用于预测hiv疾病发展的方法
【专利摘要】用于预测感染有hiv-1病毒的患者中hiv-1感染的发展的体外方法，包括步骤：a)测量从所述患者收集的样品中直接对抗seq?id?n°2的3s肽的抗体的水平，b)将在步骤a)测量的抗-3s抗体的水平与指示hiv-1感染的发展的抗-3s抗体水平的参考值相比较。
【专利说明】用于预测hiv疾病发展的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及预测hiv疾病的领域。
【背景技术】
[0002]人类被hiv病毒感染通常通过血浆样品中抗hiv抗体的免疫检测来诊断。如今众多的hiv elisa测试试剂盒是可商购的。通常，已知的hiv elisa测试试剂盒使用预先包被有hiv抗原混合物的聚苯乙烯微孔条，所述hiv抗原可以由在大肠杆菌中表达的重组hiv抗原，例如重组hiv-lgp41、gpl20和hiv_2gp36糖蛋白组成。
[0003]一旦诊断个体被hiv病毒感染，应该进行hiv疾病的发展的随访，包括为了确定何时开始抗逆转录病毒药物治疗(art)。这需要对所述个体进行hiv分期方法。
[0004]hiv疾病分期和分类系统是为临床医生和患者提供临床管理的基本信息的关键工具。目前使用两种主要的分类系统，分别为(i)系统，世界卫生组织(who)临床分期和疾病分类系统和(ii)美国疾病控制和预防(cdc)分类中心。
[0005]hiv/aids的who临床分期和疾病分类系统主要基于测定临床事件的发生，而不强制性要求实验室测试的结果。who临床分期系统已经广泛用于资源有限的农村，并被证实在第一水平和转诊水平的机构中是实用和有用的。
[0006]⑶c疾病分期系统通过⑶4 t淋巴细胞(⑶4)计数和通过存在特定的hiv-相关病症来评价hiv疾病的严重性。根据⑶c分期系统，aids的定义包括其中⑶4计数小于200个细胞/μ 1、或者⑶4百分比(所有的淋巴细胞内)小于14%的所有的hiv-感染的个体，以及具有某些hiv-相关病症和症状的那些。因此，根据cdc系统，cd4计数由用于评价hiv阶段和预测、以及用于监控aids发展和机会性疾病的风险的标准实验室测试组成。⑶4细胞计数还在有症状的患者中规划鉴别诊断、和在决定开始抗逆转录病毒治疗(art)以及开始预防机会感染方面为医师提供指导。
[0007]在未经治疗的hiv感染中，hiv复制通常每日产生亿万个新的hiv拷贝。血浆hivrna(病毒载量)测试量化血衆中的hiv病毒载量量。在通向病毒载量监控的区域,病毒载量是用于监控接受art的患者中的治疗响应、以及连同⑶4细胞计数，评价hiv发展的标准工具(特别参见 mellors 等，1996，science，272 (5265)卷:1167-170)。
[0008]aids是在全世界影响超过3千万人、其中每年有超过200万的新增感染人群的大范围流行病。迄今为止，aids仍然是致命性疾病，其在2009年杀死超过200万人。
[0009]除对多种不同疗法或对不断改善现存的art的可用性的需要，还有着对多种分期或预测方法的不断的需要，从而为医师提供精确或辅助工具，其目的尤其是为开始art确定适当的时期、以及帮助他们正确地适应基于个案的疾病发展特征的治疗。
[0010]发明简述
[0011]本发明涉及用于预测感染有hiv-1病毒的患者中hiv-1疾病的发展的体外方法，包括步骤:
[0012]a)测量从所述患者收集的样品中直接对抗3s肽的抗体的水平，[0013]b)将在步骤a)测量的抗体水平与指示hiv-1疾病的发展的参考值相比较。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1是描绘kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/ μ i和抗-3s抗体水平分别高于(上曲线η° i)或低于(下曲线η° 2)预定参考值(这里，预定参考值，或“截止”值为50)的hiv-1-感染患者的120个月时期的存活时间。横坐标=hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:存活者分布(100%= i个单位)。
[0015]图2是描绘kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/mm3和抗-3s抗体水平分别高于(上曲线n° i)或低于(下曲线n° 2)预定参考值(这里，预定参考值，或“截止”值为50)的hiv-1-感染患者的36个月时期的存活时间。横坐标:hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:存活者分布(100%= i个单位)。
[0016]图3是描绘kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/mm3和病毒载量水平分别低于(上曲线n° i)或高于(下曲线n° 2)预定参考值(这里，病毒载量参考值，或“截止”值为41og)的hiv-1-感染患者的36个月时期的存活时间。横坐标:hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:存活者分布(100%= i个单位)。
