专利名称：：分析卵巢癌病症的方法
技术领域：
：本发明属于生物学和化学领域，更具体属于分子生物学和人类遗传学领域。本发明涉及鉴定人dna中的甲基化位点，特别是某些确定的序列中的甲基化位点的领域，所述序列当甲基化时，表明存在卵巢癌。
背景技术：
：卵巢癌是女性中的第五位的癌症死亡原因，是妇科恶性肿瘤导致的第一位的死亡原因，并且是第二常见的诊断的妇科恶性肿瘤(默克诊疗手册第18部分，妇科和产科第241章，妇科肿瘤)。它是特发的，表示确切原因是未知的。该疾病在工业化国家中更常见，日本例外。在美国，女性一生中具有1.4%-2.5%(40-60名女性中的1名)的发生卵巢癌的几率。卵巢癌一半以上的死亡发生在55-74岁的女性中，大约四分之一的卵巢癌死亡发生在35-54岁的女性中。发生卵巢癌的风险似乎受到一些因素的影响。与使用避孕药如柠檬酸克罗米酚的关联一直以来是有争议的。1991年的一项分析提出了使用药物可能增加卵巢癌的风险的可能性。从那时起进行了一些队列研究和病例_对照研究，而没有针对所述关联提供结论性的证据。有一些很好的证据证明遗传因素是重要的。brcal或brca2基因的某些突变的携带者，更常见在一些人群(如德系犹太女性)中，发生乳腺癌和卵巢癌的风险更高，通常比一般人群发病更早。有乳腺癌的个人病史或乳腺癌和/或卵巢癌的家族史的患者，特别是如果年轻，可能具有升高的风险。子宫癌、结肠癌或其他胃肠癌的强家族史可能表明存在称作遗传性非息肉结肠直肠癌的综合征(hnpcc，也称作lynchii综合征)，这赋予更高的发生卵巢癌的风险。已经研究的其他因素，例如滑石粉的使用、石棉暴露、高饮食脂肪含量和儿童期腮腺炎感染，是有争议的，并且还没有确定地证实。卵巢癌是根据肿瘤史分类(icd-0代码)。组织学指导了临床治疗、控制和预后的很多方面。卵巢肿瘤也可以根据它们的推测细胞来源进行分类。主要的类别是表面上皮-间质肿瘤、性索-间质肿瘤(icd-08590)、生殖细胞肿瘤(icd-09060-9090)和继发或转移性肿瘤。表面上皮-间质肿瘤是最常见的和原型卵巢癌。认为它们来自卵巢表面被覆，并且包括浆液性囊腺癌(8441/3)和粘液性囊腺癌(8470/3)。腹腔被覆了与组成卵巢表面被覆相同的细胞，并且癌可以从那里开始。在这种情况下，称作原发性腹膜癌。但是，其治疗与卵巢癌的治疗基本相同。性索-间质肿瘤(8590)包括激素活性病变，例如产生雌激素的粒层细胞肿瘤(8620/3)和男性化sertoli-leydig细胞肿瘤或男性细胞瘤。卵巢的生殖细胞肿瘤(9060-9090)来自生殖细胞，并且倾向于在年轻女性和女孩中发生。这些肿瘤占大约5%的卵巢癌。它们倾向于包封良好，并且很多是良性的，因此与其他卵巢肿瘤相比预后较好。也存在混合的继发肿瘤或转移性肿瘤。卵巢癌通常是原发的，但也可以是继发的，s卩，转移的结果来自身体其他部位的原发癌，例如，来自乳腺癌或来自胃肠癌，在此情况下卵巢癌是krukenberg癌。历史上卵巢癌称作“沉默杀伤者”，因为直到治愈的机会很小，都不认为出现了症状。但是，最近的研究显示这一术语是不正确的，并且与普通群体中的女性相比，在患卵巢癌的女性中更容易发生以下症状。这些症状包括胃胀气、盆腔或腹部疼痛、进食困难或很快有饱感、泌尿系统症状(尿急或尿频)。早期诊断与改进的预后相关。患有卵巢癌的女性常常报道一些其他症状。这些症状包括疲倦、消化不良、背痛、性交痛、便秘和月经不规律。但是，这些其他症状对于鉴定卵巢癌不是很有用，因为它们也以相同的频率出现在不患有卵巢癌的普通群体中的女性中。卵巢癌在它的早期阶段(i/ii)难以诊断，直到它播散并且发展到更晚的阶段(iii/iv)。这是由于大多数常见症状不特异的事实。卵巢癌具有不良预后。它是不成比例地致死的，因为症状是模糊和不特异的，因此诊断晚。超过60%展示该癌症的患者已经具有iii期或iv期癌症，此时已经播散超过卵桌。恶性卵巢癌将细胞脱落在腹腔内天然存在的流体内。这些细胞可以植入在其他腹部(腹膜)结构上，包括子宫、膀胱、肠、肠壁的被覆(网膜)，并且甚至可以播散到肺。这些细胞甚至可以在怀疑癌症之前形成新的肿瘤生长。超过50%的患卵巢癌的女性在疾病的晚期阶段诊断，因为不存在经济的卵巢癌筛选测试。