专利名称：用于诊断和治疗卵巢癌的基于microrna 的方法和组合物的制作方法
用于诊断和治疗卵巢癌的基于microrna的方法和组合物发明人david ε· cohn, kimberly ε. resnick, hansjuerg alder, carlo μ. croce交叉引用相关申请本申请要求2008年12月28日提交的美国临时申请案61/120，123的权益，其全部公开内容明确地通过引用合并入本文。关于联邦政府支助的研究的声明本发明是在无政府支助的情况下进行的，因此政府在本发明中不具有权利。本发明的技术领域和工业适用性本发明总地说来涉及分子生物学领域。本发明的某些方面包括在卵巢癌相关病症的诊断、治疗和预后中的应用。背景不承认本部分中公开的背景技术在法律上构成现有技术。在2008年，预期20，180个妇女被诊断为患有卵巢癌并且15，310个将死于该疾病 [1]。卵巢癌是其中只有20%的患者被诊断为患有i期疾病的毁灭性疾病[2]。与卵巢相关的不良预后是多因素导致的缺乏最低限度地侵袭性早期检测测试，微妙的症状发展和肿瘤的化学抗性。即使出现了化学抗性测定，仍然难以预测药物抗性并且只有10-15%的患者将在初步细胞毒性疗法后保持缓解期延长。虽然已广泛实行每年一次的骨盆检查，但其缺乏用作卵巢癌的筛查策略所需的灵敏度[3]。处于患卵巢癌的高风险中的妇女通常可利用经阴道超声和血清ca-125进行筛查。然而，ca-125仍然是用于早期疾病的较差标志物，具有40%的记录的灵敏度w，5]。此外，已显示即使在高风险的经筛查的群体中，新发病例(incident case)仍然更可能是晚期 [6]0可帮助确定治疗计划和预测化疗结果的生物标志物(biomarker)的鉴定在该患者群体中是高度期望的。存在关于microrna在各种病理状况中的作用的新出现的研究，所述病理状况包括实体恶性肿瘤和恶性血液病。microrna(mirna)是小的22-25个核苷酸的非编码rna序列。此类序列通过在靶向3' utr后对信使rna转录物的翻译抑制或降解来控制基因表达。 利用漂亮新小杆线虫(caenorhabditis elegans)的早期研究显示，大量的此类序列在所有物种中是高度保守的，这证明mirna在细胞分化、增殖和细胞周期控制中起重要作用[7]。 现已公认，mirna在恶性肿瘤中频繁地失调。表达不足的mirna例如肺癌中的let_7和白血病中的mir-15/16是分别抑制ras和bcl2的肿瘤抑制基因[8，9]。过表达的mirna例如 mir-21和簇mir-17-92是分别靶向实体恶性肿瘤和恶性血液病中的肿瘤抑制基因pten和 e2f1的癌基因(oncomirs) [10，11]。虽然妇科恶性肿瘤的mirna研究处于初级阶段，但最近已公布了卵巢癌的mirna特征谱[12-14]。最近已揭示循环rna在良性和恶性状况中的诊断和预后效用。胎盘相关循环 mirna与妊娠进展(pregnancy progression)相关[15]。在恶性状态中，已显示肾细胞癌患者的循环mrna[16]以及来自患有弥漫性大b细胞淋巴瘤的患者的血清的mirna[17]稳定并且高效地预测恶性肿瘤以及存活。最近已显示，卵巢癌患者的循环肿瘤外来体(exosome)的mirna特征显示与原发性肿瘤的mirna表达的高度关联性[18]。卵巢癌仍然是高度期望具有针对其的改进的非侵袭性血清筛查测试的疾病。尽管对治疗此类疾病的疗法进行了相当多的研究，但它们仍然难以有效地诊断和治疗，并且在患者中观察到的死亡率表明，卵巢癌的诊断、治疗和预防需要改进。概述在第一广泛的方面，本文中提供了方法，其诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生卵巢相关病症的风险中，确定患卵巢相关病症的受试者的预后和/或治疗患有卵巢相关病症的受试者的卵巢相关病症，其包括测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中的生物标志物的水平的改变表示受试者患有所述病症，或处于发生所述病症的风险中。在某些实施方案中，所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，测试样品中生物标志物的水平高于对照样品中相应生物标志物的水平。在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为 mir-2u mir92, mir-93, mir-126和mirj9a或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为 mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，测试样品中所述至少一种生物标志物的水平低于对照样品中相应生物标志物的水平。在某些实施方案中，生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了筛选受试者的卵巢癌的一种或多种生物标志物的方法，其包括获得受试者的血清样品，进行定量实时聚合酶链式反应(rt-pcr)，以及定量在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的一种或多种生物标志物，其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，样品包括血液样品。在某些实施方案中，样品包括血清或血浆血液样品中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢癌的方法生物标志物，其包括在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的至少一种生物标志物，其中所述生物标志物选自mir-21、 mir92,mir-93,mir-126,mir-29a,mir-155,mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢肿瘤的独特的microrna表达特征，其包括调节肿瘤microrna加工的一种或多种生物标志物的表达的改变，其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir_29a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于影响有些需要的受试者的卵巢中靶mrna 的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a, mir-155, mir-127和mir_99b或其功能变体的一种或多种microrna失调。
