用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，包括的步骤如下：(1)抗原的制备：将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白、癌抗原-125和人附睾蛋白4基因制得所需的抗原；(2)捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体；(3)检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体；(4)捕获抗体包被；(5)封闭和加样。本发明的有益效果如下：最全面的检测卵巢癌，能够更好的判断绝经前或绝经后盆腔肿块的良恶性，更好地对妇科良性卵巢肿块和囊肿与卵巢癌进行鉴别诊断，具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到96％以上。
【专利说明】用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法
【技术领域】:
[0001]本发明涉及癌症诊断检测用的试剂盒领域，具体为一种用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法。
【背景技术】:
[0002]卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，是指生长在卵巢上的恶性肿瘤，其中90%~95%为卵巢原发性的癌。就诊时60%~70%已为晚期，而晚期病例又疗效不佳。因此，虽然卵巢癌的发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌居妇科恶性肿瘤的第三位，但死亡率却超过宫颈癌及子宫内膜癌之和，高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾
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[0003]由于卵 巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难，所以卵巢癌无论在诊断和治疗上确是一大难题。到目前为止，就国内外临床资料统计，其五年生存率仅25%左右。但是如果发现得早，90%的病人都能活下来；卵巢癌5年内的复发率可高达80%，且复发时间主要集中在治疗期的3年内。在女性的一生中，每五位女性就会有一位出现盆腔肿块,需要接受检查来排除恶性肿瘤的可能性。目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查(tuv)。这种成像方法可用于检查女性的生殖器官，包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。尽管其应用较为普遍，但是这种方法并不能准确检测出该肿块是良性还是恶性。此外，该方法还需要经验丰富的临床技师对检测结果进行解读。另一种常规检测方法是检测肿瘤标志物ca125，这种方法被视为卵巢癌诊断的“金标准”。但是，ca125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。大约50%的卵巢癌i期患者并没有ca125水平升高的现象，也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。某些良性卵巢疾病也会导致ca125水平升高，造成假阳性。因此，在临床诊断上亟需一种更好的诊断工具以尽早诊断卵巢癌。
[0004]肿瘤标志物(tumor markers,tm)是指在肿瘤发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身合成、释放，或由机体对肿瘤细胞反应而产生的标志肿瘤存在和生长的一类物质。这些物质在正常成人中不存在或者是在癌症患者中出现的水平显著高于正常人。目前肿瘤标志物检测技术被认为是早期发现无症状微灶肿瘤的唯一途径，这一检测技术可先于x光片、超声、ct、mri或pet-ct等物理检查发现肿瘤。可用于高危人群恶性肿瘤的筛查，肿瘤诊断与鉴别诊断，评估治疗的效果，预测或监视肿瘤复发或转移。目前，医院出现的卵巢癌诊断试剂盒是检测常见的肿瘤标记物，灵敏性及准确性都偏低，即使联检也只70%左右，难以满足早期快速诊断的要求。
[0005]由于市场上还没有针对卵巢癌的快速高效诊断试剂盒问世，严重影响到卵巢癌早期发现及治疗，卵巢癌患者确诊时往往已处于癌症晚期，错过了最佳治疗时机，大大降低了患者的生存率。如果卵巢癌能被早期诊断，可以极大地提高患者的生存率。
【发明内容】
:[0006]本发明的目的是针对以上述卵巢癌诊断存在的不足，提供一种灵敏度高，准确性强的用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法。
[0007]为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是:用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)和癌抗原-125(ca-125)分别制得的单克隆抗体。
[0008]所述捕获抗体还包括人附睾蛋白4(he4)制得的单克隆抗体。
[0009]所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)分别制得的多克隆抗体。
[0010]所述捕获抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
[0011]所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0012](i)抗原的制备:把半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0013](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。
[0014]所述检测抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。
[0015]所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0016](i)抗原的制备:把半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0017](2)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。
[0018]所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
[0019]用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤:
