使用改进的免疫复合物(ic) elisa来检测抗体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本发明人教导了fcγr例如cd16、cd32或cd64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体，所述复合物即是由抗原和特异性抗体所形成的复合物。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。
【专利说明】使用改进的免疫复合物(ic) elisa来检测抗体
[0001]本发明涉及诊断或分析方法领域。具体地讲，本发明人教导了 fe y r例如⑶16、cd32或cd64可以用于在体外定量测定呈免疫复合物(即由抗原和特异性抗体所形成的复合物)形式的抗体。也提供了用于呈免疫复合物形式的抗体的检测和定量测定的方法。
[0002]在各种出版物中，已经描述了高度灵敏的免疫复合物(ic) elisa用于针对以下的igg抗体的检测:巨细胞病毒(sachers, emmerich等人，1985)、拉沙病毒衣壳抗原(emmerich, thome-bolduan等人，2006)以及西尼罗(west nile, wn)病毒和蝶传脑炎(tbe)病毒表面的型特异性抗原(ludolfs，niedrig 等人，2007; ludolfs, reinholz 等人，2009)。后两种测试使用各自的黄病毒的ed3结构域，不再显示使用市售常规elisa或间接免疫荧光(hf)通常可见的黄病毒之间的交叉反应性。原则上，包被有来自类风湿性关节炎患者的类风湿因子(rf) igm的板有效结合免疫复合物(ic)，其在含特异性igg抗体的人血清样品和各自的过氧化物酶标记的抗原(酶标抗原，ela (sachers, emmerich等人，1985)混合后形成。
[0003]与使用抗原包被的板和带标记的抗人igg样间接elisa或iif的抗体测定相比，ic elisa被证明具有若干优势。
[0004]通过添加血清样品和各自的ela，对于阳性结果需要2个免疫步骤。特异性抗体必须与抗原反应，然后聚集，即免疫复合，igg抗体与固相上的rf igm结合。因此，涉及到2个免疫机制。
[0005]检测ic的方法具有优势，具体地讲，使用ic elisa时，大大过量的单体igg (其在使用间接elisa或iif测试时通常引起背景反应)不再产生背景染色，并且可采用1:10的低血清稀释。因为过氧化物酶(pod)-标记，低分子量抗原将会聚集，其促进形成具有许多pod分子的大1c。因此，可以使用高稀释的ela (对于西尼罗和tbe ela，通常1: ≥ 20000)。这也有助于低背景染色。
[0006]因为可以以高稀释度应用各种ela，所以可以加入过量大约100倍的竞争性交叉反应的未标记抗原(ludolfs, reinholz等人，2009)。因此，可以增加ic elisa对选择性表位的特异性。最后，ic elisa在技术上操作非常简单，因为抗原和抗体可同时应用，并且对测试进行染色前仅需一个孵育和洗涤步骤。
[0007]wn-和tbe-1c elisa的高特异性已有文献证明，其使用接受tbe疫苗者和wn感染后的患者的大量血清样品。与iif或间接elisa (其中这些样品中的许多都显示出众所周知的交叉反应)相比，在wn ic elisa中使用tbe样品，未见反应(p/n〈 i)。反之亦然，在tbe ic elisa中使用wn热恢复期患者的样品，未观察到交叉反应性。(ludolfs，niedrig等人，2007; ludolfs, reinholz 等人，2009)。
[0008]人或动物抗体对不同黄病毒的交叉反应性是众所周知的现象。使用针对西尼罗病毒、登革热病毒或tbe病毒的包膜糖蛋白的小鼠或甚至人单克隆抗体，已经鉴定出共有的黄病毒表位。例如，针对西尼罗病毒或登革热病毒的包膜蛋白的80%小鼠单克隆抗体具有交叉反应，仅很少数单克隆抗体，大部分是针对包膜蛋白的ed3结构域(8%)，对所述的病毒具有特异性。高免疫原性ed3是推定的受体结合结构域，并且若干中和单克隆抗体与wn或登革热病毒的ed3结合。