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在某些实施方案中，所述方法还包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。在某些实施方案中，所述方法包括改变mir-21、mir_92、mir_93、mir-126和 mir-129a中的一种或多种的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。在另一个广泛的方面，本文中提供了 microrna和/或编码蛋白质的rna的大规模基因表达表征用于鉴定人卵巢肿瘤中发生的microrna功能的改变的用途。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于筛查有此需要的受试者的卵巢的方法， 其包括对受试者的血清样品进行实时聚合酶链式反应(rt-pcr)的步骤。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括如下的一种或多种被上调的mir-21、mir92、mir-93、mir-126和mir_29a或其功能变体；和被下调的mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括 mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，所述生物标志物包括卵巢肿瘤中的在卵巢肿瘤中增加的宿主基因表达。在某些实施方案中，所述生物标志物包括mir-21、mir92、mir-93、mir_u6和 mir-29a或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了 mir-21、mir92和/或mir_93，或其功能变体的用途，其用作卵巢癌细胞中的至少一个基因的靶和/或用于抑制此类基因的蛋白质表达。在另一个广泛的方面，本文中提供了调节卵巢癌细胞表达的一种或多种基因的方法，其包括改变mir-21、mir92和/或mir-93在卵巢癌细胞中的表达的步骤。在另一个广泛的方面，本文中提供了将microrna与3' utr序列结合以导致哺乳动物卵巢癌细胞中被靶向的mrna的降解和/或积累的用途。在另一个广泛的方面，本文中提供了人组织中microrna与mrna之间的负相关和 /或正相关用于预测卵巢癌的microrna靶基因的用途。在另一个广泛的方面，本文中提供了 mir-表达抑制剂，其包含mir-21、mir92、 mir-93, mir-126和mir49a或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了包含mir-21、mir92和/或mir-93或其功能变体中的一种或多种的hlir-表达抑制剂。在另一个广泛的方面，本文中提供了包含mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的hlir-表达反义抑制剂。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢病症或疾病的oncomir生物标志物，其包括 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了卵巢病症或疾病的oncomir生物标志物，其包括mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节卵巢癌细胞中蛋白质表达的方法，
10其包括调节 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节卵巢癌细胞中蛋白质表达的方法， 其包括调节mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir49a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir_29a、mir-155、 mir-127和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于确定患有卵巢癌的受试者的预后的方法，其包括测量受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种，并且其中i)所述生物标志物与卵巢癌的不利预后相关；以及ii)相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中至少一种生物标志物的水平的改变表示不利的预后。在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断受试者是否患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中的方法，其包括从获自受试者的血清测试样品逆转录rna以提供一组靶寡脱氧核苷酸；将所述靶寡脱氧核苷酸与包含mirna特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；以及将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一种mirna的信号的改变表示受试者患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中。在某些实施方案中，至少一种mirna的信号相对于从对照样品产生的信号被下调，和/或其中至少一种mirna的信号相对于从对照样品产生的信号被上调。在某些实施方案中，至少一种生物标志物mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a,mir-155,mir-127和mir_99b或其功能变体的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的卵巢癌或处于发生该疾病的风险中。