专利名称：：一种用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物和医学检测领域。特别是涉及一种用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒。二、
背景技术：
卵巢恶性肿瘤是目前国内外常见的妇科恶性肿瘤，其死亡率已占全部妇女恶性肿瘤的第四位，尽管近20年来，人们在治疗方面做了相当大的努力包括新的药物和方案的发现、手术的改进。但死亡率高居妇科恶性肿瘤首位，五年生存率仅为30%左右。造成其死亡率居高不下的重要原因之一是缺乏早期诊断的手段，70%的病人初诊时已为晚期患者。虽然各种新的卵巢肿瘤标记物及新的卵巢恶性肿瘤的诊断手段层出不穷，但由于卵巢恶性肿瘤早期症状不明显，外科手术和物理影像学检测费用高昂、费时，造成对于无症状、无家族史的妇女进行早期卵巢恶性肿瘤的诊断、筛查手段仍然不尽人意。迄今为止，没有一个有效的血清标志物用于个体筛查和早期诊断，包括血清ca125对i期卵巢恶性肿瘤的诊断特异性、敏感性也仅有25%-30%左右，因此，早期发现、对卵巢恶性肿瘤进行早期诊断对于改善卵巢恶性肿瘤患者的预后有着极其重要的意义。三、
发明内容本发明的目的是提供一种用于检测早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，它能够对卵巢恶性肿瘤进行早期检测，改善卵巢恶性肿瘤患者的预后。本发明通过以下技术方案实现上述目的一种用于早期卵巢癌诊断的酶联免疫检测试剂盒，由重组人趋化因子配体18(以下简称ccl18)和重组人黑色素瘤生长激活因子-a(以下简称cxcl1)参照品、鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体、兔抗人ccl18多克隆抗体、兔抗人cxcl1多克隆抗体、hrp标记的人抗兔igg、多克隆抗体包被板、质控品和辅助试剂组成。所述重组人ccl18和重组人cxcl1参照品是经ccl18和cxcl1cdna克隆、重组蛋白的诱导表达、ninta螯合树脂层析分离纯化而获得。所述兔抗人ccl18多克隆抗体，兔抗人cxcl1多克隆抗体，是将重组人ccl18，重组人cxcl1，免疫新西兰兔，经过3-4次加强免疫后符合效价要求时，立即颈动脉采血，分离血清后，用proteing柱亲和层析纯化获得。所述鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体是将纯化的his融合蛋白与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，经皮下注射免疫balb/c小鼠，经腹腔注射加强免疫，用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原，共加强免疫，取效价高的老鼠，脾内注射抗原加强免疫4天后，取脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0在peg4000作用下融合，用间接酶联免疫法筛选单克隆抗体(mab)分泌阳性的杂交瘤细胞，经3、4次有限稀释法克隆化后,选择2株mab分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养，并按常规制备腹水并纯化获得。所述多克隆抗体包被板是将兔抗人ccl18多克隆抗体和兔抗人cxcl1多克隆抗体稀释后滴入酶标板各孔，经吸附、洗板、封闭、吹干等步骤处理后制得。所述辅助试剂包括酶联反应溶液、显色液、终止液及清洗缓冲液。本发明所述用于检测早期卵巢癌诊断的检测试剂盒的制作方法包括标准品的制备、单克隆抗体、多克隆抗体的制备、多克隆抗体包被板的制作及辅助试剂的配置。(一)试剂盒的ccl18、cxcl1标准品制备步骤1、ccl18和cxcl1cdna的克隆(1)卵巢癌组织总rna的抽提和反转录反应:取新鲜卵巢癌组织组织，液氮冷冻后按rna提取试剂盒中的说明抽提rna，用紫外分光光度法鉴定其纯度，甲醛变性凝胶电泳鉴定其完整性。经电泳证实rna无降解后进行反转录，操作按反转录试剂盒说明进行。(2)pcr扩增根据genbank中ccl18和cxcl1的cdna序列，设计引物，用以扩增编码成熟蛋白cdna。ccl18引物1:5，gcacmgttggmccmca3，；引物2:5，tcaggcattcagcttcag3，；cxcl1引物1:5'gcgtccgtggccactgm3';引物2:5，agtgttggatttgtcactgttcagcat3'。