用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。
【专利说明】用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒
发明领域
[0001]本发明涉及用于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法和试剂盒。
[0002]发明背景
[0003]败血症是一种并发严重感染的临床症状并且特征在于全身炎症和广泛的组织损伤并因此成为非冠脉重症监护病房(i⑶)入院和死亡的主要原因。常见原因包括革兰氏阴性菌、葡萄球菌、和脑膜炎球菌。伴有逐渐增加的终末器官衰竭和死亡风险的炎症响应中存在三个公认阶段:败血症、严重败血症、和败血症性休克。严重败血症是伴有至少一个器官衰竭迹象的败血症。心血管衰竭通常表现为血压过低、呼吸衰竭通常表现为血氧不足、肾衰竭通常表现为少尿症、和血液衰竭通常表现为凝血病。
[0004]因此，非常需要预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的方法。
[0005]最近的研究结果表明在败血症患者中，血液内皮细胞特异性分子(endocan)水平与患者疾病的严重性和预后有关并可代表一种新的内皮细胞功能障碍标记物(scherpereel a、depontieu f、grigoriu b、cavestri b、tsicopoulos a、gentina t、jourdain m、pugin j、tonnel ab> lassalle p.endocan, a new endothelial marker inhuman sepsis.crit care med.2006feb ；34(2):532-7)。然而还未研究内皮细胞特异性分子对于预测败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的作用。
[0006]发明概述
[0007]本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。
[0008]发明详述
[0009]发明人表明血液内皮细胞特异性分子水平代表了预测败血症患者中呼吸衰竭、和/或肾衰竭、和/或血小板减少症的工具。
[0010]因此，本发明涉及一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法,包括由测量获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。
[0011]如本文所用，术语“败血症患者”是指具有严重败血症或败血症性休克的患者。
[0012]如本文所用，术语“呼吸衰竭”具有其在本领域的通常含义，定义为呼吸系统不能履行其职责，也就是说维持正常充血(富co2的静脉血转化为富o2的动脉血)。当空气和血液之间的气体交换速率不能匹配身体的代谢需求时，出现呼吸衰竭。
[0013]如本文所用，术语“肾衰竭”具有其在本领域的通常含义，描述了其中肾脏不能从血液中充分过滤毒素和废物的医学状况。
[0014]如本文所用，术语“血小板减少症”或“血小板减少”具有其在本领域的通常含义，定义为血液中血小板数量的异常减少。
[0015]如本文所用，术语“内皮细胞特异性分子”或“esm-1”具有其在本领域的通常含义，是指内皮细胞特异性分子-1，其为通过肺和肾脏中的内皮细胞表达的50-kda硫酸皮肤素蛋白多糖(lassalle p、molet s、janin a 等:esm_lis a novel humanendothelial cell-specific molecule expressed in lung and regulated bycytokines.j biol cheml996 ;271:20458-20464)，并可在人类血液中检测到(bechardd、meignin v、scherpereel a 等:characteriz at ion of the secreted form ofendothelial-cell-specific moleculelby specific monoclonal antibodies.j vascres2000 ；37:417-425 ；bechard d、gentina t、delehedde m 等:endocan is a novelchondroitin sulfate / dermatan sulfate proteoglycan that promotes hepatocytegrowth factor / scatter factor mitogenic activity.j biol chem2001 ；276:48341-48349)。
[0016]如本文所用，术语“血液样品”是指全血、血清、或血浆样品。通常，制备重症监护病房(i⑶)中患有严重败血症和败血症性休克的入院患者的血液样品。
[0017]一旦制备了来自患者的血液样品，可通过本领域任何已知的方法测量esm-1的浓度。例如，可通过使用标准电泳和免疫诊断技术，包括免疫测定例如竞争型、直接反应型、或夹层型测试来测量esm-1的浓度。这类测试包括，但不限于，western印迹；凝集试验；酶标记和介导的免疫测定，例如elisa ;生物素/抗生物素蛋白型测定；放射性免疫测定；免疫电泳；免疫沉淀反应，高效液相色谱(hplc)、尺寸排阻色谱、固相亲和色谱等。
[0018]在具体实施方案中，这种方法包含使血液样品与能够与血液样品中存在的esm-1选择性相互作用的结合配偶体接触。