[0009]使用ed3结构域作为抗原来源，ic elisa比起大部分常规抗黄病毒的elisa或iif具有高得多的特异性。pod-标记的ed3结构域蛋白可以以极高稀释度使用(1:20, 000-1:40, 000)。因此，通过以100倍过量加入异源ed3抗原阻断不想要的特异性，是可能的(ludolfs, reinholz等人，2009)。由于过氧化物酶标记,抗原的交联能解释带标记的ed3蛋白的高稀释度，因为生物素标记(其不产生聚集)被证明效率要低得多。在特异性抗体存在下，形成超过300 000 da且含有很多pod分子的非常大的1c。因此，与固相结合的少数带标记的ic将足以产生强pod信号。然而，过夜孵育是必要的，然后这些大的ic才能逐步替换掉与固相包被的fcr分子结合的非特异性igg分子。非特异性igg分子和ic之间的这种竞争可以是特别棘手的，当很多igg以聚集形式存在于血清样品中时。因此，血清样品的贮存条件可以影响ic elisa的灵敏度。在4° c贮存未稀释血清或在-20° c冷冻看来都可以容许，而重复冷冻和解冻循环或加热￠0° c)看来就会增加aglgg的比例并且对最佳灵敏度可能是不利的。
[0010]然而，不得不指出在使用ic elisa中的某些不利之处:只有在过夜孵育之后才得到足够的测定灵敏度，即足够高的阳性/阴性比。因此，与间接elisa相比，ic需要相对长的孵育时间。另一方面，尤其对于流行病学研究，通常不需要即刻结果，并且ic elisa的优点，例如极大地促进高通量测定的简单操作、足够的灵敏度和卓越的特异性，将可能补偿某些次要的不利之处。
[0011]ic elisa的另一个主要缺点涉及rf igm的标准化，所述rf igm是由来自不同的类风湿性关节炎患者的血清的igm级分组成。因此，存在于igm级分的rf igm的含量和其它igm抗体的特异性两者，各个批次都是不同的。在得自类风湿性关节炎患者的rf igm级分中仅有大约10% igm抗体具有rf活性，而90%则表现出非rf-特异性反应。因此，使用不同批次的rf制品，elisa难以标准化。这也可导致干扰了在测定中使用的ela。在结合ic中，对rf具有特异性的人单 克隆抗体可能甚至比总体的人rf igm更有效。因此，它们可代表一个备选，即使可能有可用度的问题(duquerroy, stura等人，2007)。
[0012]虽然对不同的、潜在的免疫复合物结合分子的活性已经进行了一些研究，但必须牢记在心的是，大多数的这些测定在具有重组表面表达的组织培养细胞中已经进行，然而迄今为止缺乏对与固相结合的可溶性潜在结合分子的数据。
[0013]本发明人因此解决替代方法的问题，以提供用于免疫复合物elisa的方法，其将避免rf包被的至少部分的不足之处，具体地讲，允许更好的标准化。
[0014]与rf相比，本发明人测试了各种igg结合分子用于体外试验的适合性，所述igg结合分子在体内是具有活性的，可检测和消除1c。第一，他们选择补体成分clq。人clq是经典补体途径的首个成分，其分子量为大约410-462 kda。clq的六聚体球形头部排它地与igg分子的ch2结构域或igm的ch3结构域结合。clq必须与至少2条重链结合，以便改变其构象并活化clr和cls。其活化是在与呈ic形式的与多价抗原结合的免疫球蛋白结合之后。也已知它与多种其它的活化物质(包括c-反应蛋白、逆转录病毒和线粒体)结合((jefferis 和 mageed 1989; bohlson, fraser 等人，20077; duquerroy, stura 等人，2007)。先前已经证明它优先地与预先形成的免疫复合物结合(hack和belmer，1986)。
[0015]同样地，测试抗人igg对固相的包被。尽管在体内，抗人igg与人igg结合，而不优先与免疫复合物结合，但是有时仍然选择抗人igg来在体外检测呈免疫复合物形式的抗原特异性的人igg抗体(例如在登革热测定中)(cuzzubbo, vaughn等人，1999; vazquez,hafner 等人，2007)。