所有阶段的5年存活率仅仅是35%-38%。但是，如果在疾病早期诊断，5年存活率可以达到90%-98%。因此，获得分析卵巢癌病症的方法和检测受试者中的卵巢癌的方法是有利的。发明_既述本发明教导了用于分析卵巢癌病症的方法，包括确定选自seqidno.1-91的序列中的一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态和/或确定特别是seqidno.1_10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态。感兴趣的区域在表ia和表ib中指定(“起始”和“终止”)。cpg岛是这样的区域其中大量胞嘧啶和鸟嘌呤在dna的主链中彼此邻接(即，通过磷酸二酯键连接)。它们位于且临近大约40%的哺乳动物基因启动子(约70%在人启动子中)。cpg符号中的“ρ”是指胞嘧啶和鸟嘌呤之间的磷酸二酯键。cpg岛的长度典型地是100-3000个碱基对。这些区域的特征在于cpg二核苷酸含量等于或大于统计学预期的含量(6%)，而基因组的其余部分具有低得多的cpg频率(1%)，这是一种称作cg抑制的现象。不同于基因编码区中的cpg位点，在大多数情况下，如果表达基因，启动子的cpg岛中的cpg位点是未甲基化的。这种观察结果导致推测出基因的启动子中的cpg位点的甲基化可能抑制基因的表达。甲基化对于沿组蛋白修饰进行印迹是重要的。cpg岛的通常正式定义是具有至少200bp的区域，其gc百分比高于50%，并且观察的/预期的cpg比大于0.6。本文中，cpg二核苷酸是可以在体内，特别是人体内以甲基化和未甲基化的状态存在的cpg二核苷酸。本发明涉及一种方法，其中用本文公开的一个或多个序列的未甲基化模式检测原发癌，并且其中用获得的甲基化模式预测对卵巢癌治疗的治疗反应。本文中，受试者理解为是所有人、患者、动物，无论它们是否表现病理学改变。在本发明的含义中，任何采集自细胞、组织、器官、生物等的样品都可以是要诊断的患者的样品。在一个优选实施方案中，本发明的患者是人。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，患者是怀疑患有选自下组的疾病的人原发性卵巢癌、继发性卵巢癌、表面上皮-间质肿瘤、性索_间质肿瘤、生殖细胞肿瘤。本方法用于卵巢细胞增殖性病症的改进的诊断、治疗和监测，例如，通过使得能够改进所述病症的亚类之间和对所述病症的遗传倾向的鉴定和区分。本发明相对于现有技术提供了改进，因为它使得能够对卵巢细胞增殖性病症进行高度特异性的分类，从而使得能够对患者进行改进的和知情的治疗。本文中，要求保护的序列也包括指定序列的反向互补序列。附图简述图1显示基因组的差异甲基化区域的确定方法。这在实施例中更详细概括。图2显示聚类的样品(列)与甲基化基因座(行)。甲基化标记可以区分肿瘤(上面的条的左部分)与正常组织(上面的条的右部分)。图3显示基于甲基化特征的卵巢样品的聚类。未监督的聚类可以区分正常和肿瘤样品。实施方案的详述发明人出乎意料地发现，一小部分选择出的dna序列可以用于分析卵巢癌病症。这可以通过确定本文公开的序列或其反向互补序列中一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态而进行。总共鉴定出了约900种适于所述分析的序列。发现91种序列是特别适合的。基于恰好10种序列，例如从表ia或b的前10种(p值0.0001)，可以得到94%的分类准确率。这些序列可以存在于下表ia所示的基因中。表iatableseeoriginaldocumentpage6
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所述序列也可存在于下表ib所示的基因间区域中。表ib
