本发明涉及一种检测人巨细胞病毒（hcmv）igg和igm抗体的elisa检测试剂盒。
背景技术：
人巨细胞病毒（human cytomegalovirus， hcmv）可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径传播。人群感染hcmv的显著特点是感染率高，正常成人hcmv抗体阳性率为76.7%－95.8%，我国也是hcmv感染高度流行国家之一。
hcmv初次感染可无明显症状，但病毒从此长期潜伏体内。当机体免疫功能低下时，潜伏病毒开始复制并大量增殖，继发活动性感染并表现多种临床症状。hcmv感染是导致出生缺陷的重要因素之一，并且有研究显示hcmv感染与糖尿病、动脉粥样硬化及一些恶性肿的发病密切相关。临床活动性hcmv感染多见于孕妇，新生儿、输血患者、恶性肿瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制剂的患者。孕妇活动性感染可通过胎盘、产道或授乳传给胎儿，导致流产，死胎，胎儿形态畸形，器官功能障碍。先天感染的新生儿出生时可伴有黄疸、瘀斑、脉络膜视网膜炎、小头畸形等，而无症状的部分新生儿，随着发育才逐渐被发现听觉、视力低下，智力发育迟缓，运动障碍等。在恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能减弱或受抑制的患者hcmv的活动性感染常并发间质性肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等多器官脏器损害的各种临床综合征，是患者致死或移植术失败的重要原因。
无论是初次感染还是潜伏病毒的继发活动性感染，病毒大量复制、出现症状的早期机体会产生igm型抗体。igm相对于igg的特点是产生早、消失快。所以igm的检出代表近期感染、机体可能尚处于病毒大量复制状态。加之igm的检测多采用简便快速价格低廉的elisa方法，所以尽管存在被检出的时间段较短，依然是临床常用的初步判断感染与否的检测方法。而目前检测hcmv igm的试剂多以hcmv全病毒裂解蛋白作为包被抗原。其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数hcmv igm抗体检测试剂虽以hcmv的重组蛋白为包被抗原，试剂制作经济简便，但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高。所以研制制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的hcmv igm抗体检测试剂依然具有实际意义。
检测igg抗体了解人群感染率，对hcmv相关疾病的预防、管理控制及相关政策的制定具有重要意义。而明确个体hcmv已感染状态则利于临床确定个体治疗方案，如aids及器官移植术患者，需要检测hcmv igg抗体，从而确定是否需要跟踪其igm抗体水平，以便及时抗hcmv治疗。所以hcmv igg抗体的检测虽然只能代表曾感染、体内潜伏有hcmv，并非病毒活动性感染的指证，但是仍然具有市场需求。目前市售检测hcmv igg抗体的试剂多以hcmv全病毒裂解物作为包被抗原，其抗原成分复杂且潜在宿主细胞蛋白污染的可能，也潜在结合疱疹病毒科其他病毒抗体产生假阳性信号的可能，并且试剂的制作过程因需要培养病毒而操作繁琐。少数hcmv igg抗体检测试剂则以hcmv的重组蛋白为包被抗原，这种试剂制作经济简便但是试剂的稳定性较差，敏感性和特异性也有待提高，而进口的此类试剂价格过高。
综上所述，需要一种制作过程简单、费用低廉、敏感性和特异性更好的hcmv igg和hcmv igm抗体检测试剂。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于提供一种基于pp65蛋白检测hcmv igg和igm的试剂盒，至少具有特异性、敏感性、稳定性更高的特点。
根据本发明的一个方面，提供了一种基于pp65蛋白检测hcmv igg和igm的试剂盒，包括
——包被有重组hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板；
——酶标二抗，包括用于检测igg的hrp-抗人igg抗体和用于检测igm的hrp-抗人igm抗体。
作为优选的技术方案，所述的包被有重组hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板的制备方法包括步骤：原核表达并纯化hcmv被膜磷蛋白pp65322-561；包被液稀释重组pp65322-561蛋白抗原为10µg/ml，每孔100μl加入酶标板中，37℃ 1小时，再4℃包被12~24小时；弃去孔内液体，pbst洗后拍干，使用含1%bsa的pbs封闭液每孔100μl， 37℃封闭2h，pbst洗后拍干。
上述试剂盒可用于检测hcmv igg抗体和hcmv igm抗体。
作为优选的技术方案，所述的hrp-抗人igg抗体选自hrp-羊抗人igg抗体、hrp-兔抗人igg抗体、hrp-鼠抗人γ链抗体中的一种。所述的hrp-抗人igm抗体选自hrp-羊抗人igm抗体、hrp-兔抗人igm抗体、hrp-鼠抗人µ链抗体中的一种。