[0016]作为igg的fe区的备选受体，也测试了 fe受体(fcr)分子。选择fcyriia(⑶32)，其与clq相比，在体内优先地发现它在pmn (多形核白细胞)表面上。具有其跨膜部分的完整cd32在多种免疫应答的活化中起作用(astier，de la salle等人，1994;ravetch和bolland 2001; nimmerjahr^pravetch 2006; anderson, guyre等人，1986)。
[0017]显然，在体内，人clq和⑶32分子都与人免疫球蛋白密切接触。尽管在体内，这些分子的活化和信号转导仅在与免疫复合物(ic)中的聚集的igg的结合之后才引起，但是这不一定表示在体外测定条件下，它们可区分聚集的和非聚集的igg，即这不一定表示它们可能适合于改进免疫复合物elisa的灵敏度和/或再现性。因此，除了 rf和抗igg抗体之外，本发明人在体外在高浓度igg存在下测试了 clq和⑶32两者的优先地结合ic的能力。通过将这些不同的ic结合蛋白包被到固相，本发明人试图改进更早公布的ic elisa的再现性以及灵敏度，例如，对于西尼罗病毒和tbe病毒而言。
[0018]本发明人所面临的问题通过权利要求书的主题而得以解决。
[0019]一方面，本发明提供了 fe y r在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体中的用途。
[0020]免疫复合物包含抗原和对所述抗原具有特异性的抗体，因而允许定量测定特异性抗体。免疫复合物可以通过将抗原添加到包含抗体的样品中而形成。在这种情况下，抗原优选为带标记的抗原，例如酶标抗原(ela)，这允许容易地检测免疫复合物。酶可以是过氧化物酶，例如，辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶也可以使用。其他标记方法，诸如生物素化或用突光部分例如fitc、pe或突光蛋白标记,也可使用。备选地,抗原可以是未标记的,如果它包含不止一个表位。然后可使用第二个带标记的抗体，优选单克隆抗体，以检测和定量测定免疫复合物。如果标记是生物素，则可以通过在额外步骤中添加抗生物素蛋白-标记或链霉抗生物素蛋白-标记的酶进行检测。现有技术水平众所周知的是，添加酶的底物允许定量测定标记，并且因此允许定量测定呈免疫复合物形式的抗体。
[0021]也可以使用fcy r，特别是，⑶32，来测定或定量测定样品中的预先形成的免疫复合物。
[0022]因此可以定量测定免疫复合物，以测定或定量测定样品中的特异性抗体的存在情况。形成免疫复合物的抗体通常将会是igg亚类。可以检测iggl、igg2、igg3和/或igg4。然而，本发明人惊奇地表明禽类抗体也可用⑶32来检测，即fe y r也能够与由禽类igy抗体(例如鸡igy)形成的免疫复合物结合。这是意料之外的，因为igy不与例如类风湿因子
?
[0023]在本发明的情况下，fe yr可以是⑶16、⑶32或⑶64或其能够与免疫复合物结合的功能性片段。fe y r优选地是cd32或其能够与免疫复合物结合的功能性片段。cd32优选地包含与⑶32 (优选人⑶32)具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。fe y r的片段优选地包含与功能性fe y r片段(特别是，人⑶32片段)具有至少80%、至少90%、至少95%、至少99%或100%序列同一性的氨基酸序列。所界定的序列同一性的区域能够与免疫复合物结合，例如在下文实施例中测试的。功能性片段优选地包含cd16、cd32或cd64的胞外部分，特别是，对于cd32而言，fe yriia，例如fe yriiah131。在一个实施方案中，fe y r不包含his标签，尤其是在样品可以包含抗疟疾抗体的情况下，抗痕疾抗体已经显示在特定条件下能够与his标签交叉反应。
[0024]在一个实施方案中，在本发明的情况下使用bruns等人(2009)所公开的⑶32，特别是在位置131具有氨基酸取代的cd32 (fe y riiah131或fe y riiak131)。也可使用fe y riiavi58 y (bruns 等人，2009)。
[0025]由本发明人用不同的fcr分子进行的ic elisa实验表明，⑶32特别地适合于结合在血清和ela的孵育期间形成的带标记的1c。