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形成本发明的基础的基因优选用于形成“基因板(genepanel)”，即，包含本发明的特定基因序列和/或它们各自的提供信息的甲基化位点的集合。基因板的形成使得能够快速和特异性分析卵巢癌的特定方面。本发明中描述和使用的基因板可以出乎意料高的效率使用，用于诊断、治疗和监测卵巢细胞增殖性病症并且分析发生卵巢细胞增殖性病症的倾向，特别是检测卵巢肿瘤。此外，与单个基因诊断和检测工具相比，来自多种基因阵列的多个cpg位点的使用，能够允许相对高度的灵敏度和特异性。本发明涉及用于分析卵巢癌病症的方法，包括确定选自seqidno.i-seqidno.10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态。在一个实施方案中，优选确定seqidn0.1_91的序列中的一个或多个序列的甲基化状态，其中如表ia或ib指出的，所述序列具有小于0.0001的ρ-值。cpg岛的甲基化状态指示卵巢癌。但是，优选地，确定每个cpg的甲基化状态，并且确定差异甲基化模式，因为并不是所有cpg岛都必须甲基化。在本发明的方法的一个实施方案中，该分析是检测受试者中的卵巢癌，并且其中进行以下步骤(a)提供来自要分析的受试者的样品，(b)确定选自seqidno.i-seqidno.10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的甲基化状态。任选地，额外地进行以下步骤(a)将来自甲基化状态测试的一个或多个结果输入获自诊断多变量模型(diagnosticmultivariatemodel)的分类器，(b)计算样品来自正常组织或卵巢癌组织的可能性，和/或，(c)计算预测中的置信度的关联p-值。例如，我们使用支持向量机分类器(supportvectormachineclassifier)，基于来自患者的预定组的组织来“学习”肿瘤或正常样品的重要特征。算法现在输出分类器(一种公式，其中变量是来自使用的特征组的甲基化比)。然后将来自新的患者样品的甲基化比输入此分类器。结果可以是1或0。与边缘平面的距离用于提供ρ-值。优选的是确定seqidno.i-seqidno.10禾口/或seqidno.50-seqidno.60的序列中的至少4个序列的甲基化状态。优选的是，额外地，确定seqidn0.11-49和/或61_91的序列中的一个或多个序列的甲基化状态。在一个实施方案中，确定seqid.no.i-seqidno.91的序列中的至少10个序列、20个序列、30个序列、40个序列或超过50个序列的甲基化状态。特别优选的是确定seqid.no.i-seqidno.91的序列中所有序列的甲基化状态。在一个实施方案中，确定seqidno.i-seqidno.10和seqidno.50-seqidno.60的序列的甲基化状态。原则上，本发明也涉及确定seqidno.i-seqidno.91的序列中仅一个序列的甲基化状态。有许多用于确定dna分子的甲基化状态的方法。优选地是，通过选自下组的一种或多种方法确定甲基化状态亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序(pyrosequencing)、甲基化敏感性单链构象分析(ms-ssca)、高分辨率解链分析(hrm)、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(ms-snupe)、碱基特异性切割/maldi-t0f、甲基化特异性pcr(msp)、基于微阵列的方法、mspl切割。其他已知的检测5-甲基胞嘧啶的方法的综述可以从以下综述文件收集rein，τ.，depamphilis，μ.l.，zorbas，h.，nucleicacidsres.1998，26，2255。其他方法公开于us2006/0292564a1中。在一个优选实施方案中，甲基化状态是通过mspi切割、衔接子的连接、mcrbc消化、pcr扩增、标记和随后的杂交来确定的。在一个优选实施方案中，甲基化状态如下确定。优选的是要分析的样品来自选自下组的组织类型例如，来自要分析的组织的组织活检物、阴道组织、舌、胰腺、肝、脾、卵巢、肌肉、关节组织、神经组织、胃肠组织、肿瘤组织、体液、血液、血清、唾液和尿。在一个优选实施方案中，检测原发癌。在本发明的方法的一个实施方案中，将获得的甲基化模式用于预测对卵巢癌治疗的治疗反应。本发明涉及探针，如位于上cpg位点的区域中的寡核苷酸。