[0017]图4阐明kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/mm3和分为四类，分别为(i)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量低于或等于预定参考值(< =41og)(曲线n° i)，(ii)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量高于预定参考值(>41og)(曲线n° 2)，(iii)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(<=50)和病毒载量低于或等于预定参考值(<=41og)(曲线n° 3),和(iv)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(< =50)和病毒载量高于预定参考值(> 41og)(曲线n° 4)的患者的36个月时期的存活时间。横坐标=hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:活人的比率(100%=i个单位)。
[0018]图5阐明kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/mm3和分为四类，分别为(i)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量低于或等于预定参考值(< =41og)(曲线n° i)，(ii)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量高于预定参考值(>41og)(曲线n° 2)，(iii)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(<=50)和病毒载量低于或等于预定参考值(<=41og)(曲线n° 3)，和(iv)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(< =50)和病毒载量高于预定参考值(> 41og)(曲线n° 4)的患者的120个月时期的存活时间。横坐标=hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:活人的比率(100%=i个单位)。
[0019]图6阐明kaplan-meier曲线的图，显示⑶4计数大于200个细胞/mm3和分为四类，分别为(i)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量低于或等于预定参考值(< =41og)(曲线n° i)，(ii)抗-3s抗体高于预定参考值(> 50)和病毒载量高于预定参考值(>41og)(曲线n° 2)，(iii)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(<=50)和病毒载量低于或等于预定参考值(<=41og)(曲线n° 3),和(iv)抗-3s抗体低于或等于预定参考值(< =50)和病毒载量高于预定参考值(> 41og)(曲线n° 4)的无aids患者的120个月时期的存活时间。横坐标=hiv-1感染日期之后的时期，以月表示。纵坐标:活人的比率(100%= i个单位)。[0020]发明详述
[0021]本发明提供指示hiv-1-感染患者中hiv-1疾病的发展状况的新颖的独立标记物。本发明提供使用所述新颖的独立标记物确定hiv-1疾病的发展的预测的新颖的方法。
[0022]根据本发明已经发现，在来自测试的hiv-1-感染的个体的样品中测定的对抗特异性hiv-1-来源的肽(“3s肽”)的抗体水平指示所述个体的-1疾病的发展状况。
[0023]由源自来自hiv-1病毒的gp41糖蛋白的肽组成的所述3s肽本身是已知的。3s肽在本领域中被证实诱导nkp44l蛋白质在⑶4t细胞中的膜表达。据信nkp44l在⑶4t细胞表面上的表达在hiv-1-1感染期间⑶4t细胞通过nk细胞激活而溶解以及随后直接对抗3s肽的特异性抗体可以影响疾病进程中起关键作用(参见vieillard等,2005, proc.natl.acad.sc1.usa, vol.102:10981-10986)。
[0024]本领域也已证实，抗-3s抗体在属于称为alt的非常特定的患者群体的一些hiv-1-感染患者中被检测到，所述群体唯一包含具有无症状长期存活者的罕见表型的hiv-1-感染患者(参见 vieillard 等，2006，aids, vol.20(14):1795-1804)。vieillard等(2006)证实了患者的所述alt群体中存在(i)cd4 t细胞数目减少和(ii)抗-3s抗体水平降低之间的相关性。vieillard等(2006)还证实了在这些高度特异性hiv感染个体中，抗-3s抗体的存在与高水平的cd4 t细胞有关。
