用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于预测卵巢癌的存在、亚型和分期的方法，以及用于评估癌症治疗的治疗效力和确定对象是否潜在地正在发生癌症的方法。本发明还提供了相关的测试试剂盒、计算机和分析系统以及软件和诊断模型。
【专利说明】用于卵巢癌的生物标志物组、诊断方法和测试试剂盒
[0001]相关申请
[0002]本申请要求在2011年2月24日提交的美国临时申请序列号61/463，870的利益，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]政府支持的声明
[0004]本申请的主题包括得到美国国家癌症研究所名为“improvement of a promisingmap for ovarian cancer，，的 sbir award n0.hhsn261200800045c 支持的工作。
【技术领域】
[0005]本发明提供了用于预测和诊断卵巢癌特别是上皮性卵巢癌的方法，并且还提供了相关的分析试剂、诊断模型、测试试剂盒和临床报告。
【背景技术】
[0006]美国癌症学会估计，美国在2007年卵巢癌侵袭了 22，430名女性并且夺去了15，280名女性的性命。然而，卵巢癌并不是单一疾病，实际上有多于30种类型和亚型的卵巢恶性肿瘤，每一种具有其自己的病理学和临床行为。因此，大多数专家根据形成它们的细胞种类将卵巢癌分为主要的三类:由沿着或覆盖卵巢的细胞产生的上皮性肿瘤；来源于卵巢中将会形成卵子的细胞的生殖细胞肿瘤；和由将卵巢结合在一起并产生雌性激素的结缔组织细胞(connective cell)开始的性索-间质(sex cord-stromal)细胞肿瘤。
[0007]常见的上皮性肿瘤开始于卵巢的表面上皮并且在美国占全部卵巢癌的约90%(以下的百分比反映出美国这些癌症的流行性)。它们进一步划分为多种亚型——包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、粘液性肿瘤和透明细胞肿瘤一可进一步再细分为良性或恶性肿瘤。浆液性肿瘤是卵巢癌最普遍的形式。它们占据常见上皮性肿瘤的40%。这些浆液性肿瘤有约50%是恶性的,33%是良性的，17%是交界性肿瘤(borderline malignancy)。浆液性肿瘤最经常在40至60岁的女性中发生。
[0008]子宫内膜样肿瘤占常见上皮性肿瘤的约20%。在约20%的个体中，这些癌症与子宫内膜癌(子宫内层的癌症)有关。在5%的病例中，它们还与子宫内膜异位(盆腔中子宫内膜(子宫内层组织)的异常现象)有关。这些肿瘤的大多数(约80% )是恶性的，并且其余部分(约20%)通常是交界性肿瘤。子宫内膜样肿瘤主要在50至70岁的女性中发生。
[0009]透明细胞肿瘤占常见上皮性肿瘤的约6%。几乎所有的这些肿瘤都是恶性的。所有透明细胞肿瘤中大约一半与子宫内膜异位有关。患透明细胞肿瘤的大多数患者在40至80岁。
[0010]粘液性肿瘤构成所有常见上皮性肿瘤的约1%。这些肿瘤的大多数(约80% )是良性的，15%是交界性肿瘤，仅5%是恶性的。粘液性肿瘤最经常在30至50岁的女性中出现。
[0011]迄今为止，卵巢癌是最致死的妇科癌症，占所有妇科癌症死亡的多于55%。但是，卵巢癌也是其中最好治疗的一如果其在早期被发现的话。当卵巢癌在早期被发现并进行适当治疗时，5年存活率为93%。参见例如luce等,“early diagnosis key to epithelialovarian cancer detection,，，the nurse practitioner, 2003 年 12 月第 41 页。关于卵巢癌的大量背景信息可在互联网上容易地得到，例如由美国癌症学会提供的癌症参考信息的“overview:ovarian cancer，，和 nccn clinical practice guidelines in oncology tmovarian cancer v.1.2007。
[0012]卵巢癌诊断目前的现实是大多数病例(所有卵巢癌病例的81% )未在最早期被发现。这是因为早期卵巢癌的诊断非常困难。其症状在此时可能还未出现或者注意不到。或者，症状(例如胃气胀(bloating)、消化不良、腹泻、便秘等)可能是模糊的并且与许多常见的不严重病症有关。最重要地，没有用于早期检测的有效测试。用于早期并准确检测卵巢癌的有效工具是关键的未被满足的医学需要。
[0013]妇科肿瘤学领域中迫切需要的是最小侵入性的(优选基于血清的)用于评估和预测卵巢癌存在的临床测试，其基于有力的生物标志物集合和从大且多样的样品集合鉴定的样品特征，以及在卵巢癌多个分期高度准确地预测、诊断和监测卵巢癌的方法和相关计算机系统及软件工具。
【发明内容】
[0014]本发明一般性地涉及癌症生物标志物，并且特别地涉及与卵巢癌相关的生物标志物。本发明提供了通过测量某些生物标志物来预测、评价诊断和监测癌症特别是卵巢癌的方法，并且还提供了评价与卵巢癌有关的生物标志物表达水平的试剂集合或阵列。优选的生物标志物集合提供了对象中卵巢癌的可检测分子标识。本发明提供了用于卵巢癌的预测性或诊断性测试，特别是用于上皮性卵巢癌，并且更特别地用于早期卵巢癌(即i期、ii期或i期和ii期一起)。
[0015]在一个方面中，本公开内容一般性地涉及预测对象卵巢癌状态的方法，其包括以下步骤:在得自于对象的生物流·体样品中测量ca-125和he4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平:il_2受体a (il-2ra )、a -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂ι(--μρ-ι)、il-8、il-6、血管内皮生长因子b (vegf-b)、基质金属蛋白酶7 (mmp-7)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1 ;以及使测量结果与卵巢癌状态相关联。
