mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法
【专利摘要】本发明公开了mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，包括以下步骤：①亲代细胞培养：人卵巢粘液性囊腺癌细胞株skov3进行传代培养；②mir-126准备转染：利用慢病毒技术，取步骤①所得的对数生长期skov3细胞，接种于6cm培养皿，加2ml全培养基培养，24小时后待细胞长至80％～90％融合时，用2ml无血清培养基洗细胞一次，准备转染；③设置转染mir-126过表达组。转染mir-126过表达组具有如下用途：观察mir-126转染后卵巢癌细胞生物学行为的变化；研究mir-126在卵巢癌的发生发展中的作用，寻找卵巢癌临床治疗的新靶点。
【专利说明】mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种选择人卵巢癌细胞株sk0v3为亲代细胞，利用慢病毒载体制备mir-126转染的卵巢癌细胞株的培养方法。
【背景技术】
[0002]卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，现多数已经处于晚期阶段，已广泛转移至腹腔、盆腔脏器，手术、化疗、放疗只是最大限度延长患者的生存时间，就现在的医疗发展水平来说很难彻底治愈。由于卵巢癌恶性程度和复发率均较高，再加上容易发生耐药，其5年生存率只有20%左右。因此，研究卵巢癌的发生发展机制并找寻其治疗的靶点是临床所迫切需要的。microrna在肿瘤发生过程中起着十分重要的作用,mir-126是microrna家族中的一员，有大量文献报导mir-126与肺癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤密切相关，但其在卵巢癌中的表达及作用尚不明确。
[0003]我们期望能制备一种mir-126转染的卵巢癌细胞株，以期观察mir-126转染后卵巢癌细胞生物学行为的变化，及其对卵巢癌耐药的影响，进一步研究mir-126在卵巢癌的发生发展中的作用，寻找卵巢癌临床治疗的有效途径。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，转染质粒序列为: [0006]①lv3-has-mir-126 序列(5，to3，):tcgtaccgtgagtaataatgcg,
[0007]②lv3-has-mir-126inhibitor 序列(5，to3，):cgcattattactcacggtacga,
[0008]③lv3nc 序列(5，to3，):ttctccgaacgtgtcacgt?
[0009]作为本发明的mir-126转染的卵巢癌细胞株制备方法的改进，依次包括以下步骤:
[0010]①、亲代细胞培养:
[0011]人卵巢粘液性囊腺癌细胞株sk0v3，在37°c，体积比5% co2条件下培养于含10�s、l%ant1-anti的dmem高糖培养液中，然后用含0.25%胰酶和0.02�ta的pbs消化、传代，2~3天传代i次；
[0012]②、mir-126准备转染:
[0013]利用慢病毒技术，取步骤①所得的对数生长期sk0v3细胞，接种于6cm培养皿，每孔细胞数为3 x io5个，加2ml全培养基培养，24小时后待细胞长至80%~90 %融合时，用2ml无血清培养基洗细胞一次，准备转染；
[0014]所述全培养基为:fbs与dmem高糖培养液按照1:9的体积比混合而得；
[0015]所述无血清培养基为:dmem高糖培养液；
[0016]③实验分组及处理；[0017]转染mir-126 过表达组(sk0v3/lv3-has_mir-126 组):
[0018]iml dmem 高糖培养液 45ul lv3-has_mir-126 慢病毒原液(浓度为 i x io8 个/ml) lul5ug/ul polybrene。
[0019]作为本发明的mir-126转染的卵巢癌细胞株制备方法的进一步改进，步骤③的实验分组还包括以下组别:
[0020]转染mir-126 抑制表达组(sk0v3/lv3-has_mir-126inhibitor 组):
[0021]iml dmem 高糖培养液 45ul lv3-has_mir-126inhibitor 慢毒原液(浓度为 i x io8个/ml) lul5ug/ul polybrene ；
[0022]转染阴性对照组(sk0v3/lv3nc组):
[0023]iml dmem高糖培养液 45ul lv3nc慢病毒原液(浓度为i x io8个/ml) lul5ug/ulpolybrene ；
[0024]空白对照组(nc):
[0025]iml dmem 高糖培养液 45ul 培养基 lul5ug/ul polybrene。
[0026]作为本发明的mir-126转染的卵巢癌细胞株制备方法的进一步改进，对上述sk0v3/lv3-has-mir-126 组、sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor 组、sk0v3/lv3nc 组、空白对照组分别进行以下操作:
[0027]每组中加入步骤2)所得的准备转染的sk0v3细胞，转染时的moi值为15 ;混合均匀后放入培养箱培养24小时，然后更换`成全培养基继续培养24h后，取出培养皿，直接在倒置荧光显微镜下进行观察、细胞计数并拍照，随机计数100个细胞，计算有绿色荧光的细胞所占细胞总数的百分比，即为转染效率。