[0025]vieillard等(2006)得出结论，抗-3s抗体的存在可能在抑制nkp44l表达和⑶4对nk溶解的灵敏度方面影响疾病进程。此外，vieillard等(2006)表明，血清中抗-3s抗体的存在有助于控制cd4细胞计数。这些作者注意到，cd4t细胞的全面贫化与抗-3s抗体的消失密切相关。这些作者还表明抗-3s抗体的产生可能可以有助于减慢cd4t细胞的逐渐贫化。
[0026]根据本发明目前已经发现，抗-3s抗体的水平由hiv-1-感染患者中hiv-1疾病的发展状况的可靠标记物构成。
[0027]意外地，发明人表明，抗-3s抗体的水平可靠地指示hiv-1疾病发展。
[0028]此外，本文已经证实，抗-3s抗体水平由指示hiv-1疾病发展的标记物构成，即使当所述标记物单独使用。
[0029]进一步地，本文已经证实，抗-3s抗体水平由与其他通常使用的hiv-1预测标记物(包括⑶4计数预测标记物和病毒载量预测标记物)无关的hiv-1疾病发展标记物构成。
[0030]本文规定，根据本发明的结果从hivl-感染患者的普通群体，即hiv-1血清反应阳性的个体群体中获得，而不是从如vieillard等(2006)所研究的alt群体的具有无症状长期存活者的罕见表型的患者群体中获得。
[0031]根据定义，hiv感染在无症状长期存活者个体中的发展机制与可以从hiv感染受试者的普通群体中发现的机制不同。这再一次通过本文公开的发明人的发现来完整地阐明。
[0032]根据本发明已经发现，在hiv-1-感染患者的普通群体中，(i)抗-3s抗体的水平和
(ii)⑶4 t细胞的水平之间没有相关性，与已经从alt患者群体中获得的vieillard等的发现相反。发明人的发现再次阐明了本领域技术人员不能预期从无症状长期存活的hiv感染个体中获得的数据中取得在hiv感染受试者的普通群体中了解hiv感染的发展的益处。
[0033]此外，如上所指出，据信在本领域中，在特异性alt患者群体中，抗-3s抗体的水平与⑶4t细胞计数强相关。回想起vieillard等(2006)的之前的结果将已至多教导了本领域技术人员，因为在抗-3s抗体的水平与cd4t细胞计数之间发现强相关，已经发现(i)hiv-1疾病预测标记物，即⑶4细胞计数和(ii) hiv-1-感染患者的生物参数，即抗-3s抗体的水平之间的强依赖性。甚至在本领域技术人员将已考虑vieillard等(2006)的结果的假定认可下，通过cd4细胞计数和抗-3s抗体水平所预期带来的之前公开的信息的冗余性将已阻止本领域技术人员来研究抗-3s抗体水平可能由hiv-1疾病发展的预测标记物构成的可能性。
[0034]在特定的方面，本发明提供用于预测hiv-1疾病发展严重性的方法，该方法尤其可用于监控aids的进程，以及用于监控抗逆转录病毒治疗的治疗效率。
[0035]本发明涉及用于预测感染有hiv-1病毒的患者中hiv-1疾病的发展的体外方法，包括步骤:
[0036]a)测量从所述患者收集的样品中直接对抗seq id n。2的3s肽的抗体的水平，
[0037]b)将在步骤a)测量的抗-3s抗体的水平与指示hiv-1疾病的发展的抗-3s抗体水平的参考值相比较。
[0038]如本文实施例所示，在hiv-1-感染个体的普通群体中的抗-3s抗体的水平(并非其存在)和hiv-1疾病的发展的预测之间已经发现相关性。
[0039]如本文所述，“hiv-1疾病”基本上包括已被hiv-1病毒感染的个体所经受的所有生理病症，从病毒感染事件的时间开始直到个体死亡的日期，不管个体死亡是否是病毒感染事件的直接或间接结果。回想起个体被hiv-1病毒感染引起慢性疾病状态，其逐渐引起免疫系统的效力降低并使得hiv-1-感染个体对机会感染和肿瘤敏感。因此，hiv-1疾病包括初次感染(或急性感染)时期、血清转化时期、无症状阶段时期、hiv-1有症状疾病的早期和中期、以及hiv-1疾病(也称为aids)的晚期。
[0040]根据本发明，直接对抗seq id n。2的肽的抗-3s抗体包括特异性结合具有包含肽序列nh2-swsnks-c00h(seq id n0 i)的氨基酸序列的参考多肽的抗体。这些抗体在本说明书中一起称为“抗-3s抗体”。它也可以对应于结合具有与seq id n0 2的序列密切相关的氨基酸序列的肽的抗体。具有与seq id n0 2密切相关的序列的肽包括包含选自seq id n0 3和seq id n0 4的氨基酸序列的肽，其包括具有长度为16个氨基酸残基并包含选自seq id n0 3和seq id n0 4的氨基酸序列的肽，例如，其包括(i)seq id n0 2的肽的变体，其中11位的氨基酸残基丝氨酸被苏氨酸残基替代，和(ii)seq id n0 2的肽的变体，其中10位的氨基酸残基赖氨酸被精氨酸残基替代。
[0041]如本文所述，直接对抗3s-肽的抗体包括结合seq id n° 2的肽的抗体。
[0042]根据本发明，抗-3s抗体优选由结合3s肽的多克隆抗体组成，且其包含于从hiv感染个体中收集的样品中。
[0043]优选地，所述3s-肽由由seq id n。2的氨基酸序列组成的肽组成。