[0019]结合配偶体通常可为抗体，其可为多克隆或单克隆的，优选为单克隆的。针对esm-1的多克隆抗体可根据已知方法通过向寄主动物施用适当的抗原或表位来培养，所述动物选自例如猪、牛、马、兔、山羊、绵羊、和小鼠等。本领域已知的多种佐剂可用以提高抗体生产。虽然在实施本发明中有用的抗体可为多克隆的，但优选单克隆抗体。针对esm-1的单克隆抗体可使用通过连续培养细胞系提供抗体分子的制备的任何技术来制备和分离。制备和分离技术包括但不限于最先由kohler和milstein (1975)描述的杂交瘤技术；人8_细胞杂交瘤技术(cote等，1983);和ebv-杂交瘤技术(cole等，1985)。或者，描述单链抗体制备的技术(参见例如u.s.专利号4，946，778)可适于制备抗esm-1，单链抗体。用于实施本发明的抗体也包括抗esm-1片段，包括但不限于f (ab’)2片段(其可通过完整抗体分子的胃蛋白酶消化产生)、和fab片段(其可通过还原f(ab’)2片段的二硫桥产生)。或者，可构建fab和/或scfv表达文库以允许具有所需esm-1特异性的片段的快速鉴别。例如，可使用抗体的噬菌体展示。在这种方法中，单链fv (scfv)或fab片段在适合的噬菌体，例如m13的表面上表达。简言之，去除已用蛋白质免疫的适合寄主，例如小鼠的脾细胞。vl和vh链的编码区获自那些产生所需针对该蛋白质的抗体的细胞。然后，这些编码区融合至噬菌体序列的末端。一旦噬菌体插入适当的载体，例如细菌，则该噬菌体展示出抗体片段。也可通过本领域技术人员已知的组合方法提供抗体的噬菌体展示。通过噬菌体展示的抗体片段随后也可用作免疫分析部分。
[0020]抗esm-1单克隆抗体商购自lunginnov (lille,法国)。例如,抗人内皮细胞特异性分子/ esm-1抗体mep08检测人内皮细胞特异性分子的n-末端(bechard等(2000) j.vasc.res.37:417-425 ;grigoriu 等(2006) clin.cancer res.12:4575-4582 ;maurage 等(2009)exp.neurol.68:836-844 ；leroy 等(2010)histopathology56:180-187 ;sarrazin 等(2010) j.cane.sc1.ther.2:47-52)。抗人内皮细胞特异性分子/ esm-1抗体克隆mep19检测人内皮细胞特异性分子的c-末端(bechard等(2000) j.vase.res.37 =417-425 ；grigoriu 等(2006) cl in.cancer res.12:4575-4582 ；maurage 等(2009) exp.neurol.68:836-844 ；leroy 等(2010)histopathology56:180-187 ；sarrazin 等(2010a)j.cane.sc1.ther.2:47-52 ;和 sarrazin 等(2010b)glycobiology20:1380-1388)。
[0021]在另一个实施方案中，结合配偶体可为适体。适体为就分子识别而言代表抗体替代物的一类分子。适体为能够以高亲和力和特异性识别几乎任何类型靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。这类配体可通过随机序列文库的配体指数富集的系统进化(selex, systematicevolution of ligands by exponential)来分离，如 tuerk c.和 gold l., 1990 中所描述的。随机序列文库可通过dna的组合化学合成来获得。在该文库中，每个成员为最终化学改性的独特序列的线性低聚体。可能的改性、这类分子的用途和优势已在jayasena s.d.,1999中综述。肽适体由通过平台蛋白展示的构象受限抗体可变区组成，所述平台蛋白例如大肠杆菌硫氧还蛋白a(e.coli thioredoxin a),其通过两种混合方法选自组合文库(colas 等 1996)。
[0022]本发明的结合配偶体例如抗体或适体，可用可检测分子或物质，例如荧光分子、放射性分子或任何其它本领域已知的标记物来标记。标记物是本领域已知的，其通常(直接或间接地)提供信号。
[0023]如本文所用，就抗体而言,术语“标记的”意欲包括通过将可检测物质,例如放射性试剂或荧光团(例如荧光素异硫氰酸酯(fitc)或藻红蛋白(pe)或吲哚菁(cy5))偶合(即物理连接)至抗体或适体而直接标记抗体或适体，以及通过与可检测物质反应而间接标记探针或抗体。可用放射性分子通过本领域已知的任何方法标记本发明抗体或适体。例如放射性分子包括但不限于用于核素研究的放射性原子例如1123、1124、inlll、rel86、rel88。
[0024]前述测试通常包括将结合配偶体(即抗体或适体)结合于固体载体中。可用于本发明实践的固体载体包括物质例如硝化纤维(例如以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如片或微量滴定孔)；聚苯乙烯乳胶(例如珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活性珠、磁响应珠等。
[0025]更具体地，可使用elisa方法，其中微量滴定板的孔包被有一组针对esm-1的抗体。然后将含有或怀疑含有esm-1的血液样品加入到包被的孔中。培养足以允许形成抗体-抗原复合物的时期之后，可洗涤板以去除未结合部分并加入可检测标记的第二结合分子。允许该第二结合分子与任何捕获的样品标记物蛋白反应、洗涤板并且使用本领域所熟知的方法检测第二结合分子的存在。