[0016]在另一个方面中，本公开内容涉及试剂盒，其包含一组各自与ca-125和he4以及选自下列的一种或更多种生物标志物选择性结合的亲和试剂:白细胞介素-2受体a (il-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4 (ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂i (timp-1)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1 ;以及一组各自包含ca-125和he4以及选自下列的一种或更多生物标志物的容器:白细胞介素-2受体a (il-2受体α )、α-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、υκι-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4 (ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂10?μρ-1)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (lox-1)、神经毡蛋白 1、tnfr2 和 mpif-10
[0017]在又一个方面中，本发明涉及一组纯化肽，其包含ca-125和he4以及选自下列的一种或更多生物标志物:白细胞介素-2受体a (il-2受体α )、α -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4 (ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂i (--μρ-1)、il-8、基质金属蛋白酶7 (mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1。
[0018]在本文所述公开内容的以上方面或任何其他方面之任一方面的多个实施方案中，所述方法包括测量癌抗原72-4(ca-72-4)的水平。在另一个实施方案中，卵巢癌状态是存在卵巢癌。在另一些实施方案中，卵巢癌是i期卵巢癌。在又一个实施方案中，卵巢癌是ii期卵巢癌。在再一些实施方案中，卵巢癌是iii期卵巢癌。在另一个实施方案中，卵巢癌是iv期卵巢癌。在另一些实施方案中，卵巢癌是1、i1、iii或iv期卵巢癌。在又一些实施方案中，所述方法还包括基于所述状态来安排对象的治疗。在另一个实施方案中，安排对象的治疗选自进行更多的测试、进行外科手术和不采取进一步的行动。在另一个实施方案中，所述方法包括在进行对象安排后测量得自于对象的生物流体样品中ca-125和he4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平:白细胞介素-2受体a (il-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl_40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4 (ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂i (--μρ-1)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2 (igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1 ;使测量结果与卵巢癌状态相关联；以及确定对象安排是否导致卵巢癌状态改变。在另一些实施方案中，测量选自检测生物标志物是否存在，对生物标志物的量进行定量和对生物标志物的类型进行定性。在某些实施方案中，所述生物标志物通过免疫测定来测量。在另一些实施方案中，所述关联通过软件分类算法来进行。在又一个实施方案中，样品选自血液、血清和血浆。在一些实施方案中，所述亲`和试剂是抗体。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含使用亲和试剂来测量对象样品中生物标志物水平的书面说明。在又一个实施方案中，所述试剂盒包含使用试剂盒以确定对象卵巢癌状态的书面说明。在某些实施方案中，一种或更多种所述肽具有可检测标记。
[0019]在本发明的一个优选实施方案中，提供了一种预测对象卵巢癌状态的方法，其包括以下步骤:确定来自所述对象的生物流体样品中ca-125和he4的浓度和所述对象的年龄(统称为“生物标志物”)；以及评价所述生物标志物，其中与未患卵巢癌的对照组患者相t匕，生物标志物的水平或评价的改变预示了对象患有卵巢癌。在一个更优选的实施方案中，前述方法还包括评价绝经后或非绝经后对象的对象绝经状态，以及来自所述对象的生物流体样品中ca15-3和ca72-4的浓度。
[0020]在本发明的另一些实施方案中，多种另外的生物标志物与前述生物标志物一起被评价。这些生物标志物包括:血管内皮生长因子(vegf)、白细胞介素2受体a (il-2受体α)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、触珠蛋白、铁蛋白(frtn)、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、白细胞介素8(il_8)、乳腺丝抑蛋白(maspin)、骨桥蛋白、血清淀粉样p组分(sap)、血小板源生长因子bb (pdgf-bb)和b细胞激活因子(baff)。任选地，还评价了某些另外的生物标志物:钙防卫蛋白、血管性血友病因子(vwf)、α-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、白细胞介素6(il-6)、瘦素(i印tin)、甲状腺素运载蛋白(ttr)、癌胚抗原(cea)、胰岛素样生长因子结合蛋白i(igfbp-1)和甲状腺素结合球蛋白(tbg)。
