一种适合于食管癌早期诊断的诊断标记物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食管癌的诊断，具体涉及一种食管癌诊断标记物，诊断标记物的筛选 方法、以该诊断标记物为基础构建的诊断模型，以及诊断模型的构建方法，该诊断标记物和 诊断模型对于食管原位癌、早期和晚期食管癌都具有很好的诊断效果，特别适合于食管癌 早期诊断，属于食管癌诊断技术领域。
【背景技术】
[0002] 食管癌（esophageal cancer)是由食管鳞状上皮或腺上皮的异常增生所形成的恶 性病变。据世界卫生组织最新数据表明：全世界每年约有40万人死于食管癌，我国是食管 癌发病率和死亡率最高的国家，且90%患者的组织类型为鳞状细胞癌（escc)。食管癌发病 隐匿，早期无症状或症状很不典型，发现时已是临床晚期，普遍预后不佳（5年生存率约为 13%)。因此，早期诊断和早期治疗是改善食管癌预后、降低死亡率的关键。目前，在食管 癌高发区的早诊早治平台和临床上常用的早期筛查和诊断方法包括食管拉网细胞学检查、 x线钡餐造影、食管超声内镜、食管内镜检查等。但这些方法均为有创检查、操作复杂、且价 格高昂，限制了其在食管癌筛查和早期诊断中的广泛应用。 食管癌发生涉及多因素、多阶段、多基因变异积累及与环境因素相互作用的复杂过程， 包括在分子水平上涉及众多原癌基因、抑癌基因以及蛋白质的改变，以及长期不良的生活 或饮食习惯的影响（进食含亚硝胺类较多的食物、如喜欢腌制酸菜或霉变食品、长期喜进 烫食、吸烟、饮酒不良嗜好等）。代谢组学是对生物样品（如血清、尿液、唾液等）中所有分 子量低于1000 da小分子代谢物（如脂肪酸、氨基酸、核苷及留体等生物小分子）进行定性 定量检测，从而监测机体受疾病或危险因素累积等干扰后内源性物质做出的代谢响应。体 内的生物信息由基因经转录传递给蛋白质，最终体现为小分子代谢物。不同于基因组学和 蛋白组学反映的生物体内在差异，代谢组学的研究领域扩展到了机体与环境之间的相互影 响和作用。小分子代谢物不仅是机体生命活动、生化代谢的物质基础，还体现了某些外来因 素对体内代谢环境的改变，因而某些独特代谢物的浓度在不同个体间的差异事实上反映了 疾病内在的表现和外在病因。近年来研究发现，诸如代谢性疾病和恶性肿瘤（卵巢癌）等 疾病发生发展过程中，机体基础生化代谢均发生了明显变化，对人类理解复杂疾病的代谢 机制将发挥重要作用，同时为复杂疾病的筛检和早期诊断提供崭新的技术方法。
[0003] 食管癌的发生发展是由多基因及环境因素相互作用所致，首先是相关的功能基因 表达发生改变或突变，然后是一系列细胞信号传导及蛋白质合成改变，最终在与环境因素 相互作用下使得代谢产物发生变化。食管癌的发生正是环境危险因素逐渐积累并不断损伤 机体各代谢通路稳态的结果。目前，已经有人利用代谢组学对食管癌进行研究，例如wu等 (ffu h, xue r, lu c,et al. metabolomic study for diagnostic model of oesophageal cancer using gas chromatography/mass spectrometry.j chromatogr b analyt technol biome d life sci，2009,877(27):3111_7·)、zhang 等（zhang j，bowers j, liu l, et al. esoph ageal cancer metabolite biomarkers detected by lc-ms and nmr methods. plos one, 2012, 7(1) :e30181.)、xu等（xu j，chen y，zhang r，et al. global and targeted metabolomics of esophageal squamous cell carcinoma discovers potential diagnostic and therapeutic biomarkers. mol cell proteomics, 2013, 12(5):1306-18.) 都利用代谢组学技术对食管癌进行了研究。
