性的方法，其包括测定样本中angptl3和任一在卵巢癌中高表达蛋白的含量，以及它们各自的含量在时 间上的变化；以angptl3和该高表达蛋白含量的比值在时间上的变化为变量，根据不同的阈值对癌 症诊断的灵敏度和特异性绘制出roc曲线，并计算曲线下面积auc ；按照auc值、灵敏度和特异性对样本进行分类。
全文摘要
本发明提供了一种诊断受试者中的卵巢癌的方法，包括检测来自受试者的样本中的angptl3含量，对所述angptl3含量进行分析，和根据分析结果确定所述受试者是否患有卵巢癌。本发明还提供了用于卵巢癌诊断的试剂盒。
文档编号g01n33/574gk101852805sq20091013341
公开日2010年10月6日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者林标扬 申请人:浙江大学