卵巢癌的诊断方法和治疗方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2021年3月1日提交的美国临时申请号63/155,089和2021年7月15日提交的美国临时申请号63/222,167的优先权权益，这些临时申请均通过引用方式整体并入本文。
技术领域
3.设计用于患有卵巢癌的人类患者的治疗方案的方法、治疗卵巢癌的方法以及通过肿瘤类型表征人类患者的卵巢癌的方法。
背景技术：
4.肿瘤微环境(tme)是一个复杂的生态系统，由肿瘤细胞、浸润性免疫细胞以及与非细胞组分交织在一起的基质细胞组成。不同的细胞和功能表型以及这些组分内部和组分之间的动态相互作用可以塑造肿瘤的独特生物学，并导致对免疫疗法的不同响应。然而，缺乏对这些重要的细胞异质性和相互作用的高分辨率表征。之前研究中的大多数依赖于相对低分辨率的技术，诸如免疫组织化学(ihc)或批量rna测序(rnaseq)反卷积算法(例如，cibersort、xcell)。zhang,l.等人，n.engl.j.med.,348:2023-213(2003)；newman,a.等人，nat.meth.,12:453-457(2015)；aran,d.等人，genome biol.,18:202,doi:10.1186/s13059-017-1349-1(2017)。尽管最近的工作将多组学平台与原位淋巴细胞定量相结合来识别不同的免疫表型(thorsson,v.等人，immunity,48:812-830.e14(2018))，但这些研究缺乏关于细胞异质性和空间分布的较高分辨率的信息。
5.引入肿瘤免疫连续体的概念是为了除了总量以外更好地捕获免疫浸润的空间分布。hegde,p.s.等人，clinical cancer research,22:1865-1874(2016)；hegde,p.s.chen,d.s.,immunity,52:17-35(2020)。基于tme中t细胞的空间分布，tme连续体包含三种免疫表型：(1)免疫炎症/浸润表型，其中t细胞浸润肿瘤上皮；(2)免疫排除表型，其中浸润性t细胞积聚在肿瘤基质而不是肿瘤上皮中；以及(3)免疫沙漠表型，其中t细胞以极低数量存在或完全不存在。在此模型的基础上，开发了一种机器学习方法，该方法将数字病理学cd8 ihc与批量转录组分析相结合，以根据卵巢肿瘤的肿瘤免疫表型对卵巢肿瘤进行分类。desbois,m.等人，cancer res.,79:463(2019).这种分类使得能够基于批量rnaseq数据来表征与不同免疫表型相关联的特征。然而，批量rnaseq的一个先天限制是它缺乏(1)在细胞水平上探究tme异质性的分辨率；和(2)捕获代表性不足的细胞群变化的灵敏度。为此，在过去十年中，单细胞rna测序(scrnaseq)已被用于剖析各种癌症适应症中tme的组成。guo,x.等人，nature medicine,24:978
–
985(2018)；lambrechts,d.等人，nature medicine,24:1277-1289(2018)；li,h.等人，cell,176:77-789,doi:10.1016/j.cell.2018.11.043(2019)；puram,s.v.等人，cell,171:1611-1624.e24(2017)；savas,p.等人，nature medicine,24:986
–
993(2018)；tirosh,i.等人，science,352:189
–
196(2016)；wu,t.d.等人，nature,579:274
–
278(2020)；yost,k.e.等人，nature medicine,25:1251-1259(2019)；
zhang,l.等人，nature,54:321
–
33(2018)；zhang,q.等人，cell 179:829
–
845(2019)。然而，大多数scrnaseq研究都集中在肿瘤浸润性t细胞的表征上。迄今为止，尚未报道tme中其他细胞类型如何塑造免疫表型的系统单细胞表征。
技术实现要素：
6.本公开涉及人类卵巢癌的诊断方法、人类卵巢癌的治疗方法和预测人类卵巢癌的患者结果的方法。本公开包括多个实施例，包括但不限于以下实施例。
7.实施例1是一种设计用于患有卵巢癌的人类患者的治疗方案的方法，该方法包括：
8.a.确定来自该患者的肿瘤样品中gzmk、trem1和trem2中的至少一种的表达水平；以及
9.b.将该表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，
10.其中与该参考样品相比增加的gzmk表达的水平与减少的存活相关联，与该参考样品相比增加的trem1的水平与mdsc样骨髓细胞的存在相关联，并且与该参考样品相比增加的trem2的水平与tam样巨噬细胞的存在相关联。
11.实施例2是一种治疗人类患者的卵巢癌的方法，该方法包括：
12.a.确定来自该患者的肿瘤样品中gzmk、trem1和trem2中的至少一种的表达水平，
13.b.将该表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，其中增加的gzmk表达的水平与减少的存活相关联，增加的trem1的水平与mdsc样骨髓细胞的存在相关联，并且增加的trem2的水平与tam样巨噬细胞的存在相关联；并且