[0021]在一些优选实施方案中，所述评价通过选自以下的方法进行:逻辑斯蒂(logistic)回归、查找表、决策树、支持向量机、聚类分析、邻域分析、遗传算法、贝叶斯和非贝叶斯方法等。另外，所述样品优选地选自提取自患者的流体和组织，包括血液、血清、血浆、淋巴、脑脊液、腹水、尿和组织活检。 [0022]在另一些优选实施方案中，本发明的方法还包括提供卵巢癌预测的书面报告或电子报告的步骤，并且任选地，所述报告包括关于对象中卵巢癌存在与否或其可能性或者对象卵巢癌的等级化风险(任选地通过癌症分期)的预测。
[0023]另一些优选实施方案提供了这样的方法，其中a)当所述方法的灵敏度高于约95%时，其灵敏度和特异性总和大于约150%;或b)当所述方法的特异性高于约95%时，其灵敏度和特异性总和大于约170% ;以及c)通过分析包含至少约50个癌症样品和150个良性样品的样品集合来支持灵敏度和特异性的前述总和。
[0024]提供试剂集合、测试试剂盒以及多分析物(multianalyte)和elisa组和试剂盒来完成前述方法。
[0025]用于本发明方法的另一些生物标志物包括以下物质，其可确定为以上所附权利要求i至4所述方法中一种或更多种另外的标志物:前列腺酸性磷酸酶(pap)、表皮生长因子受体(egfr)、组织蛋白酶d、ykl-40、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、血管内皮生长因子d (vegf-d)、金属蛋白酶组织抑制剂i (--μρ-1)、间皮素(msln)、分拣蛋白、细胞纤连蛋白(cfib)、护骨蛋白(opg)、en-rage, cd40抗原(cd40)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经租蛋白1、胎球蛋白a、抵抗素、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、过氧化物氧还蛋白4 (prx-1v)、磷酸丝氨酸氨基转移酶(psat)、α-l-微球蛋白(almicio)、肝素结合egf样生长因子(hb-egf)、肝细胞生长因子(hgf)、三叶因子3(tff3)、补体因子h、丛生蛋白(clu)、醛糖还原酶、巨噬细胞迁移抑制因子(mif)、双调蛋白(ar)、巨噬细胞炎症蛋白ια (mip_1 a )、faslg受体(fas)、血管内皮生长因子受体i (vegfr-1)、基质金属蛋白酶i (mmp-1)、单核细胞趋化蛋白2 (mcp-2)和血管内皮生长因子b (vegf-b)。
[0026]在本发明的又一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物中的任三种或更多种:he4、ca-125、il-2 受体 a、aat、crp、ykl-40、纤连蛋白和 ca-72-4?
[0027]在本发明的另一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物(任选地包括he4)的水平，在一些情况下确定年龄:ca-125、ca72-4、vegf-b、乳腺丝抑蛋白、vegf-d和ykl-40 ;ca-125、ca72-4、vegf-b、乳腺丝抑蛋白、vegf-d、ykl-40、0sp、年龄和 crp ;ca_125、ca72-4、vegf-b、乳腺丝抑蛋白和 osp ;ca_125、ca72-4、vegf-b、乳腺丝抑蛋白、ykl-40 和年龄；ca-125、乳腺丝抑蛋白和年龄；ca-125、ca72-4、vegf-b、乳腺丝抑蛋白、osp和年龄；ca-125、vegf-b 和年龄。
[0028]在本发明的又一些实施方案中，确定并评价了以下生物标志物(任选地包括he4)的水平:he4、癌抗原 125(ca-125)、癌抗原 72-4 (ca-72-4)、癌抗原 15-3 (ca-15-3)、年龄、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、白细胞介素-2受体a (il_2受体α)；ηε4、癌抗原125 (ca-125)和ykl-40任选地还包括年龄；he4、癌抗原72_4 (ca-72-4)、癌抗原15-3(ca-15-3)、年龄、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)和白细胞介素_2受体a (il-2 受体 a) ;ca-125、ca-72_4、丝氨酸蛋白酶 8 (prostasin)、ca_15_3、年龄、il-2 受体a、il-8，任选地还包括 ηε4 ;以及 ca-125、ca-72-4、丝氨酸蛋白酶 8(prostasin)、ca-15-3、年龄、il-2受体α、il-8、frtn.vegf、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白和触珠蛋白，任选地还包括年龄。
[0029]更具体地，预测性测试以及相关方法和产品还提供了关于卵巢癌进展分期(即:1期、ii期、iii期和iv期以及无法容易地分类为iii期或iv期的反映出相对晚期肿瘤的晚期)的有用临床信息。总之，本发明还涉及生物流体(优选血清和血浆)中某些标志物组的相对表达水平与对象卵巢癌状态之间新发现的相关性。
[0030]在一个实施方案中，本发明提供了试剂集合以测量取自于患者的流体样品(例如血液、血清、血浆、淋巴、脑脊液、腹水或尿)中生物标志物组或集合的表达水平。在另一个实施方案中，所述试剂是包含评价这些生物标志物组表达水平的试剂的多分析物组测定。
[0031]在本发明的一些实施方案中，对象的样品由组织样品(例如组织活检)或由原代细胞培养物或培养流体制备。在另一个实施方案中，生物标志物的表达在多肽水平上确定。相关的实施方案将免疫测定、酶联免疫吸附测定和多重免疫测定用于该目的。