在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗患有卵巢癌的受试者的卵巢癌的方法， 其中相对于对照细胞，至少一种生物标志物在受试者的癌细胞中被下调或上调，其包括当至少一种生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；或当至少一种生物标志物在癌细胞中被上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗受试者的卵巢癌的方法，其包括测定相对于对照细胞，卵巢癌细胞中至少一种生物标志物的量；和通过如下步骤改变卵巢癌细胞中表达的生物标志物的量如果癌细胞中表达的生物标志物的量少于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物；或者如果癌细胞中表达的生物标志物的量多于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物；其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含至少一种分离的生物标志物和药学上可接受的载体，其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、 mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。 在某些实施方案中，所述生物标志物相应于相对于对照细胞在卵巢癌细胞中被上调的生物标志物。在某些实施方案中，药物组合物包含至少一种mir表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量与卵巢癌细胞中增加的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的降低表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂； 并且其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量与卵巢癌细胞中下降的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平， 其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且其中所述生物标志物选自mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了评估疗法预防、诊断和/或治疗卵巢癌相关疾病的功效的方法，其包括使动物经历其功效有待评估的疗法，然后通过评估至少一种生物标志物来测定待测试的疗法在治疗或预防疾病中的功效的水平，所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，候选治疗剂包括如下的一种或多种药物组合物、营养食品组合物和顺势疗法组合物。 在某些实施方案中，待评估的疗法是用于人受试者的。在另一个广泛的方面，本文中提供了制品，其包含至少一种结合卵巢癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、 mir92, mir-93, mir-126, mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于筛选治疗卵巢癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种生物标志物的一种或多种试剂，所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种，和表达至少一种生物标志物的细胞。在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一种生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述生物标志物的存在。在另一个广泛的方面，本文中提供了干扰卵巢癌相关疾病应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、 mir-126, mir-29a, mir-155, mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性的方法，其包括给个体施用干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、 mir-93, mir-126, mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、 mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在另一个广泛的方面，本文中提供了包含mir-21、mir-92和mir-93中的一种或多种的抑制剂的组合物。在另一个广泛的方面，本文中提供了治疗有此需要的受试者的卵巢病症的方法， 其包括给受试者施用治疗有效量的所述组合物。在某些实施方案中，预防性施用所述组合物。在某些实施方案中，所述组合物的施用延迟病症的一种或多种症状的发作。在某些实施方案中，肽的施用抑制卵巢癌的发展。在某些实施方案中，肽的施用抑制肿瘤生长。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于检测卵巢癌在生物学样品中的存在的方法，所述方法包括将怀疑包含卵巢癌的生物学样品暴露于用于此的标志物；然后检测所述标志物(如果有的话)在样品中的存在或不存在；其中所述生物标志物选自mir-21、 mir92,mir-93,mir-126, mir-29a, mir-155, mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。在某些实施方案中，所述标志物包括可检测的标记。在某些实施方案中，所述方法还包括将受试者的生物学样品中标志物的量与正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比较。在某些实施方案中，所述方法还包括在不同的时间点从受试者收集多个生物学样品并且比较每一个生物学样品中标志物的量以确定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括mir-21、 mir92, mir-93, mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种的抑制剂。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括 mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的反义抑制剂。在另一个广泛的方面，本文中提供了制造用于治疗卵巢癌的药物的用途，包含选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir-99b 或其功能变体中的一种或多种的核酸分子。在某些实施方案中，药物包含显示选自mir-21、mir92、mir-93、 mir-126,mir-29a,mir-155,mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的序列的核