[0044]如本文所述，hiv疾病预测标记物的“水平”由样品，例如从hiv感染患者中收集的样品中的所述预测标记物的数量值组成。在一些实施方式中，所述数量值不由实际测量的绝对值组成，而由由考虑所使用的试验形式所产生的信噪比、和/或考虑用于增加各个试验中hiv疾病标记物的水平的测量的复现性的校准参考值产生的最终值组成。在一些实施方式中，hiv疾病预测标记物的“水平”用任意单位表示，因为重要的是比较相同种类的任意单位:(i)各个试验，或(ii)各个hiv感染患者，或(iii)对于相同患者不同时期所进行的试验，或(iv)患者样品中测量的hiv预测标记物水平和预定参考值(其在此也可以称为“截止”值)之间。
[0045]事实上，无论何种数值单位用于表示样品中抗-3s抗体的水平，测定值反映了所测试的样品所包含的抗-3s抗体的量，或最优选地所述样品中抗-3s抗体的浓度。
[0046]同样是说明性的，hiv病毒载量预测标记物可以用反映患者的测试样品中所包含的hiv基因组的拷贝数目、或反映测试患者样品中的hiv基因组拷贝的浓度的数值单位来表不。
[0047]类似地，其他的hiv预测标记物可以用分别反映(i)测试样品中⑶4t细胞的数目或其浓度，和(ii)测试样品中所存在的总淋巴细胞中的cd4t细胞的百分比的数值单位来表不。
[0048]如本文所述，从患者收集的样品包括预期包含抗体的任何体液,和主要为血液和血液来源的物质。根据本发明，从患者收集的样品包括全血样品、血清样品和血浆样品。
[0049]如本文实施例所示，本发明的体外方法允许测定hiv感染患者中免疫抑制状态的早期发生或延迟发生的可能性。因而，可以实施本发明预测hiv疾病发展的体外方法，目的在于测定用于跟踪hiv感染患者的临床参数然后用于决定开始抗逆转录病毒治疗的时机的时间间隔期间。
[0050]如同也在本文实施例中所示，本发明`体外方法允许测定由于病毒感染已经经历免疫抑制状态的hiv感染患者中hiv疾病发展的预测。换句话说，本发明体外方法允许区分(i)具有较早进入hiv疾病的有症状阶段的高可能性的hiv感染的免疫抑制的患者，和(?)具有较早进入hiv疾病的有症状阶段的低可能性的hiv感染的免疫抑制的患者。
[0051]此外，本文实施例表明，本发明的用于预测hiv疾病的发展的体外方法允许测定
(i)具有长期存活的高可能性的hiv感染患者，和(ii)具有长期存活的低可能性的hiv感染患者。
[0052]在本发明的步骤a)，抗-3s抗体的水平可通过本领域技术人员熟知的任何抗体检测方法来测量。因此，抗-3s抗体水平可通过任何种类的免疫测定来测量，包括但不限于，elisa、放射免疫测定、荧光免疫测定、免疫亲和色谱、免疫沉淀等。
[0053]在某些实施方式中，抗-3s抗体水平通过免疫吸收剂测定(其包括elisa法)来测量。
[0054]在步骤a)，抗-3s抗体水平用指示实际信号的值来表示，所述信号直接或间接地通过(i)在抗体检测方法中用作诱饵的3s肽和(ii)所测试的患者样品中存在的抗-3s抗体之间形成的复合物产生。
[0055]如进行抗体检测方法例如免疫测定如elisa时所常见的，信号水平(即抗_3s抗体水平)用任意单位(au)来表示。任意单位通常在减去本底噪声信号后测定，所述本底噪声信号从与患者样品(例如血清样品或血浆样品)的种类相同的、已知从抗-3s抗体中去除的样品中测量。通常，任意单位在校准抗体检测方法之后、采用一系列校准标准(例如一系列样品，其中各样品包含已知量的抗-3s抗体)来测定。
[0056]在本发明体外hiv疾病预测方法的步骤b)，将在步骤a)测量的抗-3s抗体的水平的量化值与指示hiv疾病预后的预定参考值相比较。所述预定参考值是“指示hiv疾病预后”，因为它允许区分(i)对在步骤a)测量的高于所述参考值的值的hiv疾病发展的“良好”预后和(ii)对在步骤a)测量的低于所述参考值的值的hiv疾病发展的“差”预后。
[0057]如本文实施例所公开，通过进行从已经跟踪多种相关的临床参数包括存活时间的一大群hiv感染个体中收集的样品中获得的抗-3s抗体水平值的kaplan-meier曲线，本发明人测定了允许区分(i)具有有利结果，包括延迟的自发性hiv疾病发展和长的存活时间的患者和(ii)具有差的结果，包括非延迟的自发性hiv疾病发展和短的存活时间的患者的抗-3s抗体水平值。
[0058]说明性地，当使用本文实施例公开的elisa测试形式时，也可以称为“截止”值的预定参考值为50。因此，使用实施例公开的elisa测试形式，将其中根据本发明的体外方法的步骤a)测量的抗-3s抗体水平值小于50的从hiv感染患者收集的样品分类为具有非有利结果的患者。相反，将其中根据本发明的体外方法的步骤a)测量的抗-3s抗体水平值大于50的从hiv感染患者收集的样品分类为具有有利结果的患者。
[0059]为了进行本发明体外hiv疾病预测方法，也可以称为“截止”值的用于在本发明步骤b)进行比较的参考值可以如下文所述测定。用于抗-3s抗体预测标记物的参考(“截止”)值可通过进行包括以下步骤的方法来预定:
[0060]a)提供一批来自hiv感染患者的样品；
[0061]b)为步骤a)所提供的各个患者样品提供与相应的hiv感染患者的实际临床结果有关的息；
[0062]c)提供一系列抗-3s抗体水平的任意量化值；
[0063]d)量化在步骤a)所提供的收集物中所包含的各个患者样品中的抗-3s抗体水平;