本发明的寡聚物通常用于所谓的“组”中，所述组包含seqidno.i-seqidno.91，或所述序列中的至少10个，优选20个，更优选30个，最优选超过50个序列内的每个cpg二核苷酸的至少一个寡核苷酸。本发明还涉及位于cpg位点的区域中的寡核苷酸的反向互补序列。用于所述分析的探针是基于以下一个或多个标准定义的(1)探针序列仅仅在人基因组中出现一次；(2)c/g核苷酸的探针密度是30%-70%；(3)杂交的解链特征和其他标准是根据meiretal，procnatlacadsciusα.2003s印30;100(20):11237_42。在一个非常优选的实施方案中，本发明涉及一组寡核苷酸，其特异于seqidν0.1-10和/或seqidno:50_60，或seqidn0.50-60的序列。本发明的寡核苷酸可以特异于体内存在形式的序列，或它可以特异于已经进行了亚硫酸氢盐处理的序列。所述探针的长度是10-80个核苷酸，更优选的长度是15-40个核苷酸。在本发明的寡核苷酸组的情况下，优选的是至少一个寡核苷酸与固相结合。进一步优选的是一个组的所有寡核苷酸都与固相结合。本发明进一步涉及至少10个探针(寡核苷酸和/或pna-寡聚物)的组，其用于检测基因组dna的胞嘧啶甲基化状态，所述检测是通过分析所述序列或所述序列的经过处理的形式(根据seqidno.i-seqidno.91及其互补序列)。这些探针使得能够改进卵巢细胞增殖性病症的检测、诊断、治疗和监测。该组寡核苷酸也可以用于通过分析根据seqidno.1-seqidno.91之一的所述序列或所述序列的经过处理的形式而检测单核苷酸多态性(snps)。根据本发明，优选的是通过本发明可得到的不同寡核苷酸和/或pna-寡聚物的排列(也称作“阵列”)是以可能结合于固相的方式存在的。这种不同寡核苷酸和/或pna-寡聚物序列的阵列的特征可以在于它是以矩形或六边形点阵的形式排列在固相上。这种固相表面优选由硅、玻璃、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银或金制成。但是，硝酸纤维素以及塑料，如可以小团形式存在的尼龙或树脂基质，是合适的替代物。因此，本发明的进一步的主题是用于制造固定于载体材料的阵列的方法，所述阵列用于卵巢细胞增殖性病症的改进的检测、诊断、治疗和监测和/或发生卵巢细胞增殖性病症的倾向的检测。在所述方法中，本发明的至少一种寡核苷酸与固相偶联。用于制备所述阵列的方法是已知的，例如参见美国专利号5，744，305，其是通过固相化学和对光不安的保护基团的方式制备的。本发明的另外的主题涉及用于卵巢细胞增殖性病症的改进的检测、诊断、治疗和监测的dna芯片。此外，dna芯片使得能够检测发生卵巢细胞增殖性病症的倾向。dna芯片包含至少一种本发明的核酸和/或寡核苷酸。dna芯片是已知的，例如，参见美国专利号no.5，837，832。本发明涉及包含核酸的组合物或阵列，所述核酸的序列与seqidno.1_91的序列中的至少10个序列相同，其中所述组合物或阵列包含不超过100种不同的核酸分子。本发明涉及包含至少5个序列的组合物或阵列，所述序列的累积ρ值小于0.001，优选小于0.0001。此外，本发明的主题是试剂盒，其可以包含例如含亚硫酸氢盐的试剂、含有至少两个寡核苷酸的一组引物寡核苷酸，在每种情况下所述寡核苷酸的序列相应于或互补于seqidno.i-seqidno.91中指出的碱基序列的长度为至少15个碱基的区段。优选的是所述引物是用于seqidno.1-10和/或seqidno.50-seqidno.60。实施例样品从挪威奥斯陆的norwegianradium医院获得患者样品，并且根据法律要求，获得患者知情同意书。cpg岛从ucsc基因组浏览器获得有注解的cpg岛。用公开的gardiner-garden定义(gardiner-garden,m.andμ.frommer(1987).“cpgislandsinvertebrategenomes."jmolbiol196(2):261-82)预测这些岛，其中涉及以下标准长度>=200bp，%gc>=50%，观察/预期cpg>=0.6。基因组中存在约26219个范围是200bp-2000bp的cpg岛。