酸分子。在另一个广泛的方面，本文中提供了鉴定诱导卵巢癌细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，所述方法包括如下阶段i)培养来源于卵巢肿瘤的细胞，ii)向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析阶段(i)与(ii)之间至少一种mir的表达水平的变化，和iv)鉴定诱导阶段(i)与(ii)之间的mir表达水平的变化的化合物或化合物的组合。在某些实施方案中，阶段(iii)包括分析至少一种mir的表达水平。在某些实施方案中，阶段(iv)包括鉴定调节至少一种mir的表达水平的化合物或化合物的组合。 在某些实施方案中，阶段(iv)包括鉴定降低至少一种mir的表达水平的化合物或化合物的组合。在某些实施方案中，所述化合物是用于治疗癌症的治疗剂。在另一个广泛的方面，本文中提供了用于分类受试者的卵巢组织的方法，其包括 测量测试细胞群体中 mir 之中 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种的表达，其中测试细胞群体中至少一种细胞能够表达 mir 之中 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种；将mir的表达与参照细胞群体中mir的表达相比较，所述参照细胞群体包含至少一种对于其的卵巢癌分类是已知的细胞；以及鉴定测试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种mir的表达水平的差异(如果存在的话)，从而分类受试者的卵巢癌。在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中表达的差异表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。在某些实施方案中，与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中相似的表达模式表示测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。在某些实施方案中，参照细胞群体是多个细胞或数据库。在某些实施方案中，参照细胞群体选自分类为来自正常卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体。当根据附图进行阅读时，根据下列优选实施方案的详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员将变得显然。附图概述本专利或申请文件包含至少一个以彩色制成的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由专利局提供。
图1 公布的mirna特征谱与来自卵巢癌患者血清的差异表达的mirna的比较。图2 患者与对照血清之间差异表达的mirna的中位倍数变化差异。发明详述在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用合并入本文以更全面地描述本发明涉及的现有技术。
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在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于特定制剂或过程参数，因为这些当然可以变化。还应理解，本文中所使用的术语仅为了描述本发明的特定实施方案，而不意欲是限定性的。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的许多方法和材料可用于实践本发明，但优选的材料和方法描述于下文中。microrna是调节编码蛋白质的基因的表达的小的非编码rna。microrna表达随卵巢癌的发展和进展而开始改变。此类microrna中的一些调节卵巢癌细胞中癌症相关基因的表达。如在本文中可互换使用的，“mir基因产物”、“micr0rna”、“mir”或“mirna”是指来自mir基因的未加工的或经加工的rna转录物。如本文中所使用的，“生物标志物”可包括“mir基因产物”、“microrna"、“ mir"或‘‘mirna”或编码蛋白质的rna中的一种或多种。有活性的19-25个核苷酸的rna分子可通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶例如分离的dicer、 argonaut或rna酶iii)从mir前体获得。要理解，还可通过生物或化学合成直接产生有活性的19-25个核苷酸的rna分子，而不必从mir前体加工获得。当在本文中通过名称提及 microrna时，除非另外指出，否则名称相应于前体和成熟形式。本发明包括诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生该病症的风险中的方法。如本文中所使用的，“受试者”可以是患有或怀疑患有卵巢癌的任意哺乳动物。我们提供了关于下列的描述从卵巢癌患者的血清提取mirna，患者与健康对照之间许多此类mirna的差异表达，以及新型实时pcr微阵列检测方法。在下列实施例中进一步阐释本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，虽然这些实施例表示本发明的优选实施方案，但它们仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离本发明的精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进，以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。实施例i方法在获得the ohio state university college of medicine 的伦理审查委员会 (institutional review boards)的批准后，我们分析来自观个具有新近确诊的卵巢癌的患者和15个正常对照的血清样品。