[0004] 食管癌的发生发展伴随着体内多种代谢物的改变，一般需要几年甚至十几年，如 能在癌变早期阶段发现，进行早期治疗，可有效提高预后效果。而事实上，已有研究证明在 疾病发病前或危险因素累积阶段，内源性物质就会做出相应的代谢响应。例如，zhao等通 过代谢指纹图谱研究揭示了糖尿病前期患者的代谢特征，并证实了脂肪酸、色氨酸、尿酸、 胆汁酸等的代谢改变发生于疾病出现临床症状前很长一段时间里，为代谢性疾病的筛查、 早期诊断和干预提供了新的可能。然而，上述食管癌代谢组学研究纳入的主要是食管癌晚 期患者，而大多没有纳入或很少的纳入早期食管癌病例。晚期食管癌已发生淋巴结和远处 转移，甚至出现肿瘤恶病质状态，此时机体代谢已发生很大的变化，因此，这些研究仅能发 现食管癌发病晚期同健康对照相比的代谢轮廓差异，根据这些代谢轮廓的差异仅能较好的 诊断出晚期食管癌，而对于早期食管癌却无法进行诊断，即不能实现食管癌的早期诊断。其 次，上述食管癌代谢组学研究仅获得很少一部分与食管癌发病相关的代谢物（从研究层次 上仅是代谢靶标分析，而不是代谢轮廓或代谢组学分析）。此外，上述研究大多未从食管癌 的客观分子筛查/早期诊断标准模型的角度评价代谢组学的转化医学潜力及应用效果，大 部分并未报告筛选的代谢物的筛查/诊断食管癌的灵敏度、特异度以及roc曲线下面积auc 值。 发明人前期针对食管癌已经进行了一系列研究，采用代谢组学的技术研究了能够进行 食管癌早期筛查的代谢组学分析模型，该技术对于我国食管癌高发区的高危人群发现具有 的应用和推广价值，目前已经在山东肥城市试点应用。然而，食管癌高发群筛查和临床早期 诊断仍具有诸多不同。食管癌高发区筛查是高发区的以健康或表面健康的人为观察对象， 目的是在健康的人群中发现那些表面健康，但可疑患有食管部位病变的人（高危个体），筛 查试验阳性者须作进一步的诊断或干预；而诊断是在临床环境下以患者或可疑患者为观察 对象，目的是区分患者是否有相应病症，对患者病情做出及时、正确的判断，以便采取相应 有效的治疗措施，临床上诊断阳性者要给予治疗（如手术、化疗或放疗）。目前，医院普遍使 用有创伤、操作复杂、且价格高昂的影像学检查临床诊断食管癌病例，并且患者主动就诊是 大多已为晚期，因此仍缺少能简单有效的用于临床食管癌诊断（特别是早期食管癌诊断） 的血清生物标记物。因此，寻找特异、敏感、经济和无创的食管癌早期诊断血清代谢标记物， 并建立一种安全有效的食管癌早期分子诊断模型具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中食管癌（也可称为食管鳞状细胞癌）的诊断操作复杂、价格昂贵、 有创伤性，目前的标记物仅对晚期食管癌灵敏度高，不能实现食管癌的早期诊断等不足，本 发明提供了一种适合于食管癌早期诊断的诊断标记物，该诊断标记物对于食管原位癌、早 期食管癌、晚期食管癌都具有较好的灵敏度和特异度，不仅能够用于晚期食管癌的诊断，还 能够较好的用于食管癌的早期诊断，对于改善食管癌预后、降低死亡率有很重要的意义。 本发明还提供了上述适合于食管癌早期诊断的诊断标记物的筛选方法，通过该方法所 得的标记物对于早期和晚期食管癌都具有很好的灵敏度和特异性，尤其是适合食管癌的早 期诊断，对于食管癌的治疗有重要的临床意义。 本发明还提供了一种食管癌诊断模型及诊断模型的构建方法，该模型构建方法简单， 能够代替现今有创的诊断方法，方便快捷，避免了待检人员的痛苦，对于食管原位癌、早期 食管癌、晚期食管癌都具有较好的灵敏度和特异度，为食管癌的早诊早治提供了有效的技 术支持。 本发明还提供了一种采用该诊断模型诊断食管癌的方法，采用本发明模型仅通过取血 就能进行诊断，方便快捷，无内创，尤其是对于早期食管癌灵敏度高，特异度好，具有很好的 临床应用价值。
[0006] 目前，本领域大都从基因和大分子蛋白质方面研究筛选食管癌诊断标记物，本发 明一改以往的研究思路，首次提出采用血清代谢组学技术筛选食管癌诊断标记物的思路， 发现了特别适合于食管癌早期诊断的标记物，使不便于发现的早期食管癌有了很好的诊断 方法。本发明依托"国家食管癌早诊早治示范基地（山东省肥城市）"的食管癌筛检与随 访人群队列，获得食管原位癌（简称原位癌，〇期39例）、早期食管癌（简称早期癌，i期17 例、ii期11例）及晚期食管癌（简称晚期癌，iii期30例）患者的血清标本，并随机抽取 经确定无任何食管病变及其他代谢疾病（如甲亢、甲减、高血压和糖尿病、肾病等）的健康 人群为健康对照，使用uplc-qt0f/ms获得1466个小分子代谢物的代谢指纹图谱，经过对食 管癌患者、及健康对象的小分子代谢物的代谢指纹图谱的对比、分析，得到适合于食管癌早 期诊断的诊断标记物，以这些诊断标记物进行模型构建，得到食管癌诊断模型，利用该模型 可以快速的诊断出是否为食管癌，尤其是可以诊断出早期食管癌，灵敏度高、特异度好，具 有临床使用和推广价值。