[0020](i)抗原的制备:将半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
[0021](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0022](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
[0023](4)捕获抗体包被:
[0024]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)将浓度为i μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔.封盖微量滴定板并在4°c下孵育过夜.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ ipbst (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°c环境中备用。
[0025](5)封闭和加样:每孔添加200 μ i封闭缓冲液(1.2% bsa/pbs)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
[0026]本发明方法可以提高用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到96%以上。
[0027]用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:
[0028](i)抗原的制备:将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；
[0029](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0030](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
[0031](4)捕获抗体包被:
[0032]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)将浓度为i μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
[0033]②.封盖微量滴定板并在4°c下孵育过夜；
[0034]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ i pbst (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°c环境中备用。
[0035](5)封闭
[0036]①.在微量滴定板的每个孔添加200 μ i封闭缓冲液(1.2% bsa/pbs)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0037]②.封盖微量滴定板并在37°c下孵育至少i小时，优选的，孵育过夜；
[0038](6)加样
[0039]①.将100 μ i的样品添加到每个孔，在37°c下孵育60分钟；要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样，以确保准确性；
[0040]②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ i pbst (磷酸盐吐温缓冲液)；
[0041]③.将100 μ i浓度为0.5 μ g/ml的检测抗体添加到微量滴定板的每个孔；
[0042]④.封盖微量滴定板并在37°c下孵育i小时；
[0043]⑤.用pbst洗涤微量滴定板四次；
[0044]⑥.添加100 μ i标记二抗；
[0045]⑦.封盖微量滴定板并在37°c下孵育i小时。
[0046]⑧.用pbst洗涤微量滴定板四次。
[0047](7)检测[0048]①.将tmb (3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度。
[0049]②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在x轴(对数标度)上，而吸光度标在y轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
[0050]本发明从众多的肿瘤标记物中，筛选出4个肿瘤标记物一半乳糖凝集素-3(galectin-3)，转甲状腺素蛋白(ttr)，人附睾蛋白4 (he4)及癌抗原-125 (ca-125)组成卵巢癌快速诊断试剂盒。其中，转甲状腺素蛋白(ttr)又被称为前白蛋白(pa)，是一种由肝脏、脉络丛和眼产生的蛋白，它与转运甲状腺素和维生系a代谢有关。在肝脏受到损伤的病人的血清中ttr的含量明显降低。肝癌中ttr基因转录受阻，并在基因结构上存在缺陷。而且ttr对肿癌细胞的生长有明显的抑制作用，因此ttr基因是一种抑癌基因。由于血浆中提取ttr产量低、步骤繁琐，所以我们用基因工程分子克隆的方法可大量生产ttr研发本试剂盒。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是一种半乳糖结合蛋白，是galectin家族中唯一具有嵌合结构的成员。半乳糖凝集素-3(galectin-3)广泛分布于肿瘤组织中，半乳凝素-3的表达同其肿瘤的侵袭和转移密切相关。galectin-3可与细胞表面糖基化的⑶98结合促使整合素在细胞表面聚集成簇，间接增强整合素与其配体的亲和力；也能直接结合整合素α i β i和⑶i lb/18，正性或负性调节整合素的活性，影响整合素与细胞外配体的结合。galectin-3还可以增加整合素在细胞表面的表达，并促进胶原在细胞间隔的分泌。由于半乳糖凝集素-3对多聚糖有亲和力，它也可以直接结合糖基化的细胞外基质成分，介导细胞与基质的黏附。我们的研究显示卵巢癌患者血清中galectin-3水平明显超过健康人群。人附睾蛋白4(he4)是一种新的肿瘤标志物。正常生理情况下，he4在呼吸道、生殖系统和卵巢组织中有非常低水平的表达，但在很多卵巢癌组织和患者血清中高度表达。癌抗原-125 (ca-125或糖链抗原-125)，也被称为粘蛋白_16，是被muc16基因所编码的蛋白质，是从上皮性卵巢癌抗原检测出可被单克隆抗体0c125结合的一种糖蛋白。ca-125对卵巢癌的早期检测的潜在作用是有争议的，尚未广泛用于在无症状妇女筛选。使用ca-125这一生物标志物的主要问题是它缺乏敏感性，特别是在检测卵巢癌时其缺乏特异性，尤其是在绝经前妇女的早期阶段。这些限制意味着，ca-125测试卵巢癌往往给人误报，让病人焦虑，从而做进一步不必要的筛选(有时包括手术)。此外，这些限制意味着，许多早期卵巢癌的妇女将收到来自ca-125检测假阴性，并没有得到自己的病情进一步治疗。美国食品药品监督管理局(fda)批准的可用于临床的卵巢癌血清标志物包括ca125和he4，两者的联合使用对卵巢癌的总体敏感性和特异性分别为76%和95%，但用于卵巢癌的早期诊断缺乏足够的敏感性和特异性。