在确定的手术治疗和/或辅助疗法之前，在最初会诊时收集这些血清样品。获得血清作为前瞻性组织和血清获得研究(procurement study)的一部分，并且将其贮存于_80°c下。从志愿充当对照的15个健康妇女获得新鲜血清。解冻冷冻的血清，同时从患者和对照群体提取rna。没有一个健康对照之前被诊断为患有恶性肿瘤。如制造商所说明的，使用 itri-reagent bd (molecular research center, inc., cincinnati, oh)从 250 μ 1 血清提取 rna。利用 thermoscientific nanodroplooo (thermo fisher scientific，he.，waltham，ma)评估 rna质量。利用 itaciman array human microrna panel (v. !,applied biosystems,foster city，ca)，使用 50ng rna/端口(总共400ng)，用
15来自4个对照和9个癌症患者的rna进行microrna表达表征。该阵列包含365个mirna靶以及内源对照。利用小核rna (snrna) u44和u48进行标准化。此类snrna是适合在taqman 测定中用作标准化物的稳定表达的参照基因。除了在微阵列板(microarray panel)上鉴定差异表达的mirna外，第二目的是鉴定在缺乏关于受试者的公开数据的情况下可用作标准化物的mirna。凭经验从表达特征谱选择21个mirna，用于对照和患者血清(11个对照和19个患者)的进一步检查。基于对照与患者之间4个循环或更多循环的表观ct差异选择此类mirna。鉴于在全部患者和对照样品之间的一致表达，两种mirna(142-3p和16)被鉴定为潜在的标准化物。对于目的mirna， 使用单管taqman microrna测定。全部试剂、引物和探针获自applied biosystems (applied biosystems, foster city，ca)。将 ing rna/样品用于测定。mirna_142_3p 用作标准化物。在geneamp pcr 9700热循环仪(applied biosystems)中进行全部rt反应，包括无模板(无cdna)对照和负对照(无逆转录酶)。使用abi prism7900ht kquence检测系统 (applied biosystems)定量基因表达水平。以一式三份进行比较实时pcr，包括无模板对照。利用比较ct.法计算 microrna 的表达。利用 stata v. 10 (college station, tx) 进行统计分析。使用曼-怀二氏检验(marm-whitney test)比较表达。p值大于0. 05被认为是统计学上显著的。结果本研究包括观个患上皮卵巢癌的患者。分期细目(stage breakdown)如下i 期-8 08.5% )、11 期-2(7. 1% ),111 期 _8 5% )、iv 期-10 (35. 7% )。组织学细目如下血清(60%)、透明细胞01.2%)、子宫内膜样(12%)、粘蛋白(6%)。年龄中位数为 57岁(年龄范围34-79)。与大多数患有卵巢癌的组相似，大部分(66%)具有iii期或iv 期疾病，并且主要(60% )是血清组织学。使用微阵列的初步mirna表达表征鉴定了 23种目的mirna (包括2种标准化物)。 我们产生了维恩图以将来自我们的初始测试组的23种目的mirna与已知的mirna特征谱相比较。在所述组中存在10种目的mirna，其与已在文献公开的、作为卵巢癌mirna特征的一部分的mirna相同(图1)。在继续进行21种mirna的定量rt-pcr后，与对照相比较，卵巢癌患者的血清中 5 禾中 mirna 过表达(mirna-21、29a、92、93 和 126，ρ = · 0002、ρ = · 003、ρ = · 0001、ρ =· 0003,ρ = · 007)以及 3 种 mirna 表达不足(mir-127、155 和 99b，ρ = · oooup = · 0003、 p = . 0001)。患者相对于对照的mirna中位表达的倍数差异示于图2中。3个患者被鉴定为手术前ca-125 < 35u/ml。然后我们检查具有最高血清表达的三种mirna，mir-21、92和93在具有正常ca-125的患者中的表达模式，以确定mirna模式是否模拟ca-125模式。当将患者群体中的中位表达与对照相比较时，发现这三种mirna在这些患者中显著过表达(表1)。
1权利要求
1.诊断受试者是否患有卵巢相关病症或处于发生所述病症的风险中，确定患卵巢相关病症的受试者的预后和/或治疗患卵巢相关病症的受试者的卵巢相关病症的方法，其包括，测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照样品中相应生物标志物的水平，所述测试样品中生物标志物的水平的改变表示受试者患有卵巢相关病症，或处于发生所述病症的风险中。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
3.权利要求1的方法，其中测试样品中至少一种生物标志物的水平高于对照样品中相应生物标志物的水平。
4.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为mir-21、mir92、mir-93、mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种。
5.权利要求3的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。
6.权利要求1的方法，其中测试样品中至少一种生物标志物的水平低于对照样品中相应生物标志物的水平。
7.权利要求5的方法，其中所述至少一种生物标志物在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达，并且为mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
8.筛选受试者的卵巢癌的一种或多种生物标志物的方法，其包括获得受试者的血清样品，进行定量实时聚合酶链式反应(rt-pcr)，以及定量在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的一种或更多种的生物标志物，其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir_29a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