[0028]作为本发明的mir-126转染的卵巢癌细胞株制备方法的进一步改进:mir_126转染的卵巢癌细胞株(sk0v3/lv3-has-mir-126组)具有以下特征:
[0029]①mir-126转染的卵巢癌细胞株，狭长的细胞减少，细胞骨架增加，片状伪足减少，这均有利于抑制肿瘤细胞的迁移；
[0030]②mir-126转染的卵巢癌细胞株s期增殖指数降低；
[0031]③侵过基质胶的穿膜细胞数减少。
[0032]本发明是涉及一种选择人卵巢癌细胞株sk0v3为亲代细胞，利用慢病毒载体制备mir-126转染的卵巢癌细胞株的培养方法。
[0033]采用本发明的方法制备而得的转染mir-126过表达组(sk0v3/lv3-has_mir-126组)具有如下用途:
[0034]1、观察mir-126转染后卵巢癌细胞生物学行为的变化。
[0035]2、研究mir-126在卵巢癌的发生发展中的作用，寻找卵巢癌临床治疗的新靶点。【具体实施方式】
[0036]实施例1、一种mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，依次进行如下步骤:
[0037]i)、亲代细胞培养:
[0038]人卵巢粘液性囊腺癌细胞株sk0v3，在37°c，5% (体积％) co2条件下培养于含10�s、l%ant1-anti 的 dmem 高糖培养液中；
[0039]然后，用含0.25%胰酶和0.02�ta的pbs进行消化、传代，2~3天传代i次；[0040]上述含10�s、l%ant1-anti的dmem高糖培养液即为:在il的dmem高糖培养液中加入100ml的fbs (fetal calf serum,胎牛血清)以及加入ioml的ant1-anti(antibiotic-antimycotic,抗菌-抗真菌剂)。
[0041]上述含0.25%胰酶和0.02�ta的pbs为:在每100mlpbs缓冲液(ph7.4)中加入
0.25g胰酶 0.02g的edta (乙二胺四乙酸)。
[0042]备注说明:上述传代仅需i次，选择生长状态良好、80%汇合的早期传代细胞。
[0043]2)、mir-126 准备转染:
[0044]利用慢病毒技术，取步骤i)所得的对数生长期的sk0v3细胞，接种于6cm培养皿，每孔细胞数为3 x io5个，加2ml全培养基培养，24小时后待细胞长至80%~90%融合时，用2ml无血清培养基洗细胞一次，准备转染。
[0045]备注说明:
[0046]全培养基为:fbs (fetal calf serum,胎牛血清)与dmem高糖培养液按照1:9的体积比混合而得；
[0047]无血清培养基为:dmem高糖培养液。
[0048]3)、实验分组及处理
[0049]①、转染mir-126 过表达组(sk0v3/lv3-has_mir-126 组):
[0050]iml dmem 高 糖培养液 45ul lv3-has_mir-126 慢病毒原液(浓度为 i x io8 个/ml) lul5ug/ul polybrene (聚凝胺,基因转染增强剂)；
[0051]②、转染mir-126 抑制表达组(sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor 组):
[0052]iml dmem 高糖培养液 45ul lv3-has_mir-126inhibitor 慢毒原液(浓度为 i x io8个/ml) lul5ug/ul polybrene ；
[0053]③、转染阴性对照组(sk0v3/lv3nc组):
[0054]iml dmem高糖培养液 45ul lv3nc慢病毒原液(浓度为i x io8个/ml) lul5ug/ulpolybrene ；
[0055]④、空白对照组(sk0v3组):
[0056]iml dmem 高糖培养液 45ul 培养基 lul5ug/ul polybrene ；
[0057]每组中加入步骤2)所得的准备转染的sk0v3细胞，转染时的moi值约为15 ;混合均匀后放入培养箱培养24小时，然后更换全培养基继续培养24h后，取出培养皿，直接在倒置荧光显微镜下进行观察、细胞计数并拍照，随机计数100个细胞，计算有绿色荧光的细胞所占细胞总数的百分比，即为转染效率，上述4组均为90.2±5.3% ；
[0058]备注:
[0059]上述培养均是在37 °c，5 % co2条件下进行。
[0060]为绿色荧光指细胞被慢病毒转染了，慢病毒上均含有编码gfp的基因，故转染细胞在荧光显微镜下可激发出绿色荧光。
[0061]lv3-has-mir-126 序列(5，to3，):tcgtaccgtgagtaataatgcg ；
[0062]lv3-has-mir-126inhibitor 序列(5，to3，):cgcattattactcacggtacga ；
[0063]lv3nc 序列(5，to3，): ttctccgaacgtgtcacgt。
[0064]4)、经实验观察和验证的mir-126转染的卵巢癌细胞株(sk0v3/lv3-has_mir-126组)具有以下特征:[0065]①形态学观察:
[0066]发现较之sk0v3/lv3-has-mir-126 组，sk0v3/lv3-has_mir-126inhibitor 组狭长的细胞居多，细胞骨架消失，片状伪足增多，这均有利于肿瘤细胞的迁移；
[0067]g卩，mir-126转染的卵巢癌细胞株(sk0v3/lv3-has_mir-126组)，狭长的细胞减少，细胞骨架增加，片状伪足减少，这均有利于抑制肿瘤细胞的迁移；
[0068]而sk0v3组与sk0v3/lv3nc组的细胞形态则处于前面提到的两组的细胞形态之间。这说明mir-126影响卵巢癌细胞的迁移部分是因为mir-126对细胞形态的影响。