[0026]其它fcyr诸如⑶16 (fe y r iii a或b)也是有效的，并且因此可用于本发明的方法，然而，⑶32，尤其是呈fe y riiah131形式的，迄今为止显示出最好结果。fe y r，例如⑶32，优选地被固定在固体支持物上。
[0027]包含被分析的抗体样品的组合物可以是样品，例如，生物样品，例如来自患者的样品。它也可以是来自已知具有或没有目标抗体的受试者的样品，例如作为阳性或阴性对照。优选地，在同一测试中分析来自受试者和阳性和/或阴性对照的样品，以允许直接比较。样品可以得自血(例如血浆，或者优选血清)、粪便、唾液或脑脊液。样品(例如血清)可以经稀释，然后再接触fe y r，例如在缓冲液例如pbs或柠檬酸缓冲液中以1:10或更高(例如1:100)稀释。
[0028]样品可以来自人类受试者或动物，例如山羊、绵羊、马、牛、鸟(例如鸡)或啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠或仓鼠)。因此，免疫复合物可以由抗原(例如酶联抗原)和得自选自以下物种的抗体而形成:人、山羊、绵羊、马、牛、禽类物种(例如鸡)或啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠或仓鼠)。在这种情况下，fe y r优选地是人fcy r，因为本发明人能够证明人fe y r，特别是cd32，具有惊人地广泛的种间反应性。
[0029]在一个实施方案中，免疫复合物是通过将抗原添加到包含抗体的样品中而形成，然后使样品接触fe y r，即fe y r与预先形成的免疫复合物结合。
[0030]正如下文实施例中所显示的，也可以在fe y r存在下将抗原加入到包含抗体的样品中，即可以在fe y r存在下，例如在cd32存在下形成免疫复合物。本发明人发现，这与以下实施方案相比改进了测试的灵敏度:在所述实施方案中，首先将抗体与fe y r结合，然后在洗涤步骤之后，加入抗原以形成免疫复合物。这与预先形成免疫复合物相比也可以节省时间。fe y r与抗原的接触因此可以同fe y r与包含有待定量测定的抗体的组合物的接触基本上是同时的。
[0031]本发明也提供检测免疫复合物的方法，具体地讲，用于在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体的方法，所述方法包括:
a)在适合于fey r与固体支持物结合的条件下，用fe y r包被所述固体支持物，
b)将所述固体支持物与包含抗体和抗原的组合物一起孵育，其中所述抗体和所述抗原能够形成免疫复合物，和
c)洗涤所述固体支持物，和然后
d)测定所述免疫复合物的量。
[0032]所述固体支持物可以是例如塑料板，尤其是适合于elisa的塑料板，正如现有技术水平众所周知的，例如有孔(通常96孔)的聚苯乙烯板。所述固体支持物也可以是例如盖玻片、柱、或适合填充柱的树脂、或珠(例如玻璃珠、塑料珠或磁珠)。优选地，在步骤a之后洗涤所述固体支持物。也可考虑封闭步骤，例如用缓冲液例如包含牛血清白蛋白(bsa)或另一种无关蛋白的pbs的封闭步骤。
[0033]在一个实施方案中，步骤b的组合物包含由抗原和抗体所形成的免疫复合物。可以先形成由抗原和igg或igy抗体所形成的免疫复合物,例如通过将抗原添加到包含对所述抗原具有特异性的抗体的样品中，然后再与固体支持物上的fe y r—起孵育。本发明人已经证明了，介于fe y r与抗体的孵育以及与抗原的孵育之间的固体的洗涤步骤降低了灵敏度。相比之下，更好的是将fe y r与抗原和抗体同时孵育，即其中抗原和抗体已经形成免疫复合物，或其中在fe y r存在下形成免疫复合物。在fe y r存在下形成免疫复合物是可能的并且导致至少等同的结果。这与预先形成免疫复合物相比可以节省时间。为了形成复合物及平衡结合，应当使用合适于所选条件的足够的孵育时间。
[0034]形成免疫复合物和使fe y r与支持物结合的合适条件描述于例如实施例中，然而也是对于本领域技术人员而言显而易见的。孵育步骤优选地是每次1-48小时。优选地，孵育，尤其是包被的支持物与抗体和/或免疫复合物的孵育，进行至少8小时、至少12小时、至少24小时、或至少48小时、或过夜。因此，与间接elisa或iif相比，为了最佳的结果，需要相对长的孵育时间。对该发现(孵育时间更长，结果更好)的一个解释可能是:多价的高分子量ic需要时间以与mlgg或aglgg竞争fe y r分子或者部分地取代mlgg或aglgg。