[0064]e)为步骤b)所提供的一个具体的任意量化值将所述患者样品分为两组，分别是:
[0065](i)第一组，其包含患者样品，所述样品具有抗-3s抗体水平低于所述系列的量化值中所包含的所述任意的量化值的量化值；
[0066](ii)第二组，其包含患者样品，所述样品具有抗-3s抗体水平高于所述系列的量化值中所包含的所述任意的量化值的量化值；其中获得两组患者样品的所述具体的量化值，其中各组的患者样品单独列举；
[0067]f)计算(i)在步骤d)获得的所述生物标记物的量化值和(ii)在步骤e)中定义的第一组和第二组所包含的血清/血浆样品所来源的患者的实际临床结果之间的统计显著性；
[0068]g)通过步骤e)和f)测试各种任意值；
[0069]h)将所述参考值(“截止”值)设置为在步骤g)观察到最高统计显著性(最显著的)所获得的任意量化值。
[0070]如上所公开，所述方法允许设置“截止”值，允许区分坏的和好的结果预测。
[0071]如本说明书所述，且如本文实施例所示，(i)坏的结果预测包括aids临床症状的发作在感染hiv的时间之后的6-72个月时期内发生，以及对于cd4t细胞计数低于500个细胞/mm3的患者(其包括cd4t细胞计数低于200个细胞/mm3的患者)的短的存活时期的高度可能性，而(ii)好的结果预测包括aids临床症状的发作在感染hiv的时间之后的6_72个月时期内发生，以及对于cd4t细胞计数低于500个细胞/mm3的患者(其包括cd4t细胞计数低于200个细胞/mm3的患者)的长的存活时期的低的可能性。
[0072]在某些用于测定上述截止值的方法的步骤b)的优选的实施方式中，所述与hiv感染患者的实际临床结果有关的信息选自:(i)无aids存活(afs)的持续时间和(ii)cd4t细胞计数低于500个⑶4细胞/mm3或低于200个⑶4细胞/mm3 (tcdb)的患者的存活时间。
[0073]如本文实施例所示，当使用抗-3s抗体水平作为预测标记物时，hiv疾病预测的准确度可通过将所述预测标记物与一种或多种本身已知的hiv预测标记物，例如hiv病毒载量结合来进一步改善。
[0074]如实施例所示，抗-3s抗体水平的hiv疾病预测准确度明显高于其他已知的hiv预测标记物之一即病毒载量的预测准确度。然而，实施例也表明，本发明体外hiv疾病预测方法的预测准确度也通过将(i)病毒载量标记物和(ii)抗-3s抗体标记物的水平结合来改善。
[0075]因此，在本发明用于hiv疾病预测的体外方法的一些实施方式中，所述方法进一步包括步骤:
[0076]i)测量从所述患者收集的所述样品中的hiv病毒载量，和
[0077]2)将步骤i)测得的病毒载量值与指示hiv疾病发展的参考值相比较。
[0078]在上述方法的实施方式中，病毒载量可通过本领域技术人员熟知的任何一种常规技术来测量。说明性地，病毒载量可通过使用jennings等所公开的方法测量(2005，j clinmicrobiol，vol.43 (12):4950-4956)。事实上，病毒载量量化的参考值可通过使用与本文描述的相同方法来测定，用于计算抗-3s抗体水平的预定参考值(或“截止”值)。
[0079]如可被本领域技术人员容易地理解，病毒载量标记物的预定参考值(或“截止”值)可取决于所使用的病毒载量测试形式而改变。
[0080]说明性地，病毒载量标记物的41og的预定参考值(或“截止”值)已用于进行本发明体外hiv疾病预测方法的实施例中。
[0081]不希望束缚于任何具体理论，发明人相信，本发明的体外hiv疾病预测方法可通过将抗-3s抗体预测标记物与一种或多种其他的hiv疾病预测标记物结合来进行。所述一种或多种hiv疾病预测标记物可选自(i)hiv病毒载量，(ii)cd4t细胞绝对计数和(iii)⑶4 t淋巴细胞的百分比。
[0082]根据这些实施方式，用于预测hiv疾病的发展的体外方法可以包括步骤:
[0083]a)测量从hiv感染患者收集的样品中抗_3s抗体和至少一种其他的hiv疾病预测标记物的水平,和
[0084]b)对于步骤a)所测量的各个hiv疾病预测，将所得标记物值所述预测标记物的参考值相比较。
[0085]在优选的实施方式中，所述一种或多种其他的hiv疾病预测标记物选自(i)hiv病毒载量，(ii)cd4t细胞绝对计数，(iii)cd4t细胞的百分比和(iv) cd4 /cd8 t淋巴细胞的比率。这些包括以下hiv疾病预测标记物的组合:
[0086]-与上述标记物⑴相结合的抗-3s抗体水平，
[0087]-与上述标记物(ii)相结合的抗-3s抗体水平，
[0088]-与上述标记物(iii)相结合的抗-3s抗体水平，
[0089]-与上述标记物(iv)相结合的抗-3s抗体水平，[0090]-与上述标记物⑴和(ii)相结合的抗-3s抗体水平，
[0091]-与上述标记物⑴和(iii)相结合的抗-3s抗体水平，
[0092]-与上述标记物⑴和(iv)相结合的抗-3s抗体水平，
[0093]-与上述标记物(ii)和(iii)相结合的抗-3s抗体水平，
[0094]-与上述标记物(ii)和(iv)相结合抗_3s抗体水平，
