用于确定胎儿分数的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及一种试剂盒，具体而言，涉及一种用于确定胎儿分数的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人类医学研究中的关键努力之一是发现了对不良健康结果极其重要的遗传性异 常。在很多情况下，在基因组的多个部分中已经识别出了特定基因和/或关键诊断标记物， 它们是以异常拷贝数存在的。例如，在产前诊断中，整个染色体的额外的或丢失的拷贝是经 常发生的遗传损伤。在癌症中，整个染色体或染色体区段的拷贝缺失或倍增、以及基因组特 定区域的更高水平的扩增是常见的情况。
[0003] 通过允许识别出结构性异常的细胞遗传学分辨能力已经提供了关于拷贝数变异 的大部分信息。用于遗传筛选和生物剂量测定的多种常规程序已经利用了侵入性程序（例 如羊膜穿刺）来获得用于核型分析的细胞。认识到对不需要细胞培养的更迅速测试方法的 需要，已经开发出了荧光原位杂交（fish)、定量荧光pcr(qf-pcr)以及阵列-比较基因组杂 交（阵列-cgh)来作为用于分析拷贝数变异的分子细胞遗传学方法。
[0004] 允许在较短时间内对整个基因组进行测序的技术的出现、以及循环无细胞 dna(cfdna)的发现已经提供了机会来将源自一个有待比较的的染色体遗传物质与另一遗 传物质的染色体进行比较，而没有与侵入性采样过程相关的风险。然而，现存方法的多种限 制（它们包括出自有限水平的cfdna的不足的敏感性）以及出自基因组信息的固有性质的 技术的测序偏差决定了对于无创性方法的持续性需求，这些无创性方法将提供特异性、敏 感性、和适用性中任一项或全部，以便在多种临床环境中可靠地确定拷贝数的变化。
[0005] 在此披露的实施方案满足了以上需求中的一些，并且特别是在提供一种可靠方法 方面给出了一种优势，该方法至少适用于实施无创性产前诊断学、并且适用于诊断并监护 癌症病人中的转移性进展。 【实用新型内容】
[0006] 母体样品中的母体dna背景对任何试图从样品的母体染色体组中区分胎儿染色 体的检测而言都具有敏感性的操作限制。因此，对于依靠胎儿和母体染色体组之间的量化 差异和/或实质差异的诊断和常规检测来说，胎儿分数是需要考虑的重要参数。本发明提 供了一种用于确定母体样品中的胎儿分数的方法。该方法将胎儿分数作为归一化染色体值 或归一化染色体区段值的函数来获得。本发明用于确定胎儿分数的方法可以与其他方法结 合，例如与将胎儿分数作为多态性中等位基因不平衡信息的函数来获得的方法相结合，对 母体样品中的胎儿染色体或染色体区段的拷贝数变异进行分类。本发明还提供了实施所述 方法的设备和试剂盒。
[0007] 供了多种方法用于在包括核酸混合物的测试样品中确定感兴趣序列的拷贝数变 异（cnv)，这些核酸已知或被怀疑在感兴趣的一个或多个序列的量上是不同的。这种方法包 括一种统计方式，该统计方式法将来自过程相关的、染色体间的和序列间的变异性的累积 性变异性考虑在内。该方法适用于确定任何胎儿非整倍性的cnv，以及已知或怀疑与多种医 学条件相关的多种cnv。根据本方法可以确定的cnv包括染色体1-22、x和y中的任一个 或多个的三体性或单体性，其他染色体的多体性，以及这些染色体中的任一个或多个的区 段的缺失和/或复制，这些可以通过对测试样品的核酸仅进行一次测序而检测出。从通过 测试样品的核酸的仅进行一次测序而获得的测序信息可以确定任何非整倍性。
[0008] 在一个实施方案中提供了一种方法，该方法用于在包含胎儿和母体核酸的母体测 试样品中确定存在或不存在任何四种或更多种不同的、完整的胎儿染色体性非整倍性。该 方法的步骤包括：(a)获得在母体测试样品中胎儿的和母体核酸的序列信息；(b)使用该 序列信息来针对选自染色体1_22、x、以及y的感兴趣的任何四个或更多个染色体中的每一 个识别出一定数目的序列标签，并且针对用于所述感兴趣的任何四个或更多个染色体中的 每一个的一个归一化染色体序列识别出一定数目的序列标签；（c)使用针对所述感兴趣的 任何四个或更多个染色体中的每一个识别出的所述序列标签的数目以及针对每个所述归 一化染色体序列识别出的所述序列标签的数目来针对所述感兴趣的任何四个或更多个染 色体中每一个计算出一个单染色体剂量；并且（d)将针对所述感兴趣的任何四个或更多个 染色体中的每一个的每个所述单染色体剂量与针对所述感兴趣的任何四个或更多个染色 体中的每一个的一个阈值进行比较，并且由此来确定在该母体测试样品中存在或不存在任 何四种或更多种完整的、不同的胎儿染色体性非整倍性。