[0032]优选的生物标志物组选自以下分子及其可测量片段的集合:(a)肌红蛋白、crp (c反应蛋白)、fgf碱性蛋白和ca19-9 ； (b)丙型肝炎ns4、核糖体p抗体和crp ； (c)ca19_9、tgfa、en-rage、egf和 hsp90a 抗体、(d)en_rage、egf、ca125、纤维蛋白原、载脂蛋白 cii1、egf、霍乱毒素和ca19-9 ； (e)蛋白酶3(canca)抗体、纤维蛋白原、ca125、egf、cd40、tsh、瘦素、ca 19-9和淋巴细胞趋化 因子；(f)ca125、egfr、crp、il-18、载脂蛋白cii1、肌腱蛋白c和载脂蛋白al ;(g)ca125、β 2微球蛋白、crp、铁蛋白、--μρ-1、肌酸激酶mb和il-8 ；(h) ca125、egfr、il-10、触珠蛋白、crp、胰岛素、--μρ-1、铁蛋白、a 2巨球蛋白、瘦素、il-8、ctgf、en-rage、淋巴细胞趋化因子、tnf-a、igf_1、tnf rh、血管性血友病因子和mdc ; (i)ca-125、crp、egf-r、ca-19-9, apo-al、apo-cii1、il-6、il-18、μιρ-la、肌腱蛋白 c 和肌红蛋白；(j)ca-125、crp、egf-r、ca-19-9, apo-au apo-ciii, il-6, μιρ-la、肌腱蛋白 c 和肌红蛋白；和(k)表1i和表1ii中所示生物标志物组中的任意种。
[0033]在另一个实施方案中，测量这些生物标志物的试剂可测量在生化过程上游或下游发现的其他分子物质，或者测量这些生物标志物和分子物质的片段。在一些情况下，相同试剂可准确地测量生物标志物及其片段。
[0034]本发明的另一个实施方案涉及测量生物标志物及相关分子和片段的结合分子(或结合试剂)。考虑的结合分子包括抗体(单克隆抗体和多克隆抗体)、适配体等。
[0035]另一些实施方案包括这样的结合试剂，其以测试试剂盒形式提供，任选地与进行生物标志物评价以预测对象中卵巢癌可能性的书面说明一起。
[0036]在其另一些实施方案中，本发明提供了基于检测或测量来自对象的试样或生物样品中前述生物标志物的水平来预测对象中卵巢癌可能性的方法。如本说明书所述，与未患卵巢癌的对照组患者相比，这些生物标志物表达水平(特别是其相对表达水平)的改变是患者中卵巢癌的预示。[0037]在其另一些方面中，预测的卵巢癌类型是浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、粘液性肿瘤和透明细胞肿瘤。并且，预测卵巢癌包括预测疾病的具体分期，例如i期(ia、ib或ic)、ii期、iii期和iv期肿瘤。
[0038]在又一些实施方案中，本发明涉及为医师建立生物标志物相对水平的报告和通过邮寄、传真、邮箱等传输这样的报告。在一个实施方案中，通过互联网传输包含生物标志物评价的报告的数据流。在另一个实施方案中，所述报告包括关于对象中卵巢癌存在与否或对象卵巢癌的等级化风险(任选地通过癌症的亚型或分期)的预测。
[0039]根据本发明的另一个方面，出于诊断目的将生物标志物表达水平的前述评价与其他诊断程序进行组合，所述其他诊断程序例如胃肠道评价、胸部x射线、he4测试、ca-125测试、全血计数、超声或腹部/盆腔计算机化断层成像、血液化学特征谱分析(bloodchemistry profile)和肝功能测试。
[0040]本发明的又一些实施方案涉及评价提取自具有卵巢癌症状或具有卵巢癌高风险的对象的样品。另一些实施方案涉及无卵巢癌症状的对象。具有症状的对象具有以下现象的一种或更多种:盆腔肿块、腹水、腹部膨胀、一般性腹部不适和/或疼痛(气体、消化不良、压力、肿胀、胃气胀、腹部绞痛)、恶心、腹泻、便秘或尿频、食欲不振、甚至少食后的饱腹感、原因不明的体重增加或减轻和阴道异常出 血。可将生物标志物的水平与这些症状的发现进行组合用于诊断卵巢癌。
[0041]本发明的一些实施方案对于确定卵巢癌存在是高度准确的。“高度准确的”意指灵敏度和特异性各自准确度为至少约85%或更高，更优选至少约90%或92%以及最优选至少约95%或97%。本发明的一些实施方案还包括这样的方法，其灵敏度为至少约85%、90%或95%并且特异性为至少约55%、65%、75%、85%或90%或更高。另一些实施方案包括这样的方法，其特异性为至少约85%、90%或95%并且灵敏度为至少约55%、65%、75%、85%或90%或更高。
[0042]与具有卵巢癌症状但是未患卵巢癌的对照组患者相比，本发明的一些实施方案确定了针对具有卵巢癌症状并且患有卵巢癌的对象群体的相关灵敏度和特异性。在另一个实施方案中，与卵巢癌风险增加但是未患卵巢癌的对照组患者相比，确定了针对卵巢癌风险增加并且患有卵巢癌的对象群体灵敏度和特异性。并且在另一个实施方案中，与无卵巢癌症状但是未患卵巢癌的对照组患者相比，确定了针对无卵巢癌症状并且患有卵巢癌的对象群体的灵敏度和特异性。
[0043]在另一些方面中，通过采用统计方法评价了生物标志物的水平，例如知识发现引擎(kde?)、回归分析、判别分析、分类树分析、随机森林、proteoiticqiicst ?、支持向量机、one r、knn和启发式朴素贝叶斯分析(heuristic naive bayes analysis)、神经网络及其变体。
[0044]在另一个实施方案中，提供了基于生物标志物表达水平的预测或诊断模型。所述模型可以是软件代码、计算机可读格式的形式或书面说明的形式，用于评价生物标志物的相对表达。
[0045]在更广泛的诊断背景下，患者的医师可利用生物标志物评价的报告，来对给定患者患卵巢癌的风险进行相对更全面的评估。在进行这种评估时，医师将考虑患者的临床表现，包括症状例如可疑的盆腔肿块和/或腹水、腹部膨胀和在没有另一种明显的恶性肿瘤来源的情况下的其他症状。有症状患者的一般实验室检查目前包括gi评价(如果临床有指示的话)、胸部x射线、ca-125测试、cbc、超声或腹部/盆腔ct(如果临床有指示的话)、化学特征谱分析以及lft，并且可包括连同遗传标志物测试(例如brca-1和brca-2) —起的家族史评价。(一般地参见 nccn clinical practice guidelines in oncology? forovarian cancer, v.1.2007.)