通过mspi限制性断裂，可以充分覆盖这些岛。按照以下说明，采用390k形式，通过nimblegensystems制备阵列。用来自人基因组构造33(hgl7)的cpg岛注解来设计50聚体叠片式阵列。50聚体在岛序列坐标的任一侧移动，以便使岛均勻分布。390k形式具有367，658个可获得的特征，其不能用50聚体叠片满足所有岛。因此，我们基于大小制备了要表示的岛的截止值，仅仅测定了大小为200b-2000b的cpg岛。设计了对照探针，用于表示背景信号。以前已经描述了样品制备表不(lucito,r.，j.healy,etal.(2003).“representationaloligonucleotidemicroarrayanalysis:ahigh_resolutionmethodtodetectgenomecopynumbervariation."genomeres13(10):2291_305.)，具有以下改变。使用的主要限制性内切核酸酶是mspl。消化后，连接以下接头(mspi24聚体和mspi12聚体)。12聚体是未磷酸化的，并且不连接。连接后，通过苯酚氯仿清洗材料，沉淀，离心，并且重新悬浮。将材料分成两份，一半通过内切核酸酶mcrbc消化，另一半模拟消化。每个样品对采用少至4个250μ1试管，用于扩增各自具有iooul反应体积的代表物。循环条件是95°c下1分钟，72°c下3分钟，共15个循环，然后是在72°c下延伸10分钟。当完成时，合并每对的试管的内容物。通过苯酚氯仿萃取来清洗代表物，沉淀，重新悬浮，并且测定浓度。按照描述对dnaitfi^feia(lucito,r.，j.healy,etal.(2003).“representationaloligonucleotidemicroarrayanalysis-.ahigh-resolutionmethodtodetectgenomecopynumbervariation.“genomeres13(10):2291_305.)，其中仅有微小改变。简言之，将2ugdna模板置于(溶解于ph8的te中)0.2mlpcr管中。加入5μ1随机单体(sigmagenosys)，用dh20补充到25μl，混合。将试管放置在100°c的tetrad中5分钟，然后放置在冰上5分钟。在其中加入5μ1neb缓冲液2，5yldntps(0.6nmdctp，1.2nmdatp,dttp,dgtp)，5μ1来自gehealthcare的标记(cy3_dctp或cy5_dctp)，2μ1nebklenow片段和2μ1dh20。用于杂交和洗涤的程序按照以前的报道(lucito，r.，j.healy,etal.(2003).“representationalο1igonucleotidemicroarrayanalysisahigh-resolutionmethodtodetectgenomecopynumbervariation."genomeres13(10):2291-305)，例外是用于杂交的烤炉温度增加到50°c。用axongenepix4000b扫描仪设置，以5μπι的像素大小扫描阵列。用genepixpro4.0软件对阵列的强度进行定量。将阵列数据输入s-plus中用于进一步的分析。数据分析在genepix4000b扫描仪上扫描微阵列图像，用nimblescan软件(nimblegensystemsinc)提取数据。对于每种探针，计算每个实验的mcrbc和对照处理样品的比值的几何平均值(geomeanratio)及其相关染料交换。然后用分位数标准化方法(bolstad,b.m.,r.a.irizarry,etal.(2003).“acomparisonofnormalizationmethodsforhighdensityoligonucleotidearraydatabasedonvarianceandbias"bioinformatics19(2):185-93)对数据集内所有样品的geomeanratio进行标准化。然后，集中每个实验的标准化比值，用中位数平滑模型(medianpolishmodel)对每个mspi片段中所有探针得到一个值。