含hcmv强免疫原性抗原表位的重组蛋白可代替全病毒用于hcmv特异性抗体的检测。hcmv pp65蛋白是hcmv众多结构蛋白中可以特异性激发b 细胞、细胞毒性 t 细胞( ctl)和辅助性 t 细胞( th) 免疫的主要靶蛋白，不同hcmv病毒株中, hcmv pp65基因高度保守，本发明所用pp65332～561片段是富含t细胞表位和b细胞表位的pp65第322到561位氨基酸序列。pp65蛋白是hcmv被膜磷蛋白而非糖基化蛋白，无需真核表达的糖基化和折叠过程，在原核细胞表达就可获得高免疫活性蛋白片段。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒igg抗体的方法，采用了上述试剂盒。
作为优选的技术方案，所述检测人巨细胞病毒igg抗体的方法包括步骤：稀释的待检血清，于酶标板孔内加样37℃孵育，洗板；加酶标二抗hrp-抗人igg抗体37℃孵育，洗板；加底物显色液，室温显色；加终止液，酶标仪检测od450值。
根据本发明的另一方面，提供了一种检测人巨细胞病毒igm抗体的方法，采用了上述试剂盒。
作为优选的技术方案，所述的检测人巨细胞病毒igm抗体的方法包括步骤：将igg-rf吸附剂与待测血清混匀，室温放置；稀释经吸附剂处理过的待测血清，于酶标板孔内加样，37℃孵育后pbst洗板，拍干；加酶标二抗hrp-抗人igm抗体 37℃孵育，洗板；加底物显色液，室温显色；加终止液，酶标仪检测od450值。待测血清样品中针对包被抗原的特异性igm常常与特异性igg同时存在，后者会干扰igm的测定。同时，类风湿因子（rf）也会干扰检测结果。因此在血清样品测定前，须加入igg-rf吸附剂以消除igg、rf干扰。本发明实验探明将igg-rf吸附剂与待测血清1:1混匀，室温放置30 min可去除干扰。
本发明利用重组pp65332～561蛋白建立了检测hcmv igg抗体和hcmv igm抗体的间接elisa检测方法，证明试剂具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，且试剂制作过程简单、标准易于控制。上述检测方法仅获得中间结果，该结果与疾病的诊断或健康状况无直接必然联系。对于igg检测方法，阳性仅能说明曾经感染过，主要用于流行病学调查，以利于疾控部门制定政策参考。对于igm检测方法，如果是阳性，还需要结合其他必要指标才能确定是否处于感染状态，检测群体igm阳性率也常用于人群近期感染现状的流行病学调查。
以广为应用的、业界认为敏感性和特异性均较好的意大利德赛公司检测试剂作为相对参考试剂，检测结果表明，检测hcmv igg抗体与其符合率为95%，检测hcmv igm抗体与其符合率为81%，且本发明的阳性检出率高于此试剂，敏感性更高。为临床快速检测hcmv igg和hcmv igm抗体，明确既往感染和潜伏感染提供了一种新选择，也为人群hcmv感染状态的流行病学调查和常规监测提供了新的备选方案。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
基于pp65 322-561蛋白检测igg的试剂，包括包被有重组hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板、hrp-抗人igg、pbst洗涤液、底物显色液和终止液。
其中，hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板的制备方法是原核表达并纯化hcmv被膜磷蛋白pp65322-561；包被液稀释重组pp65322-561蛋白抗原为10µg/ml，每孔100μl加入酶标板中，37℃ 1小时，再4℃包被12~24小时；弃去孔内液体，pbst洗3次，拍干，使用含1%bsa的pbs封闭液每孔100μl， 37℃封闭2h，pbst洗3次，拍干。
pbst洗涤液的配方为：0.15m kh2po4 0.2g，na2hpo4·12h2o 2.9g，nacl 8.0g， kcl 0.2g，0.05％ tween-20 0.5ml，加蒸馏水至40ml；
底物显色液是在临用前由底物液a和底物缓冲液b各一半混合而成。底物液a主要成份是四甲基联苯胺（tmb)：tmb 20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水至100ml；底物缓冲液b主要成份是ph5.0的磷酸柠檬酸：0.2m na2hpo4 25.7ml，0.1m 柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至100ml；
终止液主要成份是2m h2so4：蒸馏水178.3ml，逐滴加入98％的浓硫酸21.7ml；
封板膜为与酶标板的板面大小一致的透明塑料膜。
以上所述的hrp-抗人igg抗体选自hrp-羊抗人igg抗体、hrp-兔抗人igg抗体、hrp-鼠抗人γ链抗体中的一种，但不限于此。
实施例2
基于pp65 322-561蛋白检测igm的试剂盒，包括包被有重组hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板、hrp-抗人igm、pbst洗涤液、底物显色液和终止液。