[0051]与现有技术相比，本发明的有益效果如下:最全面的检测卵巢癌，能够更好的判断绝经前或绝经后盆腔肿块的良恶性，更好地对妇科良性卵巢肿块和囊肿与卵巢癌进行鉴别诊断，具有灵敏度高准确性强的特点，其灵敏度及准确性均达到96%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0052]图1是本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的原理图；
[0053]图2是本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒在卵巢癌治疗前后血中检测到galectin-3的变化对比图；[0054]图3是本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒在卵巢癌治疗前后血中检测到ttr的变化对比图；
[0055]图4是本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒在卵巢癌治疗前后血中检测到he4的变化对比图；
[0056]图5是本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒在卵巢癌治疗前后血中检测到ca125的变化对比图。
【具体实施方式】
[0057]以下结合附图和具体实施例对本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒进行详细的描述说明。
[0058]用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，捕获抗体封闭缓冲液，标准品，标记抗体，洗漆液及显色液等。所述标记抗体选用hrp标记二抗。所述捕获抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)和癌抗原-125(ca-125)分别制得的单克隆抗体；通过对半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)和癌抗原-125(ca-125)的共同快速检测，可以有效的提高检测准确率和灵敏度，有效的克服单凭检测癌抗原_125(ca-125)导致的不足。
[0059]所述捕获抗体还包括和人附睾蛋白4(he4)制得的单克隆抗体，通过检测半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4 (he4)，使其灵敏度及准确性均达到96%以上，这个是现有试剂盒不可比拟的，可以快速准确的诊断卵巢癌，极大地提高患者的生存率。
[0060]所述捕获抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应单克隆抗体。
[0061]所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0062](i)抗原的制备:通过分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；所述抗原的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
[0063](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选小鼠。所述捕获抗体的制备也可以使用现有常规方法制备，在此不再累赘。
[0064]所述检测抗体包括半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)分别制得的多克隆抗体。
[0065]所述检测抗体为将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到相应的抗原，将所述抗原免疫哺乳动物得到的相应多克隆抗体。所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下:
[0066](i)抗原的制备:通过分子克隆的方法把半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原，此抗原也可作为标准品用；
[0067](2)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。所述哺乳动物是小鼠及兔子，优选兔子。
[0068]其中，所述捕获抗体可以预先包被于pvc材质的微量滴定板的孔内，可以简化步骤，提高检测效率。
[0069]用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其包括以下步骤:
[0070](i)抗原的制备:通过分子克隆的方法将半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
[0071](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0072](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
[0073](4)捕获抗体包被:
[0074]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)将浓度为i μ g/ml的捕获抗体包被于微量滴定板的孔内；
[0075]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4°c下孵育过夜；
[0076]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ i pbst (磷酸盐吐温缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°c环境中备用；所述洗涤液为pbs(磷酸盐缓冲液)中加入一定量的tween20，所述tween20的质量百分比浓度为0.05% ;
[0077](5)封闭
[0078]①.在微量滴定板的每孔添加200 μ i封闭缓冲液(为含1.2% bsa (牛血清白蛋白)的pbs(磷酸盐缓冲液))，用于封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0079]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°c下孵育至少i小时，优选的，孵育过夜。
[0080]用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其包括以下步骤:
[0081](i)抗原的制备:通过分子克隆的方法将半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原，其中，所述抗原也可作为标准品用；