[0035]孵育可以是在冰上、在4-8° c或在室温例如在20° c_25° c。正如技术人员所明白的，最佳孵育时间和温度彼此影响，并且可以根据测定的需要和试剂特性而确定。孵育可以是在缓冲液例如pbs中，所述缓冲液任选包含非离子型去污剂例如吐温，和/或封闭剂例如bsa。优选地，选择条件，其对应于在现有技术水平中已知的，用于用rf检测ic的测定中的条件。
[0036]洗涤步骤可以用例如pbs/吐温来进行，所述pbs/吐温任选包含bsa或不同于抗原或抗体的另一种蛋白质。可以按照现有技术水平已知方法，例如在以下实施例中描述的用于酶联抗原的方法，来测定免疫复合物的量、存在与否。备选地，针对抗原的带标记的抗体可以用于检测。所检测的标记的量与呈免疫复合物形式的抗体(即对抗原具有特异性的抗体)的量相关。
[0037]抗体可以是igg类或igy类。在本发明的一个实施方案中，抗体是igy抗体，fe y r是⑶32。在另一个实施方案中，抗体是igg抗体，fe yr是⑶32。
[0038]对于fe y r的用途，以上已经描述了更多的细节，这些细节也构成了本发明方法中的优选的实施方案。
[0039]本发明也提供了诊断受试者中病原体感染(例如病毒感染)的方法，其中进行上述检测免疫复合物的方法，其中包含抗体的组合物是来自所述受试者的样品，其中所述抗体能够特异性结合的抗原是来自所述病原体的抗原。病原体可以是例如病毒，例如西尼罗(wn)病毒、登革热病毒或蜱传脑炎(tbe)病毒。抗原优选地是表面蛋白或表面糖蛋白或其多糖或寡糖结构，例如病毒的包膜蛋白。抗原可以是重组制备的。如前所述，抗原可以是带标记的，例如标记有生物素或酶例如辣根过氧化物酶，以便检测。如果受试者是哺乳动物例如人，那么抗体将是igg抗体。
[0040]使用具有已知抗体浓度的样品作为标准品，技术人员可以容易地测定样品中的抗体量。然后可比较抗体量，例如与健康受试者、具有病原体急性感染的受试者、或者过去曾感染过病原体的受试者的已知量进行比较。对得自病原体的抗原具有特异性的抗体的存在，通常表明受试者感染了该病原体或者已经感染过该病原体。因为仅检测igg或其禽类同源物，而不是igm (其在首次感染病原体的初期形成)，所以免疫复合物的存在表明类别转换(class switch)已经发生。类似的抗体量可以例如表明类似的感染阶段。在一个受试者中的抗体浓度也可以随时间而变，其可以允许得到有关感染的病程、或接种后的免疫水平的结论。
[0041]本发明提供了优于现有技术水平的若干优势。与难以标准化和具有变化的质量的rf相比，重组fe y r是可用的。重组⑶32是明确的市售分子，具有与rf igm类似的或甚至更好的结合能力。cd32的一个进一步的优势是意外的观察结果，就是，在某种程度上，动物尤其是啮齿类动物和禽类的ic也可被检测。
[0042]以下具体的实施例说明了、但并非限制了本发明。所有引用的文献都通过引用结合到本文中。
[0043]图例
图1:将50ng生物素化单体igg (mlgg)和聚集的igg (aglgg)的每一种加入到包被有⑶32、rf、clq和抗人igg的微量滴定条上。在4° c过24h之后，加入链霉抗生物素蛋白-pod并测量结合的mlgg和aglgg的量(i ng生物素化mlgg或aglgg相当于od 4501.0±10%)。
[0044]图2:在包被有rf、⑶32、clq和抗igg抗体的板上测试3个对照血清( 血清； 血清和阴性血清)和在10%阴性(neg.)血清中以1:10、1:20和1:40稀释的 血清，其中进行中间洗涤(抗igg洗涤)和不进行中间洗涤(抗igg)。因为ela的高度稀释(1:20000)，在空白微量滴定板(未包被)上几乎看不到反应。
[0045]图3:使用wn ic和cd32包被，测试稀释在pbs、在wn阴性mlgg (i mg/ml)和在aglgg (i mg/ml)中的不同浓度(0.8 pg - 12.5 ng/ml)的人单克隆抗体4384。
[0046]图4:使用wn ic elisa和包被有⑶32和rf两者的条测试经免疫的兔和鸡的血清中的抗wn抗体。