然后，将集中的数据用于进一步的分析。用方差分析鉴定最显著的岛。为了确定肿瘤和正常样品间甲基化的最一致出现的改变，我们使用了t检验方法。在进行了多测试校正后采用0.001的p值截止值(falsediscoveryrate，benjaminiandhotchberg(benjamini1995))，我们获得了一系列916个mspi片段，其显示不同的甲基化。监督学习我们使用了监督机学习分类器(supervisedmachinelearningclassifier)来鉴定区分肿瘤样品与正常样品所需的特征数目。采用留下一个的方法(leaveoneoutmethod)(lin,c.-c.c.a.c.-j.(2001).libsvm-.alibraryforsupportvectormachines)，使用了公众可得到的支持向量机(svm)文库(libsvmver2.8)来获得分类准确性。首先用单独的训练数据之间的t检验来选择用于分类的甲基化特征。然后使用径向基函数(radialbasisfunction,rbf)核在最前面的10、50和100个特征上训练svm。对于n个样品，对(n-i)个样品进行t检验，以鉴定甲基化比值具有显著差异的片段。对于卵巢数据集，此检验对18个卵巢样品进行了18次，从而在t检验计算中每个样品留下一次。然后用来自(n-i)个样品的最前面10个片段特征的甲基化比训练svm，用来自一个未训练样品的比值进行测试。基于正好10个特征，我们能够实现94%的分类准确率。感兴趣的是，在该分析中分类为正常的两个肿瘤样品在基因表达和roma分析中也都是最接近于正常的。甲基化位点的检测在一个优选实施方案中，该方法包括以下步骤在该方法的第一个步骤中，必须从诸如细胞系、组织或血样的来源分离基因组dna样品。可以通过本领域技术人员标准的方式进行提取，包括使用去污剂裂解、超声处理和用玻璃珠涡旋。一旦核酸已经提取，就可以将基因组双链dna用于分析中。在一个优选实施方案中，可以在该方法的下一个步骤前切割dna，这可以通过本领域技术人员的标准方式进行，特别是，但不限于限制性内切核酸酶。在该方法的第二个步骤中，用以下方式处理基因组dna样品，s卩，使在5’-位置未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交行为方面与胞嘧啶不相似的其他碱基。这在下文中理解为“预处理”。上文描述的基因组dna的处理优选用亚硫酸氢盐(亚硫酸盐，亚硫酸disulfite)和随后的碱水解进行，其导致未甲基化的胞嘧啶核碱基转化为尿嘧啶或在碱基vairine行为方面与胞嘧啶不相似的其他碱基。如果将亚硫酸氢盐溶液用于反应，则添加发生在未甲基化的胞嘧啶碱基。此外，必须存在变性试剂或溶剂以及自由基拦截物(radicalinterceptor)。然后，随后的碱水解导致未甲基化的胞嘧啶核碱基转化为尿嘧啶。然后将转化的dna用于检测甲基化的胞嘧啶。对片段进行扩增。由于统计学和实践的考虑，优选扩增10个以上具有100-2000个碱基对的长度的不同片段。可以在一个和相同的反应容器中进行几个dna片段的扩增。通常，通过聚合酶链反应(pcr)进行扩增。本领域技术人员了解所述引物的设计。这些应该包括至少两个寡核苷酸，其序列各自与附录中指出的碱基序列(seqidno.i-seqidn0.91)的长度为至少15个碱基对的片段反向互补或相同。所述引物寡核苷酸优选特征在于它们不含任何cpg二核苷酸。在该方法的一个特别优选的实施方案中，设计所述引物寡核苷酸的序列，以便仅仅选择性与目的卵巢细胞特异性dna退火并且扩增所述dna，从而使背景或不相关dna的扩增最少化。在本发明的上下文中，背景dna表示以下基因组dna，其不具有相关组织特异性甲基化模式，在本申请中，相关组织是健康的和患病的卵巢细胞。根据本发明，优选的是至少一个引物寡核苷酸在扩增过程中与固相结合。不同的寡核苷酸和/或pna-寡聚物序列可以矩形或六边形点阵的形式排列在平面固相上，固相表面优选由硅、玻璃、聚苯乙烯、铝、钢、铁、铜、镍、银或金制成，也可以使用其他材料，如硝酸纤维素或塑料。通过扩增获得的片段可以携带直接或间接可检测的标记。