[0046]本发明提供了新的且重要的额外信息来源，其协助医师对患者患卵巢癌的风险进行分级并计划接下来待采取的诊断步骤。本发明类似地还可用于评估无症状高风险患者中的卵巢癌风险，以及对于一般群体用作筛查工具。考虑本发明的方法可被临床医师用作其它预测性和诊断性指示剂的全面评估的一部分。
[0047]本发明还提供了评估现有化学治疗剂和候选化学治疗剂以及其他类型癌症治疗的治疗效力的方法。如本领域技术人员将理解的，在治疗之前的患者中取得和在治疗后再次取得或任选地在治疗期间的进展阶段中取得的试样中，如上所述确定了生物标志物组的相对表达水平或生物标志物特征谱。相对于非癌症表达水平特征谱(或相对于更接近于非癌症的表达特征谱)或相对于稳定无变化的相对生物标志物表达水平特征谱，这些生物标志物相对表达的改变被解释为治疗有效。本领域技术人员将容易地理解，这种表达水平特征谱可对于癌症或癌前病症、恶性肿瘤前病症具有诊断意义或者可简单地得到这样的诊断特征谱，原因是生物标志物的相对比较之以往更像与癌症相关特征谱。
[0048]在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于确定患者是否潜在地正在发生癌症的方法。在随时间取自患者的试样中确定生物标志物表达的相对水平，从而将指向癌症特征谱的生物标志物表达特征谱改变解释为朝发生癌症进展。
[0049]患者分析一完成就可将样品的生物标志物表达水平以电子形式储存并在将来取回以进行这种比较。
[0050]本发明还提供了为卵巢癌提供高度准确测试的方法、软件产品、计算机系统和网络以及相关仪器。
[0051]本说明书所述标志物的组合提供了用于在卵巢癌进展不同分期中预测卵巢癌存在或检测卵巢癌的敏感、特异且准确的方法。所述样品的评价也可与患者的恶性肿瘤前或临床前病症的存在具有相关性。因此，考虑所公开方法可用于预测或检测样品中卵巢癌的存在，提取自患者的样品中卵巢癌的不存在，卵巢癌的阶段，卵巢癌的等级，卵巢癌的良性或恶性，卵巢癌的转移可能性，与卵巢癌有关的赘生物的组织学类型，癌症的无痛性或攻击性，以及与预防、诊断、表征和治疗患者卵巢癌有关的卵巢癌的其他特征。
[0052]还考虑所公开方法还可用于评估一种或更多种测试剂抑制卵巢癌的效力，评估卵巢癌疗法的效力，监测卵巢癌的进展，选择抑制卵巢癌的药剂或疗法，监测受卵巢癌折磨的患者的治疗，监测患者中卵巢癌的抑制，以及通过评价暴露后测试动物的生物标志物来评估测试化合物的致癌潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0053]图1是示出研究对象的人口统计学资料的表格。
[0054]图2是示出在研究中测定的生物标志物的表格。
[0055]图3是示出前20种标志物之受试者工作特征(roc)曲线分析的曲线下面积(auc)值的表格。
[0056]图4是列出曲线下面积(auc)值在统计学上大于0.5而鉴定的信息性生物标志物的列表。
[0057]图5是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物的受试者工作特征曲线的一组图。
[0058]图6是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物，按照国际妇产科联合会(figo)卵巢癌分期的血清水平分布的一组图。
[0059]图7是示出对于曲线下面积值大于0.800的9种最有信息性之生物标志物，按照卵巢癌分期亚型的血清水平分布的一组图。
[0060]图8是曲线下面积值大于0.600的生物标志物的相关性矩阵。
[0061]图9是列出聚类a至d中标志物身份的表格。
[0062]图10是示出聚类a中标志物的相关性数据的表格。
[0063]图11是示出聚类b中标志物的相关性数据的表格。
[0064]图12是示出聚类c中标志物的相关性数据的表格。
[0065]图13是示出聚类d中标志物的相关性数据的表格。
[0066]图14是示出使用九种最有信息性之标志物和oval生物标志物的逻辑斯蒂回归模型的重要特异性阈值时灵敏度的表格。
[0067]图15是示出使用九种最有信息性之标志物和oval生物标志物的逻辑斯蒂回归模型的重要灵敏度阈值时特异性的表格。
[0068]图16是示出按绝经状态分类的前20种标志物之受试者工作特征(roc)曲线分析的曲线下面积(auc)值的表格。
[0069]定义
[0070]除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的意思相同。以下参考文献为本领域技术人员提供了用于本发明的多个术语的一般定义:singleton 等，dictionary of microbiology and molecular biology (第 2版.1994) ；the cambridge dictionary of science and technology (walker 编，1988)；the glossary of genetics,第 5 版.，r.rieger 等(编)，springer verlag (1991)和 hale
&marham,the harper collins dictionary of biology (1991)。除非另有说明，否则以下术语具有属于它们的意思。
[0071]“生物标志物组”指本文所述生物标志物组中的一种。优选的生物标志物组包含ca-125和he4以及选自下列的一种或更多种生物标志物:白细胞介素_2受体a (il-2受体α)、α-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl_40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4、丝氨酸蛋白酶8 (prostasin)、金属蛋白酶组织抑制剂i (timp-1)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2 (igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1。