[0007] 本发明中，所述食管原位癌是指tnm分期标准中0期，指粘膜上皮层内或皮肤表皮 内的非典型增生（重度）累及上皮的全层，但尚未侵破基底膜而向下浸润生长的癌；早期 食管癌是指?!分期标准中i和ii期，指无淋巴结累及、无远处转移的局限于黏膜后或黏 膜下层的癌；晚期食管癌是指?!分期标准中iii期和iv期，指已累及肌层或达外膜或外 膜以外，有局部或远处淋巴结转移的癌。t匪分期标准依据american joint committee on cancer(ajcc)tnm classfication of carcinoma of the esophagus and esophagogastric junction(7th ed, 2010)〇 本发明的诊断标记物和诊断模型可以将无症状或症状不明显的早期食管癌诊断出来， 无内创性，减轻了检测者的痛苦，且诊断过程简洁、快速，提高了工作效率，对于食管癌的早 诊早治、预后的改善、死亡率的降低都有十分重要的意义。实现本发明的具体技术方案如 下：
[0008] -种适合于食管癌早期诊断的诊断标记物，为下述25种血清代谢标记物中 的任意一种或一种以上的组合：beta-丙氨酸-赖氨酸（beta-ala-lys)，左旋肌肽 (l-carnosine),顺_9_十六碳稀酸（cis-9-palmitoleic acid),棕榈酸（palmitic acid), 油酸（oleicacid),溶血磷脂酸 lpa(18:1 (9z)/0:0)，溶血卵磷脂 lysopc(14:0/0:0)， 溶血卵磷脂 lysopc(18:2(9z，12z))，溶血卵磷脂 lysopc(24:0)，磷脂 pc(14:1(9z)/ p-18:1(11z))，磷脂 pc(16:0/18:2(9z，12z))，磷脂 pc(24:1(15z)/22:6(4z，7z，1 oz，13z，16z，19z))，亚油酸（linoleic acid)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nadh)，皮 质醇（cortisol)，l-酪氨酸（l-tyrosine)，l-色氨酸（l-tryptophan),甘氨胆酸 (glycocholicacid),牛磺胆酸盐（taurocholate),次黄噪呤（hypoxanthine),尿囊酸 (allantoic acid),肌苷（inosine), 1-磷酸鞘氨醇（sphingosine ι-phosphate),硫 酸半乳糖基酰基鞘氨醇3-〇-sulfogalactosylceramide (dl8:1/20:0),乳糖神经酰胺 lactosylceramide(dl8:1/22:0)〇 上述诊断标记物中，可以是上述25种血清代谢标记物中的任意一种，也可以是它们之 间的两种或者两种以上的随意组合。当使用两种或两种以上的血清代谢标记物的组合作为 诊断标记物时，诊断的效果会优于单一的血清代谢标记物作为诊断标记物的效果。
[0009] 进一步的，上述诊断标记物可以为下述（a)-(h)中的任意一种血清代谢标记物的 组合：（a)可以为beta-丙氨酸-赖氨酸（beta-ala-lys)和左旋肌肽（l-carnosine)的 组合；(b)或者为顺-9-十六碳稀酸（cis-9-palmitoleic acid)、棕榈酸（palmitic acid) 和油酸（oleic acid)的组合；（c)或者为溶血磷脂酸lpa(18:1 (9z)/0:0)、溶血卵磷脂 lysopc (14:0/0:0)、溶血卵磷脂 lysopc (18:2 (9z，12z))和溶血卵磷脂 lysopc (24:0)的组 合；（d)或者为磷脂 pc (14:1 (9z) /p-18:1 (11z))、磷脂 pc (16:0/18:2 (9z，12z))、磷脂 pc ( 24:1(15z)/22:6(4z，7z，10z，13z，16z，19z))和亚油酸（linoleic acid)的组合；（e)或者 为烟酰胺腺噪呤二核苷酸（nadh)、l-酪氨酸（l-tyrosine)和l-色氨酸（l-tryptophan) 的组合；(f)或者为皮质醇（cortisol)、甘氨胆酸（g1 ycocholic acid)和牛磺胆酸盐 (taurocholate)的组合；（g)或者为次黄噪呤（hypoxanthine)、尿囊酸（allantoic acid) 和肌苷（inosine)的组合；(h)或者为1-磷酸鞘氨醇（sphingosine 1-ph o