9.权利要求1的方法，其中所述样品包括血液样品。
10.权利要求10的方法，其中所述样品包括血清或血浆血液样品中的一种或多种。
11.卵巢癌的生物标志物，其包括在肿瘤组织与非肿瘤组织之间差异表达的至少一种生物标志物，其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a、mir-155、 mir-127和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
12.卵巢肿瘤的独特的microrna表达特征，其包括调节肿瘤microrna加工的一种或多种生物标志物的表达的改变，其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a、mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
13.用于影响有此需要的受试者的卵巢中靶mrna的转录物丰度和/或蛋白质表达的方法，其包括使选自下列的一种或多种microrna失调mir_21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a、mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
14.前述权利要求的方法，其包括抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
15.前述权利要求的方法，其包括改变mir-21、mir-92、mir-93、mir-126和mir_129a 中的一种或多种的表达以抑制癌症相关基因的蛋白质表达。
16.microrna和/或编码蛋白质的rna的大规模基因表达表征用以鉴定人卵巢肿瘤中发生的microrna功能的改变的用途。
17.用于筛查有此需要的受试者的卵巢的方法，其包括对受试者的血清样品进行实时聚合酶链式反应(rt-pcr)的步骤。
18.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括:mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a、mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
19.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括如下的一种或多种被上调的mir-21、 mir92、mir-93、mir-126 和 mir_29a 或其功能变体；和被下调的 mir-155、mir-127 和 mir-99b或其功能变体。
20.卵巢相关病症的肿瘤基因特征，其包括mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。
21.权利要求1的方法，其中所述生物标志物包括卵巢肿瘤中的宿主基因表达，所述宿主基因表达在卵巢肿瘤中增加。
22.前述权利要求的方法，其中所述生物标志物包括mir-21、mir92、mir-93、mir-126 和mir-29a或其功能变体中的一种或多种。
23.mir-21、mir92和/或mir-93或其功能变体的用途，其用作卵巢癌细胞中的至少一个基因的靶和/或用于抑制所述基因的蛋白质表达。
24.调节由卵巢癌细胞表达的一种或多种基因的方法，其包括改变mir-21、mir92和/ 或mir-93在卵巢癌细胞中的表达的步骤。
25.将microrna与3'utr序列结合以导致哺乳动物卵巢癌细胞中被靶向的mrna的降解和/或积累的用途。
26.人组织中microrna与mrna之间的负相关和/或正相关用于预测卵巢癌的 microrna靶基因的用途。
27.包含mir-21、mir92、mir-93、mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种的 mir-表达抑制剂。
28.包含mir-21、mir92和/或mir-93或其功能变体中的一种或多种的mir-表达抑制剂。
29.包含mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的mir-表达反义抑制剂。
30.卵巢病症或疾病的oncomir生物标志物，其包括mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a、mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
31.卵巢病症或疾病的oncomir生物标志物，其包括mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。
32.用于调节卵巢癌细胞中的蛋白质表达的方法，其包括调节mir-21、mir92、mir-93、 mir-126,mir-29a,mir-155,mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
33.用于调节卵巢癌细胞中的蛋白质表达的方法，其包括调节mir-21、mir92和mir-93 或其功能变体中的一种或多种在卵巢癌细胞中的表达。
34.用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
35.用于抑制卵巢癌细胞中一个或多个基因的表达的组合物，所述组合物包含 mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。
36.用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
37.用于调节患有卵巢癌的受试者中一种或多种蛋白质水平的方法，其包括使用 mir-21、mir92和mir-93或其功能变体中的一种或多种。
38.用于确定患有卵巢癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自受试者的血清测试样品中至少一种生物标志物的水平，其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种，并且其中i)所述生物标志物与卵巢癌的不利预后相关；以及ii)相对于对照样品中相应生物标志物的水平，测试样品中至少一种生物标志物的水平的改变表示不利的预后。