[0095]-与上述标记物(iii)和(iv)相结合的抗_3s抗体水平，
[0096]-与上述标记物(i)、(ii)和(iii)相结合的抗_3s抗体水平，
[0097]-与上述标记物⑴、(ii)和(iv)相结合的抗-3s抗体水平，
[0098]-与上述标记物(ii)、(iii)和(iv)相结合的抗_3s抗体水平，
[0099]-与上述标记物(i)、(iii)和(iv)相结合的抗_3s抗体水平，
[0100]-与上述标记物(i)、(ii)、(iii)和(iv)相合的结抗_3s抗体水平。
[0101]取决于步骤a)测量的各个标记物值是否高于或低于它们在步骤b)比较的各自的参考值，确定hiv疾病发展的“好的”预测或hiv疾病发展的“坏的”预测。事实上，(i)将抗-3s抗体值高于预定值分类为“好的”预测，而(ii)将病毒载量值高于预定参考值分类为“坏的”预测参数。
[0102]事实上，步骤b)的结果包括其中(i)对于至少一种测试的hiv预测标记物，将在步骤a)测量的标记物值分类为所述标记物的“坏的”预测(即所述标记物可标记为“低的”)和(ii)对于至少一种测试的其他hiv预测标记物，将在步骤a)测量的标记物值分类为所述标记物的“好的”预测(即所述标记物可标记为“高的”)的情况。在这些情况中，hiv疾病发展的预测通过考虑“高的”标记物和“低的”标记物的数目和任选地各自的统计权重来确定。在一些实施方式中，所测试的各标记物的测定值通过用具体化其在hiv疾病发展的预测中的统计显著性的权重的数值因子影响所述测量标记物值来平衡。
[0103]在其中抗-3s抗体预测标记物与一种或多种其他的hiv疾病预测标记物结合的本发明用于预测hiv疾病发展的方法的实施方式中，步骤b)通过在数学上整合所测试的各个hiv预测标记物在步骤a)测量的值和其与各相应的参考值的比较，从而产生所得的复合hiv疾病预测标记物的单一预测值(例如“坏的”预测或“好的”预测)。整合两个或更多个标记物的组合的复合标记物的产生是本领域技术人员所熟知的。
[0104]说明性地，hiv疾病发展的复合预测标记物可由其中所包括的各个单个预测标记物的线性组合而产生，其中逻辑回归可用于估计复合预测标记物内各单个预测标记物的各自权重。或者，适当的数学模型可用于制定所使用的标记物组合的预测值。
[0105]本发明通过提供疾病发展的精确的预测指示器来进一步提供用于监控hiv感染的疗法的效力的方法。这种监控方法对于(i)识别可能的治疗药物和(ii)监控经受这些药物的治疗的患者而言均是非常重要的。
[0106]特别地，本发明涉及用于监控疗法的效力的方法，包括步骤:
[0107]a)通过向需要治疗的hiv感染患者施用包含一种或多种抗逆转录病毒剂的药物组合物来实施治疗，和
[0108]b)在从所述患者收集的样品上实施本文描述的用于预测hiv疾病发展的体外方法，和
[0109]c)如有必要，适宜地改变步骤a)实施的治疗。[0110]在一些实施方式中，如果测定“好的”预测，例如长的存活时间且不进入aids阶段的高度可能性，则继续步骤a)进行的疗法。
[0111]在一些实施方式中，如果测定“坏的”预测，例如长的存活时间且不进入aids阶段的低可能性，则改变疗法(例如施用较高的剂量或一种或多种活性成分被更有效的活性成分替代)。
[0112]在具体的方面，本发明预期向hiv感染个体施用有效量的抗病毒剂(或抗病毒剂的组合)并监控治疗结果。
[0113]如同之前已经在本说明书中指出，用于预测hiv疾病发展的体外方法优选通过已知的免疫检测方法来进行。本文的实施例阐明了通过酶联免疫吸附测定(其是非常常用的免疫检测方法)进行本发明体外hiv预测方法的实施方式。如同其他的免疫检测方法，elisa可作为非竞争性免疫测定或作为竞争性免疫测定来进行。
[0114]在非竞争性elisa中，非标记抗原(例如3s肽)结合固体支持体或反应容器，例如微量滴定板或生物芯片的表面。
[0115]然后，将生物样品(例如从hiv感染患者收集的样品)与结合反应容器的抗原组合，并允许生物样品中存在的抗体(例如从hiv感染患者收集的样品中存在的抗-3s抗体)结合固定在固体支持体上的抗原，从而形成免疫复合物。
[0116]形成免疫复合物之后，去除过量的生物样品，并洗涤容器以去除非特异性结合的抗体。然后将免疫复合物与适当的酶标记的抗免疫球蛋白(其也可称为“次级抗体”)反应。所述次级抗体与免疫复合物中的抗体(例如抗-3s抗体)反应，而不与结合反应容器的其他抗原反应。特异性结合人抗体的次级抗体是本领域技术人员所熟知的，并且可例如从 sigma chemical c0.(st louis, mo, usa)商购。
[0117]第二洗涤步骤之后，添加酶底物。与刺激抗体连接的酶催化将底物转化为可检测产物的反应。当存在过量抗原时，产物的量直接与患者样品中存在的抗体(也称为“初级抗体”)的量成正比。
[0118]在一些实施方式中，产物有荧光性或发冷光，其可采用本领域熟知的技术和设备来测量。在一些实施方式中，酶反应导致酶底物转化为有色产物，其可用分光光度法测量。
[0119]可连接次级抗体的典型的酶包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、碱性磷酸酶、半乳糖苷酶和脲酶。