[0026]通常，elisa试剂盒商购自 lunginnov (lille,法国):endomarkhl ? (elisa 试剂盒以检测人内皮细胞特异性分子)。其它elisa方法描述于:bechard等(2000) j.vasc.res.37:417-425 ；grigoriu 等(2006)clin.cancer res.12:4575-4582 ；leroy 等(2010)histopathology56:180-187 ；sarrazin 等(2006)bba reviewsl765:25-37 ；sarrazin 等(2010a)j.cane.sc1.ther.2:47-52 ；scherpereel 等(2003)cancer res.63:6084-6089 ；scherpereel 等(2006)crit.care med.34(2):532_537。
[0027]测量esm-1的浓度(使用或不使用免疫测定基方法)也可包括蛋白质的分离:基于蛋白质分子量的离心；基于质量和电荷的电泳；基于疏水性的hplc ;基于尺寸的尺寸排阻色谱；和基于蛋白质对于所用特定固相的亲和力的固相亲和色谱。一旦分离，esm-1可基于已知的“分离谱图”例如该蛋白质的保留时间来鉴别并使用标准技术测量。或者，可通过例如质谱仪检测和测量分离的蛋白质。
[0028]本发明方法特别适用于预测器官衰竭，特别是患有严重败血症和败血症性休克患者入住icu之后48-72小时的呼吸衰竭。
[0029]本发明方法可进一步包括将esm-1浓度与预定阀值相比较的步骤。所述比较指示了所述患者是否具有患呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险。例如，预定阀值代表健康患者，即不会出现器官衰竭的患者中测量的平均浓度。通常，比健康患者中测定的预定阀值低的浓度预示着器官衰竭，更具体地为患有严重败血症和败血症性休克患者入住icu之后48-72小时的呼吸衰竭。
[0030]因此，本发明方法可用于分类感染了败血症的患者并且然后可用于在重症监护病房中选择正确的治疗。例如，具有高的出现呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的风险的患者可接受比具有弱风险的患者更加强烈的治疗和关注。因此，这种方法可帮助医生做出治疗处理的选择，其可相应地由向患者施用精确药物组成。治疗成本可因此适合于入住重症监护病房的患者，因此本发明方法可代表一种用于管理该类病房的有用工具。最后，本发明方法可用于监控感染了败血症的患者的治疗结果。
[0031]本发明的进一步目标涉及esm-1作为败血症患者中呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的标记物的用途。
[0032]本发明的又一个目标涉及用于预测具有选自呼吸衰竭、肾衰竭或血小板减少症的器官衰竭的风险的试剂盒，包含用于测量esm-1浓度的装置。试剂盒可包括抗体、或如上所述的一组抗体。在具体实施方案中，如前所述标记抗体或一组抗体。试剂盒也可含有其它适于包装的试剂和特定检测方案所需的物质，包括固相基质(如果适用的话)和标准品。试剂盒也可含有用于检测其它器官衰竭标记物，例如c反应蛋白(crp)或降钙素原(pct)、il-6、tnfa 的装置。
[0033]本发明将通过以下附图和实施例来进一步阐明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1.与健康志愿者(t6moin)相比，严重败血症(sepsis severe)和败血症性休克(choc septique)患者中内皮细胞特异性分子血衆水平的增加o:ρ〈0.05)。
[0035]图2.内皮细胞特异性分子和呼吸衰竭。a:无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(0)，48小时处ali / ards(i) (*:ρ〈0.05)。b:无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(o)，72小时处ali / ards(i) (*:ρ<0.05)。
[0036]图3.内皮细胞特异性分子和呼吸严重性。a:无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(o)，48小时处ali (ali)、ards(sdra)。b:无呼吸衰竭的患者中内皮细胞特异性分子的水平(o)，72小时处ali (ali)、ards (sdra)。[0037]图4.在48小时存在呼吸衰竭的入选时内皮细胞特异性分子血浆水平的roc曲线。auc:曲线下面积。图下表格显示了取决于内皮细胞特异性分子血浆水平值的计算的灵敏度和特异性。灰色病例确定了对于最佳灵敏度/特异性值(分别为84.62%,100% )的内皮细胞特异性分子截止(3，55ng / ml)。
【具体实施方式】
[0038]实施例1:
[0039]高水平血液内皮细胞特异性分子选择患有呼吸衰竭(通过pa02 / fi02〈200定义)、和/或肾衰竭(通过肌酐>20mg / ml定义)、和/或血小板减少症的败血症患者(表i)。
[0040]
【权利要求】
1.一种用于预测败血症患者具有选自呼吸衰竭、肾衰竭和血小板减少症的器官衰竭的风险的方法，包括由测量获自所述败血症患者的血液样品中内皮细胞特异性分子的浓度组成的步骤。
【文档编号】g01n33/68gk103477229sq201280009735
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年1月20日 优先权日:2011年1月21日
【发明者】p·拉萨尔 申请人:国家医疗保健研究所, 里尔法律与医疗卫生第二大学, 里尔大学地区医院中心