pcr产物经10g/l的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。(3)cdna的鉴定将纯化的pcr产物与petsumotacloning载体连接后，转化感受态大肠杆菌machlttlre.coli。转化菌液涂布于含5(￥g/ml的卡那霉素的lb平板上，于37t:培养过夜,挑取白色菌落进行培养，提取重组质粒，以质粒引物进行pcr鉴定，阳性克隆进行dna测序，选择正向连入了pcr产物的质粒，转化表达菌bl21(de3)，诱导表达。2、重组蛋白的诱导表达将petsumotacloning表达质粒转化入感受态细胞bl21(de3),挑取菌落pcr阳性的单菌落接种于含卡那霉素lb培养基，37°c培养过夜，次日按1:50转染，加入终浓度分别为lmmol/l的iptg诱导培养5h后，以12000rpm离心收集诱导表达后的菌体沉淀，将沉淀重悬于裂解缓冲液(50画l/ltris'hcl，0lmmol/ledta，100mmol/lnacl，ph75，0lmg/ml溶菌酶)中，冰上裂解lh后超声破碎，离心后再取上清，经ninta螯合树脂层析,洗脱回收蛋白。将洗脱液离心超滤浓縮(可截留5ka以上的蛋白)，最后测定得到的蛋白溶液浓度。经esi—ms/ms质谱鉴定获得重组ccl18和cxcl1蛋白。(二)兔抗人ccl18多克隆抗体、兔抗人cxcl1多克隆抗体制备步骤分别选用2.5k新西兰兔3只，免疫前取血作为阴性血清对照。将定量后的his融合蛋白与弗氏完全佐剂等量乳化后，于兔背部皮下多点注射，每点约100ug。2周后加强免疫，剂量同前，用不完全福氏佐剂充分乳化后，于兔背部皮下多点注射；以后隔2周加强免疫1次；从第3次加强免疫开始，每次免疫后7d，经耳中央动脉采血测定抗体的效价，经过4次加强免疫后符合要求时，立即颈动脉采血，分离血清后，用proteing柱亲和层析纯化，无菌分装保存于-8(tc备用。将纯化出的ccl18和cxcl1蛋白抗原稀释后以125^g/ml每孔200u1包被96孔酶标板,兔免疫前血清作为阴性对照，最后一次加强免疫后的血清作为阳性血清，行间接酶联免疫检测多克隆抗体的效价。多克隆抗体western印迹检测提取重组大肠肝菌bl21(de3)裂解总蛋白，进行sdspage凝胶电泳，分别以制备的多克隆抗体，购买的商品化ccl18和cxcl1单克隆抗体，以及免疫前阴性对照血清作为一抗，以羊抗兔辣根过氧化物酶偶联抗体为二抗，进行western印迹检测抗体的特异性。(三)鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体制备步骤用120ul纯化的his融合蛋白(25g/l)稀释于880ulpbs(0lmol/lpb、015mol/lnacl)并与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，经皮下注射免疫balb/c小鼠(50ug/只)。一个月后，经腹腔注射加强免疫，用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原，注射剂量同前，共加强免疫3次，每次间隔2周。检测抗血清的效价，取效价高的老鼠，脾内注射10ug抗原加强免疫，4d后，取脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0在peg4000作用下融合。用间接酶联免疫法筛选单克隆抗体(mab)分泌阳性的杂交瘤细胞。经3、4次有限稀释法克隆化后，选择2株mab分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养，并按常规制备腹水并纯化。mab的特性鉴定(1)效价测定:采用间接酶联免疫法。用50ulccl18和cxcll蛋白(lmg/l)包被酶标板。一抗为适当稀释的杂交瘤细胞培养上清或腹水样本，二抗为1:2000的hrp羊抗鼠igg。(2)ig亚类(型)的鉴定:参照试剂盒的说明书进行。(3)特异性鉴定:纯化的融合蛋白进行sdspage后，电转移至硝酸纤维素(nc)膜上，转移后的nc膜于封闭液中封闭后，先后与抗ccl18和cxcl1的mab和hrp标记的羊抗鼠igg进行孵育，进行western印迹检测抗体的特异性。(四)多克隆抗体包被板的制作步骤将上述多克隆抗体用碳酸盐缓冲液稀释后加入酶标板各孔，每孔100ul，吸附过夜，用吐温20磷酸盐缓冲液洗板，再用吐温20磷酸盐缓冲液封闭过夜，甩干后晾干，即获得多克隆抗体包被酶标板。(五)辅助试剂的配制步骤(1)底物溶液采用磷酸-柠檬酸缓冲液(ph=5.0)配制的3%过氧化氢溶液。