[0072]“洗脱液”或“洗涤液”指用于影响或改变分析物对亲和试剂之吸附性和/或从试剂中移除未结合物质的试剂，通常是溶液。洗脱液的洗脱特征可取决于例如ph、离子强度、疏水性、离液(chaotropism)程度、洗涤剂强度和温度。
[0073]“分析物”指样品中期望检测的任意组分。该术语可指样品中的单个组分或多个组分。
[0074]“分子结合伴侣”和“特异性结合伴侣”指表现出特异性结合的分子对，通常是生物分子对。分子结合伴侣包括但不限于，受体与配体、抗体与抗原、生物素与亲和素以及生物素与链霉亲和素。
[0075]“监测”指记录连续变化参数的改变。
[0076]本发明上下文中的“标志物”指与取自对照对象(例如具有阴性诊断或不可检出癌症的个体、正常或健康对象)的对应样品相比，在取自患有人癌症之患者的样品中差异存在的多肽(具有特别的表观分子量)。术语“生物标志物”与术语“标志物”可互换使用。
[0077]术语“测量”意指这样的方法，其包括检测样品中标志物存在与否、对样品中标志物的量进行定量和/或对生物标志物的类型进行定性。测量可通过本领域已知方法和本文进一步描述的那些方法(包括但不限于seldi和免疫测定)来完成。任何合适的方法可用于检测和测量本文所述标志物的一种或更多种。这些方法包括但不限于质谱分析(例如，激光解吸/离子化质谱分析)、荧光(例如，夹心法免疫测定)、表面等离子体共振、椭圆光度法和原子力显微镜。
[0078]短语“差异存在”指与对照对象相比取自患人癌症之患者的样品中存在的标志物的量和/或频率有差异。而且，标志物可以是多肽，与对照对象的样品相比其在人癌症患者的样品中检测为较高频率或较低频率。标志物可以在量、频率或两者上差异存在。
[0079]如果一个样品中多肽的量与另一个样品中多肽的量具有统计学显著差异，则多肽在两个样品之间差异存在。例如，如果多肽存在与多肽在另一种样品中存在相比多出至少约120%、至少约130%、至少约150%、至少约180%、至少约200%、至少约300%、至少约500%、至少约700%、至少约900%或至少约1000%，或者如果在一个样品中可检测并且在另一个中检测不到，则多肽在两个样品之间差异存在。
[0080]作为替代地或另外，如果卵巢癌患者样品中检测到多肽的频率统计学上显著地高于或低于对照样品，则多肽在两个样品集合之间差异存在。例如，如果在一个样品集合中观察到的频率与另一个样品集合相比高或低至少约120%、至少约130%、至少约150%、至少约180 %、至少约200 %、至少约300 %、至少约500 %、至少约700 %、至少约900 %或至少约1000%，则多肽在两个样品集合之间差异存在。
[0081]“诊断”意指鉴定病症(即，卵巢癌)的存在或性质。诊断方法在其灵敏度和特异性上有不同。诊断测定的“灵敏度”是测试为阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。测定没有检测到的患病个体是“假阴性”。未患病并且在测定中测试为阴性的对象称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是i减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为测试为阳性的没有患病的那些的比例。当一种具体的诊断方法没有提供病症的决定性诊断时，如果所述方法提供了有助于诊断的阳性指示则它也是合格的。
[0082]标志物的“测试量”指测试样品中存在的标志物的量。测试量可以是绝对量(例如，μ g/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
[0083]标志物的“诊断量”指与卵巢癌诊断相一致的对象样品中标志物的量。诊断量可以是绝对量(例如，μ g/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
[0084]标志物的“对照量”可以是与标志物测试量相比的任意量或量范围。例如，标志物的对照量可以是未患卵巢癌的个体中标志物的量。对照量可以是绝对量(例如，μ g/ml)或相对量(例如，信号的相对强度)。
[0085]“抗体”指基本上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽配体，其特异性结合并识别表位(例如，抗原)。已知的免疫球蛋白基因包括k和λ轻链恒定区基因，α、y、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及多种免疫球蛋白可变区基因。抗体例如作为完整免疫球蛋白或作为通过多种肽酶消化所产生的已被很好表征的多个片段存在。这包括，例如fab’和f(ab)’2片段。本文使用的术语“抗体”还包括通过使用重组dna方法修饰整个抗体或从头合成的那些抗体所产生的抗体片段。它还包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或单链抗体。抗体的“fe”部分指包含一个或更多个重链恒定区结构域(chp ch2和ch3)但不包含重链可变区的免疫球蛋白重链部分。
[0086]本文使用的术语“样品”意指可与患者特异性相关并且由其可确定、计算或推测关于患者的具体信息的材料。样品可以由来自患者的生物材料的全部或一部分构成。样品也可以是以允许在提供关于患者之信息的样品上进行测试的方式接触患者的材料。样品还可以是接触不是患者材料的另一种材料但是允许之后测试第一材料以确定关于患者之信息的材料。样品可接触除患者之外的生物材料来源，前提是无论如何本领域技术人员都可由样品确定关于患者的信息。还应理解，不是样品的外来材料或信息可用于最终使患者与样品相关联。对于一个非限制性实例，双盲测试需要图表或数据库以使样品与患者匹配。