步骤（a)可以包括对一个测试样 品的这些核酸中的至少一部分进行测序，以获得针对测试样品的胎儿和母体核酸分子的所 述序列信息。在一些实施方案中，步骤（c)包括针对每个所述感兴趣的染色体来计算一个 单染色体剂量，作为针对每个所述感兴趣的染色体识别出的这个序列标签的数目与针对每 个所述感兴趣的染色体的所述归一化染色体序列识别出的这个序列标签数目的比率。在一 些其他实施方案中，步骤（c)包括：（i)通过使在步骤（b)中针对每个所述感兴趣的染色体 识别出的这个序列标签的数目与每个所述感兴趣的染色体的长度进行关联来针对每个所 述感兴趣的染色体计算出一个序列标签密度比；（ii)通过使在步骤（b)中针对每个所述归 一化染色体序列识别出的这个序列标签的数目与每个所述归一化染色体序列的长度进行 关联来针对每个所述归一化染色体序列计算出一个序列标签密度比；并且（iii)使用在步 骤（i)和（ii)中计算出的这些序列标签密度比来针对每个所述感兴趣的染色体计算出一 个单染色体剂量，其中该染色体剂量是作为针对每个所述感兴趣的染色体的序列标签密度 比与针对每个所述感兴趣的染色体的所述归一化染色体序列的序列标签密度比的比率来 计算的。
[0009] 在另一个实施方案中提供了一种方法用于在包含胎儿和母体核酸的母体测试样 品中确定存在或不存在任何四种或更多种不同的、完整的胎儿染色体性非整倍性。该方法 的步骤包括：(a)获得针对在母体测试样品中的胎儿和母体核酸的序列信息；(b)使用所述 序列信息来针对选自染色体1_22、x、以及y的感兴趣的任何四个或更多个染色体中的每一 个识别出一定数目的序列标签、并且针对用于所述感兴趣的任何四个或更多个染色体中的 每一个的一个归一化染色体序列识别出一定数目的序列标签；（c)使用针对所述感兴趣的 任何四个或更多个染色体中的每一个识别出的所述序列标签的数目以及针对每个所述归 一化染色体序列识别出的所述序列标签的数目来针对所述感兴趣的任何四个或更多个染 色体中每一个计算出一个单染色体剂量；并且（d)将针对所述感兴趣的任何四个或更多个 染色体中的每一个的每个所述单染色体剂量与针对所述感兴趣的任何四个或更多个染色 体中的每一个的一个阈值进行比较，并且由此来确定在该母体测试样品中存在或不存在任 何四种或更多种完整的、不同的胎儿染色体性非整倍性，其中选自染色体1_22、x、以及y的 所述感兴趣的任何四个或更多个染色体包括选自染色体1_22、x、以及y的至少二十个染色 体，并且其中确定了存在或不存在至少二十种不同的、完整的胎儿染色体性非整倍性。步骤 (a)可以包括对测试样品的这些核酸中的至少一部分进行测序，以获得针对该测试样品的 胎儿和母体核酸分子的所述序列信息。在一些实施方案中，步骤（c)包括针对每个所述感 兴趣的染色体来计算一个单染色体剂量，作为针对每个所述感兴趣的染色体识别出的这个 序列标签的数目与针对每个所述感兴趣的染色体的所述归一化染色体序列识别出的这个 序列标签数目的比率。在一些其他实施方案中，步骤（c)包括：（i)通过使在步骤（b)中针 对每个所述感兴趣的染色体识别出的这个序列标签的数目与每个所述感兴趣的染色体的 长度进行关联来针对每个所述感兴趣的染色体计算出一个序列标签密度比；（ii)通过使 在步骤（b)中针对每个所述归一化染色体序列识别出的这个序列标签的数目与每个所述 归一化染色体序列的长度进行关联来针对每个所述归一化染色体序列计算出一个序列标 签密度比；并且（iii)使用在步骤（i)和（ii)中计算出的这些序列标签密度比来针对每个 所述感兴趣的染色体计算出一个单染色体剂量，其中所述染色体剂量是作为针对每个所述 感兴趣的染色体的序列标签密度比与针对每个所述感兴趣的染色体的所述归一化染色体 序列的序列标签密度比的比率来计算的。
[0010] 在另一个实施方案中提供了一种方法，用于在