(2)显色液四甲基联苯胺(tmb)甲醇溶液，浓度为o.lmg/ml。(3)反应终止2mol.l^硫酸(4)清洗缓冲液pbs(ph=7.4)配制的0.05%吐温20磷酸盐溶液。四图1是本发明建立区分卵巢恶性肿瘤和非恶性肿瘤的分类树模型示意图。五具体实施方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。实施例一ccl18、cxcl1定量酶联免疫法检测试剂盒应用实例一种卵巢癌蛋白标志物ccl18、cxcl1定量酶免检测酶联免疫试剂盒96人份，其中包括ccl18、cxcl1重组蛋白、多克隆抗体积96孔包被板各一块。酶联免疫法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质。(2)加受检标本使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。(3)加酶标抗体使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。(4)加底物夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。本实例采用两株来源不同免疫动物的抗体，其中一株作为包被酶标板的捕获抗体，以识别和结合待检测血清中的抗原，另一株作为检测抗体，与结合包被抗体的抗原的另一种表位结合，并与hrp标记的酶标抗体结合，催化底物显色。捕获抗体和检测抗体分配按表l。表1检测潜在血清标记物抗体来源tableseeoriginaldocumentpage10
酶联免疫检测血清ccl18包被捕获抗体的浓度为1ug/ml，检测抗体的浓度为0.2"g/ml;cxcll包被捕获抗体的浓度为50ng/ml，检测抗体的浓度为0.5tig/ml。1、参照品标准曲线浓度的确定按确定上述捕获抗体的最佳浓度包被96孔板，将ccl18,cxcll的参照品稀释如下浓度梯度:31.2pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml加入100^1至96孔板。，加入最佳浓度二抗，测0d450。根据包被浓度与相应的0d450值绘制曲线，选取线性范围的包被浓度制作标准曲线。2、血清检测浓度的确定分别取各组三份血清，将血清样品稀释2x，5x，iox进行测定，每样品两个重复，以0d450值在0.6-1.5且在标准曲线范围上限的浓度为最终实验浓度。3、潜在血清标记物酶联免疫法检测步骤方法1)用包被液将捕获抗体稀释至所需浓度。2)包被每孔加100u1稀释好的捕获抗体4"c包被16h。3)甩尽包被液并拍干，按300ii1/孔的量用洗板液洗板3次，每次振荡5min。4)按300u1/孔用封闭液37'c封闭4小时。5)抗原抗体反应按上述方法洗板并拍干后，按100ul/孔的量加入稀释好的血清，37。c孵育2h。6)检测抗体反应洗板甩干，按100ul/每孔加入所需稀释度的检测抗体,37。c孵育2h。7)每孔加入1:1000的每孔加入1:1000稀释的hrp标记的人抗羊或人抗兔鼠igg100ul，37-c孵育15min。8)甩干液体后洗板液洗板3次，拍干后按100u1/孔加入tmb显色底物(a、b液l:l混匀)，37'c避光显色30分钟。9)每孔加入终止液50ix1终止，混匀后立即测0d450。4、血清检测设计每板均设不同梯度的标准品，作标准曲线，设空白对照孔(复孔)每份血清样品设2个复孔，结果分析时取其平均值减去空白对照孔平均值得到该样品的初始值。根据标准品od值绘制标准曲线，从而计算出待测标本中抗原含量。5、结果判断及统计学分析采用ssps13.0统计学软件，根据卵巢癌、卵巢良性肿瘤患者和正常对照人群血清中各潜在血清标记物的含量绘制受试者工作特征曲线roc(receiveoperatingcharacteristiccurve),根据roc曲线分析卵巢癌潜在血清标记物的含量对卵巢癌检测的敏感性和特异性。敏感性定义为所有卵巢恶性肿瘤患者血清样品中正确诊断为阳性的比例，特异性定义为所有卵巢良性肿瘤患者及正常对照人群血清样品中正确诊断为阴性的比例。将达到最佳敏感性与特异性的cutoff值作为判断阳性、阴性的临界值。评估诊断的准确性，阳性预测值、阴性预测值，并与ca125检测的结果比较，结果见表2。表2ccl18、cxcl1与ca125对不同临床病理分期卵巢恶性肿瘤的判别结果比较