39.诊断受试者是否患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中的方法，其包括a)从获自受试者的血清测试样品逆转录rna以提供一组靶寡脱氧核苷酸；b)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含mirna特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；以及c)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一种 mirna的信号的改变表示受试者患有卵巢癌或处于发生卵巢癌的风险中。
40.前述权利要求的方法，其中至少一种mirna的信号相对于从对照样品产生的信号被下调，和/或其中至少一种mirna的信号相对于从对照样品产生的信号被上调。
41.前述权利要求的方法，其中至少一种生物标志物mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a,mir-155,mir-127和mir_99b或其功能变体的信号的改变表示受试者患有具有不利预后的卵巢癌或处于发生该疾病的风险中。
42.治疗患有卵巢癌的受试者的卵巢癌的方法，其中至少一种生物标志物在受试者的癌细胞中相对于对照细胞被下调或上调，所述方法包括a)当所述至少一种生物标志物在癌细胞中下调时，给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物，或其分离的变体或生物学活性片段，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖； 或b)当所述至少一种生物标志物在癌细胞中上调时，给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物，以便在受试者中抑制癌细胞的增殖；其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
43.治疗受试者的卵巢癌的方法，其包括a)测定相对于对照细胞，卵巢癌细胞中至少一种生物标志物的量；和b)通过如下步骤改变卵巢癌细胞中表达的生物标志物的量(i)如果癌细胞中表达的生物标志物的量少于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种分离的生物标志物；或者(ii)如果癌细胞中表达的生物标志物的量多于对照细胞中表达的生物标志物的量，那么给受试者施用有效量的至少一种抑制至少一种生物标志物的表达的化合物；其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
44.用于治疗卵巢癌的药物组合物，其包含至少一种分离的生物标志物和药学上可接受的载体，其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、 mir-127和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
45.前述权利要求的药物组合物，其中所述至少一种分离的生物标志物相应于与对照细胞相比在卵巢癌细胞中被上调的生物标志物。
46.前述权利要求的药物组合物，其包含至少一种mir表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。
47.鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂和测量卵巢癌细胞中与增加的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的降低表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且其中所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种。
48.鉴定抗卵巢癌试剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂并且测量卵巢癌细胞中与下降的表达水平关联的至少一种生物标志物的水平，其中相对于对照细胞，细胞中生物标志物的水平的增加表示所述测试试剂是抗卵巢癌试剂；并且其中所述生物标志物选自mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
49.评估疗法预防、诊断和/或治疗卵巢癌相关疾病的功效的方法，其包括a)使动物经历其功效有待评估的疗法，然后b)通过评估至少一种生物标志物来测定被测试的疗法在治疗或预防疾病中的功效的水平，所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
50.前述权利要求的方法，其中候选治疗剂包括如下的一种或多种药物组合物、营养食品组合物和顺势疗法组合物。
51.前述权利要求的方法，其中所述被评估的疗法是用于人受试者的。
52.一种制品，其包含至少一种结合卵巢癌相关疾病的标志物的捕获试剂，所述标志物包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、 mir-29a, mir-155, mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种。
53.用于筛选治疗卵巢癌相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包括至少一种生物标志物的一种或多种试剂和表达至少一种生物标志物的细胞，所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
54.前述权利要求的试剂盒，其中使用包含特异性结合至少一种生物标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述生物标志物的存在。
55.干扰卵巢癌相关疾病的应答信号转导途径的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