优选的是荧光标记、放射性核素或具有可以在质谱仪中检测的典型质量的可分离分子片段形式的标记，优选的是产生的片段在质谱仪中具有单个阳性或阴性净电荷，从而具有更好的可检测性。可以通过基质辅助激光解吸电离质谱法(maldi)或使用电喷雾质谱法(esi)进行检测和显现。在下一个步骤中，分析核酸扩增子，以便在处理前确定基因组dna的甲基化状态。可以用替代方法进行核酸的处理后分析。经过处理的核酸的甲基化状态特异性分析的一些方法是已知的，其他替代方法也将是本领域技术人员明确了解的。采用本领域已知的方法，可以在本发明的扩增步骤中进行分析。在一个这样的实施方案中，可以使用甲基化特异性引物寡核苷酸检测包含seqidno.i-seqidno.91的核酸内预先选择的cpg位置的甲基化状态。该技术描述于美国专利号6，265，171。权利要求用于分析卵巢癌病症的方法，包括确定选自seqidno.1-10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态。2.权利要求1的方法，其中所述分析是检测受试者中的卵巢癌，并且其中进行以下步骤a.提供来自要分析的受试者的样品b.确定选自seqidno.1-10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的甲基化状态。3.权利要求1或2的方法，其中额外进行以下步骤a.将来自甲基化状态测试的一个或多个结果输入获自诊断多变量模型的分类器，b.计算样品来自正常组织或卵巢癌组织的可能性，和/或，c.计算预测中的置信度的关联p-值。4.权利要求1-3的方法，其中确定seqidno.1_10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中的至少4个序列的甲基化状态。5.权利要求1-4的方法，其中额外地确定seqidno.11-49和/或61-91的一个或多个序列的甲基化状态。6.权利要求1-5的方法，其中确定seqid.no.1-91中至少20个序列的甲基化状态。7.权利要求1-6的方法，其中确定seqidno.i-seqidno.10和seqidno.50-seqidno.60的序列的甲基化状态。8.权利要求1-7的方法，其中通过选自下组的一种或多种方法确定甲基化状态a.亚硫酸氢盐测序b.焦磷酸测序c.甲基化敏感性单链构象分析(ms-ssca)d.高分辨率解链分析(hrm)e.甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(ms-snupe)f.碱基特异性切割/maldi-t0fg.甲基化特异性pcr(msp)h.基于微阵列的方法，和i.mspi切割。9.权利要求1-8的任一项的方法，其中要分析的样品来自选自下组的组织类型例如，来自要分析的组织的组织活检物、阴道组织、舌、胰腺、肝、脾、卵巢、肌肉、关节组织、神经组织、胃肠组织、肿瘤组织、体液、血液、血清、唾液和尿。10.权利要求2-9的方法，其中检测原发癌。11.权利要求1-10的方法，其中将获得的甲基化模式用于预测对卵巢癌治疗的治疗反应。12.包含核酸的组合物或阵列，所述核酸的序列与seqidno.1_91的序列中的至少10个序列相同，其中所述组合物或阵列包含不超过100种不同的核酸分子。13.权利要求12的组合物或阵列，包含至少5个序列，所述序列的累积ρ值小于0.001，优选小于0.0001。全文摘要本发明涉及用于分析卵巢癌病症的方法，包括确定选自seqidno.1-seqidno.10和/或seqidno.50-seqidno.60的序列中一个或多个cpg二核苷酸的基因组甲基化状态。任选地，额外进行以下步骤将来自甲基化状态测试的一个或多个结果输入获自诊断多变量模型的分类器，计算样品来自正常组织或卵巢癌组织的可能性，和/或，计算预测中的置信度的关联p-值。文档编号c12q1/68gk101802226sq200880107276公开日2010年8月11日申请日期2008年9月16日优先权日2007年9月17日发明者j·b·希克斯,r·卢西托,s·卡马拉卡兰申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司;冷泉港实验室