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6、ccl18、cxcl1血清标记物酶联免疫法检测模型的建立采用biomarkerpatterns软件对卵巢恶性肿瘤患者与对照(正常人和卵巢良性肿瘤病人)血清中各潜在标记物的含量做线性分类分析，建立诊断模型，判断建立诊断模型的血清标本归属哪一类。以临床诊断为标准，计算模型的敏感度和特异度，阳性预测值、阴性预测值，评估此诊断模型的准确性。对照图1，采用ciphergen公司biomarkerpatterns5.0软件建立区分卵巢恶性肿瘤和非恶性肿瘤的分类树模型。用此模型选择v-foldcross-validation法，将用于建立模型的265份血清标本随机分成12组，进行返回验证，将血清中cxcl1值>349.759pg/ml且ccl18含量高于40.811ng/ml的人群划为卵巢恶性肿瘤组，反之为非恶性肿瘤组，显示诊断模型roc曲线下面积达到理想的诊断效果1.000，两个分组完全判别正确。潜在血清标志物cxcl1和ccl18建立的卵巢恶性肿瘤诊断分类树模型biomarkerpatterns5.0软件建立区分卵巢恶性肿瘤和非恶性肿瘤的分类树模型，结果表明以cxcl1和ccl18两个指标建立的诊断模型灵敏度和特异度达100%,优于ca125。权利要求1、一种用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，包括96孔聚苯乙烯酶标板、过氧化物酶标记的人抗兔igg、多克隆抗体包被板、质控品和辅助试剂，其特征在于还含有重组人ccl18和重组人cxcl1参照品、鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体、兔抗人ccl18多克隆抗体、兔抗人cxcl1多克隆抗体。2、根据权利要求1所述的用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，其特征在于所述重组人ccl18和重组人cxcl1参照品是经ccl18和cxcl1cdna克隆、重组蛋白的诱导表达、ninta螯合树脂层析分离纯化而获得。3、根据权利要求1所述的用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，其特征在于所述兔抗人ccl18多克隆抗体，兔抗人cxcl1多克隆抗体，是将重组人ccl18，重组人cxcl1，免疫新西兰兔，经过3-4次加强免疫后符合效价要求时，立即颈动脉采血，分离血清后，用proteing柱亲和层析纯化获得。4、根据权利要求1所述的用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，其特征在于所述鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体是将纯化的his融合蛋白与等量完全弗氏佐剂混合，充分乳化后，经皮下注射免疫balb/c小鼠，经腹腔注射加强免疫，用不完全弗氏佐剂充分乳化抗原，共加强免疫，取效价高的老鼠，脾内注射抗原加强免疫4天后，取脾细胞与骨髓瘤细胞sp2/0在peg4000作用下融合，用间接酶联免疫法筛选mab分泌阳性的杂交瘤细胞，经3、4次有限稀释法克隆化后，选择2株mab分泌持续阳性的杂交瘤细胞扩大培养，并按常规制备腹水并纯化获得。5、根据权利要求1所述的用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，其特征在于所述多克隆抗体包被板是将兔抗人ccl18多克隆抗体和兔抗人cxcl1多克隆抗体稀释后滴入酶标板各孔，经吸附、洗板、封闭、吹干步骤处理后制得。6、根据权利要求1所述的用于早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，其特征在于所述辅助试剂包括酶联免疫反应溶液、显色液、终止液及清洗缓冲液。全文摘要本发明提供一种用于检测早期卵巢癌诊断的检测试剂盒，它由96孔聚苯乙烯酶标板、过氧化物酶标记物、鼠抗人ccl18单克隆抗体、鼠抗人cxcl1单克隆抗体、兔抗人ccl18多克隆抗体、兔抗人cxcl1多克隆抗体，显色液、终止液、标准液和盖板膜构成。该试剂盒使用了卵巢癌血清标志物ccl18、cxcl1。本试剂盒可用于检测良、恶性卵巢肿瘤，特别是检测早期的卵巢癌。文档编号g01n33/577gk101261275sq20081007343公开日2008年9月10日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者力李,琪王,阳志军,黎丹戎申请人:李力;王琪;黎丹戎;阳志军