56.治疗、预防、逆转或限制有此需要的个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性的方法，其包括给个体施用干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂，其中所述试剂包括至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、 mir-126, mir-29a, mir-155, mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种。
57.干扰至少卵巢癌相关疾病应答级联的试剂用于制造药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体的卵巢癌相关疾病并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种生物标志物，所述生物标志物选自mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、 mir-127和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
58.包含mir-21、mir-92和mir-93中的一种或多种的抑制剂的组合物。
59.治疗有此需要的受试者的卵巢病症的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的前述权利要求的组合物。
60.前述权利要求的方法，其中预防性施用所述组合物。
61.前述权利要求的方法，其中所述组合物的施用延迟病症的一种或多种症状的发作。
62.前述权利要求的方法，其中肽的施用抑制卵巢癌的发展。
63.前述权利要求的方法，其中肽的施用抑制肿瘤生长。
64.用于检测卵巢癌在生物学样品中的存在的方法，所述方法包括a)将怀疑包含卵巢癌的生物学样品暴露于用于此的标志物；以及b)如果有的话，检测所述标志物在样品中的存在或不存在；其中所述生物标志物选自 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127 和mir-99b或其功能变体中的一种或多种。
65.前述权利要求的方法，其中所述标志物包括可检测的标记。
66.前述权利要求的方法，其还包括将受试者的生物学样品中标志物的量与正常受试者的相应生物学样品中标志物的量相比较。
67.前述权利要求的方法，其还包括在不同的时间点从受试者收集多个生物学样品并且比较每一个生物学样品中标志物的量，以测定标志物的量在一段时间内在受试者中是增加还是减少。
68.用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括mir-2u mir92, mir-93, mir-126和mir_29a或其功能变体中的一种或多种的抑制剂。
69.用于治疗受试者的卵巢癌的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的卵巢受体激动剂，所述激动剂包括mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的反义抑制剂。
70.制造用于治疗卵巢癌的药物的用途，包含选自mir中的mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir-29a, mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种的核酸分子。
71.前述权利要求的用途，其中所述药物包含显示选自mir中的mir-21、mir92、 mir-93,mir-126,mir-29a,mir-155、mir-127 和 mir_99b 或其功能变体中的一种或多种的序列的核酸分子。
72.鉴定诱导卵巢癌细胞分化的有效治疗剂或治疗剂的组合的体外方法，所述方法包括如下阶段i)培养来源于卵巢肿瘤的细胞， )向细胞系的培养基中加入至少一种化合物，iii)分析阶段(i)与(ii)之间至少一种mir的表达水平的变化，和iv)鉴定诱导阶段(i)与(ii)之间所述mir的表达水平的变化的化合物或化合物的组 合
73.前述权利要求的方法，其中阶段(iii)包括分析至少一种mir的表达水平。
74.前述权利要求的方法，其中阶段(iv)包括鉴定调节至少一种mir的表达水平的化合物或化合物的组合。
75.前述权利要求的方法，其中阶段(iv)包括鉴定降低至少一种mir的表达水平的化合物或化合物的组合。
76.前述权利要求的方法，其中所述化合物是用于治疗癌症的治疗剂。
77.用于分类受试者的卵巢组织的方法，其包括a)测量mir 中的 mir-21、mir92、mir-93、mir-126、mir_29a、mir-155、mir-127 和 mir-99b或其功能变体中的一种或多种在测试细胞群体中的表达，其中测试细胞群体中至少一种细胞能够表达mir中的mir-21、mir92、mir-93、 mir-126、mirj9a、mir-155、mir-127和mir_99b或其功能变体中的一种或多种；b)将mir的表达与参照细胞群体中mir的表达相比较，所述参照细胞群体包含至少一种其卵巢癌分类是已知的细胞；以及c)如果存在的话，鉴定测试细胞群体与参照细胞群体中一种或多种mir的表达水平的差异，从而分类受试者的卵巢癌。
78.权利要求77的方法，其中与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中表达的差异表示，测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞不同的分类。
79.权利要求77的方法，其中与参照细胞群体相比较，测试细胞群体中相似的表达模式表示，测试细胞群体具有与来自参照细胞群体的细胞相同的分类。
80.权利要求77的方法，其中所述参照细胞群体是多个细胞或数据库。
81.权利要求80的方法，其中所述参照细胞群体选自分类为来自正常卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体、分类为来自良性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体和分类为来自恶性卵巢组织的细胞群体的参照细胞群体。
全文摘要
公开了用于诊断、预后和/或治疗卵巢癌的方法和组合物。
文档编号c12q1/68gk102292456sq200980155340
公开日2011年12月21日 申请日期2009年3月25日 优先权日2008年12月5日
发明者c·m·克罗斯, d·e·科恩, h·阿德尔, k·瑞斯尼克 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会