其中，hcmv pp65322-561蛋白抗原的酶标板的制备方法是原核表达并纯化hcmv被膜磷蛋白pp65322-561；包被液稀释重组pp65322-561蛋白抗原为10µg/ml，每孔100μl加入酶标板中，37℃ 1小时，再4℃包被12~24小时；弃去孔内液体，pbst洗3次，拍干，使用含1%bsa的pbs封闭液每孔100μl， 37℃封闭2h，pbst洗3次，拍干。
pbst洗涤液的配方为：0.15m kh2po4 0.2g，na2hpo4·12h2o 2.9g，nacl 8.0g， kcl 0.2g，0.05％ tween-20 0.5ml，加蒸馏水至40ml；
底物显色液是在临用前由底物液a和底物缓冲液b各一半混合而成。底物液a主要成份是四甲基联苯胺（tmb)：tmb 20mg，无水乙醇10ml，加蒸馏水至100ml；底物缓冲液b主要成份是ph5.0的磷酸柠檬酸：0.2m na2hpo4 25.7ml，0.1m 柠檬酸24.3ml，加蒸馏水至100ml；
终止液主要成份是2m h2so4：蒸馏水178.3ml，逐滴加入98％的浓硫酸21.7ml；
封板膜为与酶标板的板面大小一致的透明塑料膜。
以上所述的hrp-抗人igm抗体选自hrp-羊抗人igg抗体、hrp-兔抗人igg抗体、hrp-鼠抗人µ链抗体中的一种，但不限于此。
实施例3
人巨细胞病毒igg抗体的检测方法，该方法采用实施例1提供的试剂。用封闭液1:400稀释的待检血清，于酶标板孔内加样，每孔100μl，37℃孵育1h后pbst洗板3次，拍干；加封闭液1:4000稀释的hrp-羊抗人igg，每孔100μl，37℃1h，pbst洗板3次；加底物显色液每孔100μl，室温显色15min；加终止液50μl，酶标仪检测od450值。
本实施例与意大利德塞公司hcmv-igg elisa试剂分别对100份样品的检测结果见下表。分别检出89例和86例阳性，阳性率分别为89%和86%。两种试剂的符合率为95%。
本实施例对hsv-ⅰ型、hsv-ⅱ型以及ebv igg阳性血清的检测结果显示od450均值分别为0.097、0.084、0.101，均小于临界值0.135，证实无交叉反应，排除了自制试剂非特异结合疱疹病毒科其他病毒抗体的可能。用pp65 mcab对pp65322-561蛋白片段western blot的鉴定结果也说明自制试剂具有良好的特异性。
本实施例批内变异系数介于2.1%～5.1%，批间变异系数介于3.4%～6.4%，均小于10%，说明检测体系稳定，稳定性和可重复性良好。
实施例4
人巨细胞病毒igm抗体的检测方法，该方法采用实施例2提供的试剂。将igg-rf吸附剂与待测血清1:1混匀，室温放置30 min；1:200稀释经吸附剂处理过的待测血清，于酶标板孔内加样，每孔100μl，37℃孵育1h后pbst洗板3次，拍干；加封闭液1:2000稀释的hrp-羊抗人igm每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物显色液每孔100μl，室温显色15min；加终止液每孔50μl，酶标仪检测od450值。
在血清样品测定前，须加入igg-rf吸附剂以消除igg、rf干扰。本发明实验探明将igg-rf吸附剂与待测血清1:1混匀，室温放置30 min可去除干扰。另外，利用β-巯基乙醇解聚igm多聚体结构的功能，将等量0.2 mol/l的β-巯基乙醇37 ℃处理待测样品1 h，发现5份hcmv igm抗体阳性血清检测结果全部转为阴性，而1份仅hcvm igg抗体阳性的血清无变化，说明本发明所测抗体为igm。
本实施例对hsv-ⅰ型、ebv igm阳性血清的检测结果显示od450均小于临界值0.179，证实本发明与hsv-1型、ebv igm均无交叉反应，特异性良好。
精密度分析结果显示：批内变异系数为5.3%～8.3%，批间重复性试验的变异系数为2.3%～7.9%，均小于10%，说明检测体系稳定，有较好的可重复性。
本实施例与意大利德塞公司hcmv-igm elisa试剂分别对100份临床疑似hcmv感染血清的检测结果见下表。分别检出58例和51例阳性，阳性率分别为58%和51%，本实施例敏感性高于德赛公司试剂。两种试剂的符合率为81%。
实施例5
人巨细胞病毒igg抗体的检测方法，该方法采用实施例1提供的试剂。用封闭液1:400稀释的待检血清，于酶标板孔内加样，每孔100μl，37℃孵育1h后pbst洗板3次，拍干；加封闭液1:4000稀释的hrp-兔抗人igg，每孔100μl，37℃1h，pbst洗板3次；加底物显色液每孔100μl，室温显色15min；加终止液50μl，酶标仪检测od450值。
实施例6
人巨细胞病毒igm抗体的检测方法，该方法采用实施例2提供的试剂。将igg-rf吸附剂与待测血清1:1混匀，室温放置30 min；1:200稀释经吸附剂处理过的待测血清，于酶标板孔内加样，每孔100μl，37℃孵育1h后pbst洗板3次，拍干；加封闭液1:2000稀释的hrp-兔抗人igm每孔100μl，37℃孵育1h，洗板3次；加底物显色液每孔100μl，室温显色15min；加终止液每孔50μl，酶标仪检测od450值。
同上检测方法，加hrp-鼠抗人γ链抗体检测人巨细胞病毒igg抗体，加hrp-鼠抗人µ链抗体检测人巨细胞病毒igm抗体。本发明要求保护的范围不限于以上具体实施方式，对于本领域技术人员而言，本发明可以有多种变形和更改，凡在本发明的构思与原则之内所作的任何修改、改进和等同替换都应包含在本发明的保护范围之内。