实施例
[0047]材料和方法
血清样品:
先前已经给出了具有或没有针对wn病毒和tbe病毒的抗体的人血清样品来源((ludolfs, niedrig 等人，2007; ludolfs, reinholz 等人，2009))。从这些较早研究中选择出得自从西尼罗热中恢复的患者的2份人血清和采自接种了 tbe之后的健康受试者的3份人血清。经间接免疫荧光(iif)确证的10份没有抗tbe和抗wn抗体的血清得自健康的德国献血者。此外，在该研究中也包括针对wn病毒的ed3结构域的人wn单克隆(克隆4384) (throsby, geuijen等人，2006)，以及用wn病毒免疫过的2份兔血清和2份鸡血清。
[0048]用不同fe-受体(fcr)蛋白来包被:
分离100 ml rf (lmg/ml)的混合物(pool)作为得自多个人供体的igm级分(medac,hamburg,德国)，并在-70° c冷冻保藏,直到使用。分离自人血清的冻干的人补体成分clq (clq)得自 sigma-aldrich (hamburg,德国)。冻干的重组人可溶性fe y riia (0)32)购自 r&d systems, ffiesbaden-nordenstadt,德国，或者备选地购自 sinobiological,北京，中国。cd16b (人fcyriiib)得自r&d systems。经亲和纯化的抗人igg得自medac, hamburg,德国。将所有材料在pbs 0.1% nan3中稀释至8pg/ml的浓度,并加入到maxisorb微量滴定条(60μ1/孔，nunc, copenhagen,丹麦)。在4。c孵育至少48 h之后，将各孔用50μ1矿物油(sigma-aldrich, hamburg)覆盖并用粘胶带密封。所述条可在4° c贮存至少一个月。冻干之后，在真空袋中，它们在至少一年内是稳定的。
[0049]用于针对tbev和针对wnv的igg抗体的ic elisa
ic elisa开始于用含0.05%吐温20的磷酸缓冲盐水(ph 7.5) (pbst)对微量滴定条的3轮洗涤。由于在bsa存在下对ela的高度稀释，就无需进行通常用bsa对各板进行的封闭。血清样品在 pbs 0.05 % procline 300 (sigma-aldrich, hamburg)中以 1:10 稀释。在过氧化物酶存在下，不应使用nan3。向各孔中加入25 μ?血清稀释液和25 μ? ela(在含1% bsa、1% fcs的pbst中以1:20 000稀释)，并将混合物在4° c孵育24h。最后，在重新洗涤之后，用tmb (3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)对测试进行染色，用in h2so4终止并在450 nm处读数。
[0050]计算ic elisa的截止(cut-off)消光度为20个阴性血清的平均消光度加上3个标准差。为了计算阳性/阴性(p/n)比，将弱阳性血清样品在10%阴性血清中稀释，直到得到截止消光度(0.07-0.1)为止。对于各测定，所有血清样品的消光度(0d450)都除以该截止对照的消光度。
[0051]间接免疫荧光测定(iif)
使用感染有tbe病毒和wn病毒 两者的、经丙酮固定的veio e6细胞。血清测试起始于1:10稀释度。使用在含锥虫蓝的pbs中以1:100稀释的抗igg fitc (抗人-1gg、抗鸡-1gg和抗兔-1gg,山羊来源，medac, hamburg,德国),以对细胞进行复染色。
[0052]igg 结合
单体igg (mlgg)得自健康献血者的新鲜人血清,其经凝胶色谱(sephacryl 200, gehealthcare europe freiburg,德国)测定没有针对wn病毒或tbe病毒的抗体。用硫代-nhs-生物素(sigma-aldrich, hamburg,德国)使纯化的单体igg (2 mg/ml)生物素化。以1-0，01 ng/孔(在50 μ?中)的量将生物素化单体igg (mlgg)加入到包被有不同fcr结合蛋白的微量滴定条上。备选地，所述条用生物素化的热聚集的(lh; 61° c) igg(aglgg) (1-100 ng/孔)包被。