[0120]为进行elisa，适当的固体支持体包括有机和无机聚合物，例如右旋糖酐、天然或改性纤维素、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。
[0121]为使用3s肽通过抗-3s抗体的免疫检测来进行根据本发明的hiv疾病发展的体外预测，所述3s肽可通过(i)化学合成或(ii)例如在用表达盒转化的(最终插入重组支持体，即重组质粒)、编码所述3s肽的大肠杆菌细胞中的重组表达。
[0122]本发明进一步以以下实施例来说明，但不以任何方式限制于以下实施例。
【具体实施方式】
[0123]实施例1:抗-3s抗体的水平鉴别为hiv疾病发展的预测标记物
[0124]a.材料和方法
[0125]a.1.患者[0126]从1988年开始的anrs ser0c0/hem0c0群体募集来自21所医院和个体医生网络的hiv感染成人。研究经伦理委员会批准且给予所有受试者书面的知情同意书。患者在入选时接受全面的临床和实验室检查，然后根据其临床状况每3或6个月观察。所有aids定义的疾病在医学档案中核实并由参与医师评价。未能随访的患者的临床状况通过以国家aids注册通过互相校核来评价。将入选和每6个月视察时收集的血清存储在零下180°c。
[0127]在该研究中，合格的患者具有已知的血清转化日，在感染后24个月内且在1996年之前被包括在群体中，并具有从入选开始的可用的冻存血清样品。hiv血清转化通过阴性和阳性hiv抗体测试之间的小于24个月的间隔来记录，或不完全的western印迹、随后通过完全的western印迹来记录。感染日期定义为不完全western印迹的日期减去i个月，或初级有症状感染的日期减去15天，或两次测试之间的中点(hubert2000)。具有可用的冷冻血清的244位血清转化者被包括在该分析中。在cart广泛应用时代之前的1996年审查随访。感染的中值年为1989年且从感染开始的中值随访时间为6.5年。
[0128]a.2.研究方案
[0129]我们研究了在1996年之前入选seroco群体的感染后24个月之内(入选中值年为1989年)的244位hiv-1未经治疗的血清转化者。在1996年审查随访，中值随访为6.5年。在入选时由冷冻血清测量早期抗-3s抗体水平。为评价抗-3s抗体对疾病发展风险的作用，通过kaplan-meier曲线评价从感染到⑶4低于200/mm3 (91个事件)和临床aids (83个事件)的时间，比较抗体>50个单位/ml的患者和具有较低或不可检测水平的患者。通过cox回归模型评价原始和调整的rr。
[0130]a.3.抗-3s抗体水平的测暈
[0131]在平底96孔微板(maxisorp, nunc)上进行elisa测试。
[0132]用在pbs中为2mg/ml的3s肽包被平板，在4°c下过夜17h。在pbs/0.1%吐温中洗涤平板两次，然后在37°c下在pbs/3 %脱脂乳中阻断2h。
[0133]将所测试的血清/血浆热失活(56°c，45分钟)，然后在37°c下以各种浓度(1/20、1/200和1/2000) 一式三份地添加i小时30分钟。在测试缓冲液(pbs，3 %脱脂乳，0.1%吐温-20)中稀释血清。
[0134]在pbs/0.1 %吐温中洗涤两次后，添加1/2000稀释的生物素_sp_结合的兔抗人igg (jackson immunoresearch)并在 37°c下培养 lh。在测试缓冲液(pbs, 3%脱脂乳,0.1 %吐温-20)中稀释生物素结合的抗体。
[0135]洗漆后，在37°c下使用1/5000稀释的extraavidin过氧化物酶结合物(sigma)捕获生物素lh。在测试缓冲液(pbs，3%脱脂乳，0.1%吐温-20)中稀释extravidin。最后一次洗涤后，用底物溶液显色，并在450nm处测量光密度(od)。
[0136]平板在pbs/0.1 %吐温中洗涤两次，然后在pbs中洗涤两次，在tmb (sigma)存在下在室温下在黑暗中显色30分钟。
[0137]用4n h2so4终止化学反应，并在450nm处(微板读数器，分子装置)分析。
[0138]阴性对照使用人ab血清(sab)和来自未感染供体、在测试缓冲液中以1/20稀释的血浆。
[0139]抗-3s抗体的量化使用校准标准，包括稀释称为15c8f2的纯化小鼠抗_3s单克隆抗体。标准曲线对应于连续2倍稀释所述单克隆抗体，其中值为0-200ng/ml。在测试缓冲液中稀释单克隆抗体。
[0140]在标准曲线的线性部分内报告测试样品的0d，以获得发送相同信号的15c8f2单克隆抗体的相应浓度。
[0141]通过考虑测试样品和体积的稀释因子测定以任意单位表示的抗-3s抗体的值。通过阴性对照获得的值设置检测极限，并固定到10个任意单位的值。
[0142]a.4.其他方法
[0143]在各个随访借助于流式细胞计测定cd4淋巴细胞计数。从储存的血清回顾性测定所有的hiv-1rna水平。
[0144]三所参与大学实验室使用逆转录酶-聚合酶链式反应(amplicor hiv-1监控器测试，roche molecular systems,neuilly-sur-seine,量化阈为 400 个拷贝/ml)。在入选时从冷冻血清测量早期抗-3s抗体水平(从估计的感染日起的中值时间:9个月)。