[0082](2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；
[0083](3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；
[0084](4)捕获抗体包被:
[0085]①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph9.6)将浓度为i μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；
[0086]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在4°c下孵育过夜；[0087]③.弃去包被液(碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的捕获抗体)，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ i pbst (磷酸盐吐温缓冲液，可以是含0.05%吐温-20的ph值为7.4的磷酸盐缓冲液)，在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去洗涤液，在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴，晾干放于4°c环境中备用；所述洗涤液为pbs (磷酸盐缓冲液)中加入一定量的tween20，所述tween20的质量百分比浓度为0.05% ;
[0088](5)封闭
[0089]①.在微量滴定板的每个孔添加200 μ i封闭缓冲液(1.2% bsa/pbs)，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；
[0090]②.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°c下孵育至少i小时，优选的，在4°c下孵育过夜；
[0091](6)加样
[0092]①.将100 μ i适当稀释(稀释20倍)的样品添加到每个孔，在37°c下孵育60分钟；要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测定标准品(两重测定或三重测定)和空白样，以确保准确性；
[0093]②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200 μ i pbst (磷酸盐吐温缓冲液)；
[0094]③.将100 μ i浓度为0.5 μ g/ml的检测抗体添加到微量滴定板的每个孔；
[0095]④.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°c下孵育i小时；
[0096]⑤.用pbst洗涤微量滴定板四次；
[0097]⑥.添加100 μ i标记二抗，其在使用前便已在pbs中稀释10000倍(1:10000)。所述标记二抗可以为hrp标记羊抗兔。
[0098]⑦.用粘合塑料制品封盖微量滴定板并在37°c下孵育i小时。
[0099]⑧.用pbst洗涤微量滴定板四次。
[0100](7)检测
[0101]①.将tmb(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)溶液添加到每个孔，孵育15_30分钟，添加等体积的终止液(2m h2so4),然后在450nm处读取光密度。
[0102]②.由系列稀释液得到的数据绘制标准曲线，浓度标在x轴(对数标度)上，而吸光度标在y轴(线性标度)上。通过内插法在此标准曲线上得出样品浓度。
[0103]本发明用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒包括半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125 (ca-125)和人附睾蛋白4(he4)四项指标中两项同时升高作为诊断早中期卵巢癌的标准，检测原理如图1所示；半乳糖凝集素_3、转甲状腺素蛋白(ttr)、癌抗原-125(ca-125)和人附睾蛋白4(he4)四项指标中两项同时下降作为卵巢癌治疗效果评估的标准。可以用于临床上通过检测血中3个肿瘤标记物水平的高低对卵巢癌的治疗效果进行动态评估。另外还可以用于临床上对卵巢癌的复发转移及预后判断的应用；也可用于肺癌早中期快速诊断。
[0104]近几年本发明人一直从事半乳糖凝集素及其抑制剂与肿瘤相关的研究，取得了许多具有世界先进水平科研成果。半乳糖凝集素-3 (galectin-3)正在成为新的研究热点，世界很多实验室都开始着手这方面的研究。很显然，本发明人在这个领域的研究走在世界的前列。同时，发明人还对ttr与卵巢癌的相关性进行了研究，我们的研究表明galectin-3对卵巢癌的敏感性和特异性分别为78.2%和82.6% ;ttr对卵巢癌的敏感性和特异性分别为65.5%和85.2%，见下表:
[0105]
【权利要求】
1.用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于.包括的步骤如下: (1)抗原的制备:将半乳糖凝集素-3、转甲状腺素蛋白、癌抗原-125和人附睾蛋白4基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原； (2)捕获抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体； (3)检测抗体的制备:将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体； (4)捕获抗体包被: ①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为i μ g/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；②.封盖微量滴定板并在4°c下孵育过夜；③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200 μ i pbst,除去洗涤液，除去剩余的液滴，晾干放于4°c环境中备用； (5)封闭和加样:每孔添加200μ i封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
2.根据权利要求1所述的用于卵巢癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征在于:所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内。
【文档编号】g01n33/574gk103969437sq201410164258
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】余跃飞, 罗喜平, 王晓娟 申请人:广州恒泰生物科技有限公司