孵育过夜或48小时之后,洗漆所述条,并用链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(sigma-aldrich)检测结合的mlgg。孵育i小时和洗涤之后，用tmb对测试进行染色，用in h2sojs止并在450 nm处读数。48小时孵育之后，mlgg或aglgg完全与孔结合。在4° c孵育48小时之后，1、2、3、4、5 ng生物素化mlgg或aglgg完全与未包被的孔结合，分别产生od 450为0.21,0.43,0.6,0.77和1.01。这表明关系是线性的，及定量测定是可能的。
[0053]结果:
ic elisa的原理依赖于ic (在血清样品和ela混合之后形成)与固定化fcr分子的选择性结合。最佳地，大大过量的单体igg不应被结合。为了测量不同fcr的这种选择性活性，本发明人利用以下事实:生物素化的聚集的igg (aglgg)可用作ic替代物(vance，huizinga 等人，1993; teeling, jansen-hendriks 等人，2001)。
[0054]如图1所示，对于aglgg和mlgg两者，用抗人igg (抗igg)的包被显示最高结合能力。然而，结合的aglgg/ mlgg的比例相当低。令人吃惊的是,fcr cd32fcr与aglgg的结合相当地优于所有所测试的其它分子，甚至优于来自现有技术水平的阳性对照，rf。对aglgg的选择性结合对于单体igg (mlgg)是1.2倍，对于clq是3倍，对于rf是4倍，和对于cd32是11倍。
[0055]然后，针对抗tbe igg和抗wn igg抗体，用ic elisa对不同包被的固相微量滴定条进行测试。通过在不同包被的微量滴定条上使用tbe ic elisa (图2)，显示出用强阳性( )和弱阳性⑴样品(两者都以1:10稀释)得到的p/n比。通过iif，样品的抗tbe抗体滴度分别为1:2560和1:160。此外，包括10个阴性对照样品(1: 10稀释)、截止样品(p/n比1，图上未显示)和缓冲液对照(无血清)。阴性样品在rf-、clq-和⑶32包被的条上具有非常低的背景反应，所有的p/n比都〈i。另外，9个得自没有tbe接种的德国献血者的额外阴性样品的p/n比〈i。显著地，在空白、未封闭的条(未包被，图2)上几乎未见反应。在1% bsa存在下1:20,000的高稀释度，可以解释tbe ela的低背景噪声。2个阳性样品在⑶32条上产生最高p/n比。为了得到有关非特异性人igg干扰的一些信息，将经iif测定的具有1:80抗体滴度的弱阳性样品( )稀释在10%阴性血清中。在1:40稀释度时，使用rf包被的或⑶32包被的条，达到截止水平(p/n=l)，而用clq-包被，在1:10稀释度时已经得到完全阴性结果。
[0056]另外，将fcr包被与抗-人igg-包被的条检测ic的能力进行比较(图2，右栏)。在此，比较了两种不同的测试程序:在一个条(表示为抗igg)上，按照常规，同时使用血清和tbe-ela ;而在平行条上，在将血清样品孵育i小时之后，洗涤该条(抗igg洗涤)，然后再施用tbe - ela过夜。有趣的是，没有洗去未结合的igg抗体与具有额外洗涤的步骤相比，阳性血清的反应明显更强(p/n比分别为6和4)。后一种程序(有洗涤)常规用于针对登革热病毒的igg抗体检测，或与抗μ抗体测定一起用于特异性igm检测。本发明人因此已经证明，与先前的实践(cuzzubbo, vaughn 等人，1999; vazquez, hafner 等人，2007)相t匕，如果在检测带标记的抗原(例如酶联抗原)的elisa中，将特异性抗体(或包含所述抗体的血清)和带标记的抗原同时与包被有结合抗体的抗igg的固体支持物一起孵育，就改进了灵敏度。
[0057]如图2所示，将阴性血清添加到阳性血清中，干扰了 tbe elisa的灵敏度。
[0058]为了更加详细地研究这一现象，利用wn ic elisa以及包被有⑶32的条，以不同浓度使用针对wn病毒ed3结构域的人单克隆抗体(hmab)(克隆4384;初始为i mg/ml，iif 抗体滴度 1:2o, 000)) (throsby, geuijen, 2006) ?