[0087]本文使用的术语“体液”意指得自于患者并且稠度基本上是流体的材料，但是可以具有与其相关的固体或颗粒物质。体液还可包含不是来自患者的材料或部分。例如，体液可用水稀释，或可包含防腐剂，例如edta。体液的非限制性实例血液、血清、浆膜液、血浆、淋巴、尿、脑脊液、唾液、分泌组织和器官的粘膜分泌物、阴道分泌物、乳汁、眼泪和腹水(例如与非实体瘤相关的那些)。另外的实例包括胸膜、心包、腹膜、腹部和其他体腔等的流体。生物流体可还包括与对象或生物来源(例如，细胞和器官培养基，包括细胞或器官条件培养基)相接触的液体溶液、灌洗液(lavage fluid)等。
[0088]“安排对象治疗”指临床医师或医师在确定卵巢癌状态后的行为。例如，如果本发明方法的结果不确定或者有必须确定状态的原因，则医师可进行更多的测试。或者，如果状态表明外科手术是适当的，则医师可安排患者进行外科手术。同样地，如果状态是负面的(例如晚期卵巢癌)或如果状态是急性的，则可批准没有进一步的行动。此外，如果结果示出治疗是成功的，则不需要进一步的安排。
[0089]术语“分期”或“癌症分期”旨在意指基于患者中癌的大小、侵袭性、进展、转移等的卵巢癌的分类。卵巢癌的分期是明确定义的。i期指其中癌仍局限在卵巢(或两个卵巢)中的卵巢癌。具体地，ia期癌症在一个卵巢中形成，并且肿瘤限制在卵巢内侧。在卵巢外表面上没有癌。实验室检查来自腹部和盆腔的洗涤液没有发现任何癌细胞。ib期癌症已在两个卵巢中形成而在其外表面上没有任何肿瘤。实验室检查来自腹部和盆腔的洗涤液没有发现任何癌细胞。ic期癌症存在于一个或两个卵巢中，并且存在以下现象之一或更多个:至少一个卵巢外表面上存在癌；在囊性肿瘤(充满流体的肿瘤)的情况下，囊(肿瘤的外壁)已破裂(爆炸)；或实验室检查在来自腹部的流体或洗涤液中发现癌细胞。
[0090]ii期癌症在一个或两个卵巢中并且涉及了盆腔中的其他器官(例如子宫、输卵管、膀胱、乙状结肠或直肠)。具体地，iia期癌症已扩散至或实际上已入侵子宫或输卵管或两者。实验室检查来自腹部的流体没有发现任何癌细胞。iib期癌症已扩散至其他附近的盆腔器官，例如膀胱、乙状结肠或直肠。实验检查来自腹部的流体没有发现任何癌细胞。iic期癌症已扩散至如iia和iib期的盆腔器官，并且实验室检查来自腹部的洗涤液发现了癌细胞的证据。[0091]iii期癌症涉及i个或两个卵巢，并且存在以下现象的一种或两种:⑴癌症已扩散到盆腔之外到达腹部衬里；(2)癌症已扩散至淋巴结。如果在分期手术中，外科医师可看见涉及一个卵巢或两个卵巢的癌症，但是在腹部没有明显看到癌(可在不使用显微镜的情况下看见)并且癌症没有扩散至淋巴结，则癌症是iiia期。然而，当在显微镜下进行活检检查时，在上腹部的衬里中发现了癌症的微小沉积。iiib期癌症在一个或两个卵巢中，并且在腹部存在癌症的沉积物，其大到足以被外科医师看见，但是横向小于2cm(约3/4英寸)。癌症未扩散至淋巴结。对于iiic期的癌症，癌症在一个或两个卵巢中，并且存在以下现象的一个或两个:癌症已扩散至淋巴结和/或在腹部看见横向大于2cm (约3/4英寸)的癌症沉积物。
[0092]iv期癌症是卵巢癌的最晚期。癌症在一个或两个卵巢中。已发生了远距离转移(癌症扩散至肝脏、肺、或位于腹膜腔外的其他器官内)。在胸膜液(来自肺周围的腔)中发现卵巢癌细胞也是iv期疾病的证据。
[0093]本文使用的术语“复发性卵巢癌”旨在意指在治疗完成后疾病恢复原状(复发)。
[0094]生物标志物
[0095]“ca-125’’意指与ncbi登录号np_078966.2或aal65133具有至少85%序列同一性的多肽生物标志物或其片段。ca-125的示例性序列是:
[0096]i mlkpsglpgs ssptrslmtg srstkatpem dsgltgatls pktstgaivv tehtlpftsp
[0097]61 dktlasptss vvgrttqslg vmssalpest srgmthseqr tspslspqvn gtpsrnypat
[0098]121 smvsglsspr trtsstegnf tkeastytlt vettsgpvte kytvptetst tegdstetpw
[0099]181 dtryipvkit spmktfadst askenapvsm tpaettvtds htpgrtnpsf gtlyssfidl
[0100]241 spkgtpnsrg etslelilst tgypfsspep gsaghsrist saplsssasv ldnkisetsi
[0101]301 fsgqsltspl spgvpearas tmpnsaipfs mtlsnaetsa ervrstissl gtpsistkqt
[0102]361 aetiltfhaf aetmdipsth iaktlasewl gspgtlggts tsaltttsps ttlvseetnt
[0103]421 hhstsgkete gtlntsmtpl etsapgeese mtatlvptlg fttldskirs psqvssshpt
[0104]481 relrttgsts grqssstaah gssdilratt sstskasswt sestaqqfse pqhtqwvets
[0105]541 psmkterppa stsvaapitt svpsvvsgft tlktsstkgi wleetsadtl igestagptt
[0106]601 hqfavptgis mtggsstrgs qgtthlltra tassetsadl tlatngvpvs vspavsktaa
[0107]661 gssppggtkp sytmvssvip etsslqssaf regtslgltp lntrhpfssp epdsaghtki
[0108]721 stsipllssa svledkvsat stfshhkats sittgtpeis tktkpssavl ssmtlsnaat
[0109]781 spervrnats plthpspsge etagsvltls tsaettdspn ihptgtltse ssespstlsl
[0110]841 psvsgvkttf ssstpsthlf tsgeeteets npsvsqpets vsrvrttlas tsvptpvfpt
[0111]901 mdtwptrsaq fssshlvsel ratsstsvtn stgsalpkis hltgtatmsq tnrdtfndsa