[0145]a.5.统计分析
[0146]pearson的卡方或fisher的精确检验用于比较定性变量；非参数kruskal wallis检验用于连续变量。
[0147]为测试抗-3s抗体水平作为hiv疾病发展风险的预测标记物的资格，通过kaplan-meier曲线评价从感染到⑶4低于200/mm3 (91个事件)和临床aids (83个事件)的时间。使用log秩和检验将抗体> 50个单位/ml的患者中的无事件存活曲线与具有较低或不可检测水平的患者相比较。使用cox模型评价原始和调整的相对风险(rr)。
[0148]b.结果
[0149]72%的血清转化者具有接近于血清转化的可检测的抗-3s抗体(从估计的感染日起的中值时间:9个月)，53%高于50个单位。入选时抗-3s抗体水平与hiv-rna水平逆相关，没有发现与cd4计数的关系，如下表i所示。因此，结果表明抗-3s抗体水平和cd4t细胞计数由独立的标记物构成。
[0150]表i
【权利要求】
1.用于预测感染有hiv-ι病毒的患者中hiv-1疾病的发展的体外方法，包括步骤:a)测量从所述患者收集的样品中直接对抗seqid n0 2的3s肽的抗体的水平， b)将在步骤a)测量的抗-3s抗体的水平与指示hiv-1疾病的发展的抗-3s抗体水平的参考值相比较。
2.根据权利要求1的方法，其中步骤a)通过免疫检测直接对抗seqid n0 2的肽的抗体来进行。
3.根据权利要求1的方法，其中步骤a)通过elisa测试使用固定在固体支持体上的包含seq id n0 2的肽的多肽来进行。
4.根据权利要求1的方法，进一步定义为包括以下步骤: 1)测量从所述患者收集的所述样品中的hiv-1病毒载量，和 2)将步骤i)测得的病毒载量值与指示hiv-1疾病发展的参考值相比较。
5.根据权利要求1的用于预测hiv-1疾病的发展的体外方法，其中: -步骤a)进一步包括测量从hiv-1-感染患者收集的样品中至少一种其他hiv-1疾病预测标记物，和 -步骤b)包括对于在步骤a)测量的每种hiv-1疾病预测标记物，将所得的标记物值与所述预测标记物的参考值相比较。
6.根据权利要求5的体外方法，其中所述一种或多种其他hiv-1疾病预测标记物选自(i)hiv病毒载量，(ii)⑶4t细胞绝对计数，(iii)⑶4t细胞的百分比和(iv)⑶4 /⑶8 t淋巴细胞的比率。
7.根据权利要求6的体外方法，其中步骤a)包括测量选自下组的hiv-1疾病预测标记物的组合: -与上述标记物q)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qi)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qii)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物⑴和qi)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物⑴和qii)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物⑴和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qi)和qii)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qi)和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物qii)和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物q)、(?)和qii)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物q)、(?)和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物(ii)、(iii)和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物(i)、(iii)和qv)相结合的抗-3s抗体水平， -与上述标记物(i)、(ii)、(iii)和qv)相结合的抗-3s抗体水平。
8.用于监控疗法的效力的方法，包括步骤: a)通过向需要治疗的hiv-1感染患者施用包含一种或多种抗逆转录病毒剂的药物组合物来实施治疗，和b)在从所述患者收集的样品上实施权利要求1至7任一项的用于预测hiv-1疾病发展的体外方法，和 c)如有必要，适宜地改 变步骤a)进行的疗法。
【文档编号】g01n33/569gk103460047sq201280009824
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年2月21日 优先权日:2011年2月22日
【发明者】洛朗斯·梅耶尔, 樊尚·维埃亚尔, 帕特里克·德勃雷, 若埃尔·克鲁泽 申请人:伊纳维尔瓦克斯公司, 国家健康与医学研究院