[0059]当hmab稀释在pbs中时，wn ic elisa能够检测其非常低的浓度，低至12，5 ng/ml (图3)。然而，在生理浓度的mlgg (i, 5 mg/ml)(这些浓度通常存在于对应于1:10的血清稀释度而稀释的血清样品中)存在下，仅能检测到50 ng/ml。aglgg显示了最强的作用，其明显地降低了 wn ic elisa的分析灵敏度至0.4 pg/ml。显然，aglgg，和在更低程度上，mlgg阻碍了带标记的ic与包被有⑶32的条结合。
[0060]此外，测试了经wn病毒或tbe病毒免疫的各种动物的样品反应性(图4)。使用wn ic elisa和包被有⑶32的条，对wn病毒具有高iif抗体滴度的兔血清和鸡血清产生的p/n比介于24和i之间。rf包被(空心柱)明显地灵敏度较低。类似地，使用tbe icelisa和针对tbe的ed3结构域的2种小鼠mab，仅在包被有⑶32的条上观察到阳性反应。另外，对于小鼠样品，rf包被也产生非常低的或者甚至阴性的p/n比。因此，与rf相比，包被有cd32的条对于igg显示出相当地更强的种间igg交叉反应性，其可能适用于不仅检测人抗体，而且检测啮齿类或甚至禽类来源的抗体。
[0061]讨论
在体内或在组织培养物中，相对于mlgg而言，若干低亲和力fe y r分子优先地被aglgg活化(bruhns, iannascoli等人，2009)。因此,本发明人利用生物素化mlgg和aglgg两者，测试了不同aglgg-结合分子对固相条的包被。因此,可以测试对ic elisa而言的合适的捕获分子。在首先的实验中，以对aglgg的选择性结合能力的测量代替对ic的选择性结合能力的测量。这些实验随后通过分析ic的结合能力而得以证实。
[0062]就rf而言，与igg的fe-部分上的表位(其仅在抗原结合之后才暴露)的结合，可能在免疫复合物的优先结合中起作用(hack和belmer 1986; bohlson, fraser等人，2007; duquerroy, stura等人，2007)。在体内实验中，先前的结果(与ic接触的细胞诸如巨噬细胞显示出更强的活化)，也可能归结于由受体簇所诱发的细胞膜上的空间效应。这样的效应在体分测定例如在本发明的方法中不起作用。迄今为止尚不清楚，为什么与rf相t匕，在fe y r、尤其是在⑶32中体外结合的选择性甚至更强。
[0063]令人吃惊的是，⑶32能优先结合aglgg，而且程度比clq、rf或抗人igg高得多。
[0064]用于针对tbe和wn的抗体的ic elisa对于大多数实践目的(例如对于针对病原体如病毒的抗体的存在情况的诊断)而言是足够灵敏的。可检测甚至低的iif抗体滴度和低至50 ng的特异性mab。与用iif的ic elisa的灵敏度相比，必须牢记的是icelisa仅使用只有5-6个表位的小抗原(ed3结构域)(throsby, geuijen等人，2006;sukupolv1-petty, austin等人，2007),而在iif中，仅在e蛋白上，就有20-30个表位被暴露。
[0065]文越
【权利要求】
1.fcyr在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述免疫复合物是通过将抗原添加到包含抗体的样品中而形成。
3.权利要求2的用途，其中将抗原添加到所述样品中是在feyr存在下进行或者在将所述样品和抗原与fe y r接触之前进行。
4.权利要求2或3中任一项的用途，其中所述抗原是选自酶标抗原和生物素标记的抗原的带标记的抗原。
5.前述权利要求中任一项的用途，其中所述抗体得自生物样品。
6.前述权利要求中任一项的用途，其中所述抗体得自选自以下的物种:人、山羊、绵羊、马、牛、鸟例如鸡、和哨齿类动物例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。
7.前述权利要求中任一项的用途，其中所述抗体是igg或igy抗体。
8.前述权利要求中任一项的用途，其中所述fey r是⑶16、⑶32或⑶64。
9.前述权利要求中任一项的用途，其中所述feyr是cd32或其能与免疫复合物结合的功能性片段。
10.权利要求9的用途，其中cd32或其功能性片段包含与人cd32或相应片段具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。
11.用于在体外定量测定呈免疫复合物形式的抗体的方法，所述方法包括: a)在适合于fey r与固体支持物结合的条件下，用fe y r包被所述固体支持物， b)将所述固体支持物与包含igg或igy抗体和抗原的组合物一起孵育，其中所述抗体和所述抗原能够形成免疫复合物，和 c)洗涤所述固体支持物，和然后 d)测定所述免疫复合物的量。
12.权利要求11的方法，其中所述免疫复合物是在fey r存在下形成的。
13.权利要求11或12中任一项的方法，其中所述抗原是选自酶标抗原和生物素标记的抗原的带标记的抗原。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中feyr是⑶32或其能与免疫复合物结合的功能性片段。
15.诊断受试者中病原体感染的方法，其中进行权利要求11-14中任一项的方法，其中包含igg抗体的组合物是来自所述受试者的样品，并且其中所述igg抗体能够特异性结合的抗原是得自所述病原体的抗原，例如病毒的包膜蛋白。
【文档编号】g01n33/68gk103460048sq201280009756
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月21日 优先权日:2011年2月22日
【发明者】h·施米茨, p·埃默里希-帕洛 申请人:伯恩哈德－诺策热带医学研究所