[0112]961 apqsttwpet sprfktglps atttvstsat slsatvmvsk ftspatssme atsirepstt
[0113]1021 ilttettngp gsmavastni pigkgyiteg rldtshlpig ttassetsmd ftmakesvsm
[0114]1081 svspsqsmda agsstpgrts qfvdtfsddv yhltsreiti prdgtssalt pqmtathpps
[0115]1141 pdpgsarstw lgilssspss ptpkvtmsst fstqrvttsm imdtvetsrw nmpnlpstts
【权利要求】
1.一种预测对象的卵巢癌状态的方法，其包括步骤: 在得自于所述对象的生物流体样品中测量ca-125和he4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平:il_2受体a (il-2ra )、a -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂i (timp-1), il-8、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (lox-1)、神经毡蛋白 utnfr2 和 mpif-1 ;以及 使所述测量与卵巢癌状态相关联。
2.权利要求1的方法，其还包括测量癌抗原72-4(ca-72-4)的水平。
3.权利要求1的方法，其中所述卵巢癌状态是存在卵巢癌。
4.权利要求1的方法,其还包括: 基于所述状态安排对象治疗。
5.权利要求4的方法，其中安排对象治疗选自进行更多的测试、进行外科手术和不采取进一步的行动。
6.权利要求4的方法，其还包括: 在进行对象安排后在得自于所述对象的生物流体样品中测量ca-125和he4的水平并且测量选自下列的一种或更多种生物标志物的水平:白细胞介素-2受体a (il-2受体a)> a-1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4(ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂ι(--μρ-ι)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2 (igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1 ； 使所述测量与卵巢癌状态相关联；以及 确定对象安排是否导致卵巢癌状态改变。
7.权利要求1的方法，其中测量选自:检测所述生物标志物的存在与否、对生物标志物的量进行定量和对生物标志物的类型进行定性。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述生物标志物通过免疫测定进行测量。
9.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述关联通过软件分类算法进行。
10.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述样品选自血液、血清和血浆。
11.试剂盒，其包含: a)一组亲和试剂，所述亲和试剂各自与ca-125和he4以及选自下列的一种或更多种生物标志物选择性结合:白细胞介素-2受体a (il-2受体α )、α -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4(ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂10?μρ-1)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白1、tnfr2和mpif-1 ;以及 b)一组容器，所述容器各自包含ca-125和he4以及选自下列的一种或更多种生物标志物:白细胞介素-2受体a (il-2受体α )、α -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4(ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂ι(--μρ-ι)、il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (lox-1)、神经毡蛋白 1、tnfr2 和 mpif-1。
12.权利要求11的试剂盒，其中所述亲和试剂是抗体。
13.权利要求11的试剂盒，其还包含使用所述亲和试剂来测量来自对象的样品中所述生物标志物水平的书面说明。
14.权利要求11的试剂盒，其还包含使用所述试剂盒来确定对象卵巢癌状态的书面说明。
15.一组纯化肽，其包含ca-125和he4以及选自下列的一种或更多种生物标志物:白细胞介素-2受体a (il-2受体α )、α -1-抗胰蛋白酶(aat)、c反应蛋白(crp)、ykl-40、细胞纤连蛋白(cfib)、癌抗原72-4 (ca-72-4)、丝氨酸蛋白酶8、金属蛋白酶组织抑制剂i (timp-1), il-8、基质金属蛋白酶7(mmp-7)、il-6、血管内皮生长因子b(vegf-b)、钙防卫蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2(igfbp-2)、凝集素样氧化ldl受体i (l0x-1)、神经毡蛋白 utnfr2 和 mpif-1。
16.权利要求15的肽，其中所述肽的一种或更多种包含可检测标记。
【文档编号】g01n33/532gk103582815sq201280010293
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年2月14日 优先权日:2011年2月24日
【发明者】格雷格·p·贝尔滕肖, 平·f·叶, 帕塔·塞莎亚 申请人:佛米利昂公司