[0069]②、细胞周期分析: [0070]经流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分析发现，sk0v3组、sk0v3/lv3nc组、sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor 组 s 期细胞平均比例分别为 63.9%、53.1 %和 34.7%。
[0071]sk0v3组和sk0v3/lv3nc组细胞s期增值指数相近；与sk0v3组和sk0v3/lv3nc组细胞任一组比较，sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor组的细胞s期增殖指数较高，表明mir-126抑制表达后，细胞的s期合成显著增加；
[0072]g卩，mir-126转染的卵巢癌细胞株(sk0v3/lv3-has_mir-126组)s期增殖指数降低；
[0073]③、侵袭实验:
[0074]31(0￥3细胞侵过基质胶的穿膜细胞数在未处理组(51(0￥3组)细胞中是253±14。与未处理组细胞相比较，阴性对照组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数没有明显改变(256±15，p > 0.05),转染lv3-has-mir-126inhibitor组细胞侵过基质胶的穿膜细胞数明显增加(290±13，p < 0.05)。
[0075]转染mir-126过表达组(sk0v3/lv3-has_mir-126组)为侵过基质胶的穿膜细胞数 164±25。
[0076]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，其特征在于转染质粒序列为:
①lv3-has-mir-126 序列:tcgtaccgtgagtaataatgcg，
②lv3-has-mir-126inhibitor 序列:cgcattattactcacggtacga， ③lv3nc 序列:ttctccgaacgtgtcacgt。
2.根据权利要求1所述mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤: ①、亲代细胞培养: 人卵巢粘液性囊腺癌细胞株sk0v3，在37°c，体积比5% co2条件下培养于含10�s、l%ant1-anti的dmem高糖培养液中，然后用含0.25%胰酶和0.02�ta的pbs消化、传代，2~3天传代i次； ②、mir-126准备转染: 利用慢病毒技术，取步骤①所得的对数生长期sk0v3细胞，接种于6cm培养皿，每孔细胞数为3 x io5个，加2ml全培养基培养，24小时后待细胞长至80 %~90 %融合时，用2ml无血清培养基洗细胞一次，准备转染； 所述全培养基为=fbs与dmem高糖培养液按照1:9的体积比混合而得； 所述无血清培养基为=dmem高糖培养液； ③实验分组及处理； 转染 mir-126 过表达组(sk0v3/lv3-has-mir-126 组):1ml dmem高糖培养液 45ul lv3-has_mir-126慢病毒原液(浓度为i x io8个/ml) lul5ug/ul polybrene。
3.根据权利要求2所述mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，其特征在于: 所述步骤③的实验分组还包括以下组别: 转染 mir-126 抑制表达组(sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor 组):1ml dmem 高糖培养液 45ul lv3-has_mir-126inhibitor 慢毒原液(浓度为 i x io8 个/ml) lul5ug/ul polybrene ； 转染阴性对照组(sk0v3/lv3nc组): iml dmem高糖培养液 45ul lv3nc慢病毒原液(浓度为i x io8个/ml) lul5ug/ulpolybrene ； 空白对照组(nc): iml dmem 高糖培养液 45ul 培养基 lul5ug/ul polybrene。
4.根据权利要求3所述mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，其特征在于: 对上述 sk0v3/lv3-has-mir-126 组、sk0v3/lv3-has-mir-126inhibitor 组、sk0v3/lv3nc组、空白对照组分别进行以下操作: 每组中加入步骤2)所得的准备转染的sk0v3细胞，转染时的moi值为15 ;混合均匀后放入培养箱培养24小时，然后更换成全培养基继续培养24h后，取出培养皿，直接在倒置荧光显微镜下进行观察、细胞计数并拍照，随机计数100个细胞，计算有绿色荧光的细胞所占细胞总数的百分比，即为转染效率。
5.根据权利要求2、3或4所述mir-126转染的卵巢癌细胞株的制备方法，其特征在于:mir-126转染的卵巢癌细胞株(sk0v3/lv3-has-mir-126组)具有以下特征:①mir-126转染的卵巢癌细胞株，狭长的细胞减少，细胞骨架增加，片状伪足减少，这均有利于抑制肿瘤细胞的迁移； ②mir-126转染的卵巢癌细胞株s期增殖指数降低； ③侵过基质胶的穿膜细胞数减少。
【文档编号】c12n5/09gk103614338sq201310513778
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】周建维, 王双燕, 费菁, 赵家耀, 李建琼, 王红亚 申请人:浙江大学