14.c.如果该患者具有
15.i.与该参考样品相比增加的trem1表达，则向该患者施用靶向mdsc样骨髓细胞的疗法；
16.ii.与该参考样品相比增加的trem2表达，则向该患者施用靶向tam样巨噬细胞的疗法；和/或
17.iii.与该参考样品相比降低的gzmk表达，则向该患者施用化学疗法。
18.实施例3是根据实施例1或2所述的治疗方法，其中在该肿瘤中已显示gzmk表达增加后，停止化学疗法。在一些实施例中，gzmk水平相对于进行化学疗法时较早时间点的相同表达水平(在同一患者中)增加。在一些实施例中，gzmk水平相对于参考样品增加。
19.实施例4是根据实施例1至3中任一项所述的治疗方法，其中在该肿瘤中已显示gzmk表达增加后，向该患者给予姑息治疗。
20.实施例5是一种将人类患者的卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型肿瘤的方法，该方法包括：
21.a.确定来自该患者的肿瘤样品中gzmb、gzmk、cd8a、trem1和trem2中的至少一种的表达水平，
22.b.将该表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，其中与该参考样品相比更高的gzmb表达与浸润型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的gzmk表达与排斥型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的cd8a/gzmk双阳性细胞表达与排斥型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的trem1表达与沙漠型肿瘤相关联，并且与该参考样品相比更高的trem2表达与排斥型和浸润型肿瘤相关联。
23.实施例6是一种治疗患有卵巢癌的人类患者的方法，该方法包括：
24.a.通过确定来自该患者的肿瘤样品中gzmb、gzmk、cd8a、trem1和trem2中的至少一种的表达水平而将卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型，
25.b.将该表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，其中与该参考样品相比更高的gzmb表达与浸润型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的gzmk表达与排斥型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的cd8a/gzmk双阳性细胞表达与排斥型肿瘤相关联，与该参考样品相比更高的trem1表达与沙漠型肿瘤相关联，并且与该参考样品相比更高的trem2表达与排斥型和浸润型肿瘤相关联，以及
26.c.利用以下来治疗患者：
27.i.化学疗法或自体/同种异体效应细胞，如果更高的trem1表达表明沙漠型肿瘤的话；
28.ii.免疫疗法(包括检查点疗法)，如果更高的gzmb和/或trem2表达表明浸润型肿瘤的话；
29.iii.姑息治疗，如果更高的gzmk表达表明排斥型肿瘤的话；
30.iv.姑息治疗，如果更高的cd8a/gzmk双阳性细胞表达表明排斥型肿瘤的话；和/或
31.v.免疫效应细胞，诸如t细胞运输调节剂、表观遗传调节剂、肿瘤微环境(tme)重塑分子和/或放射疗法。
32.实施例7是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为健康受试者。
33.实施例8是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为对疗法响应的患者，并且在一些情况下，该患者可以为患有卵巢癌的患者。
34.实施例9是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为患有已知沙漠型肿瘤的患者，并且在一些情况下，该患者可以为患有卵巢癌的患者。
35.实施例10是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为患有已知排斥型肿瘤的患者，并且在一些情况下，该患者可以为患有卵巢癌的患者。
36.实施例11是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为患有已知浸润型肿瘤的患者，并且在一些情况下，该患者可以为患有卵巢癌的患者。
37.实施例12是根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中该参考样品为跨越多个患者和/或受试者编译的数据，并且在一些情况下，该患者可以为患有卵巢癌的患者。
38.实施例13是根据实施例5至12中任一项所述的方法，其中该方法包括评估来自该患者的肿瘤细胞中的gmzb、trem1和trem2中的全部。肿瘤细胞可以为来自肿瘤的基质细胞或免疫细胞。
39.实施例14是根据实施例1至4或7至13中任一项所述的方法，其中该方法包括评估来自该患者的肿瘤细胞中的gmzk、trem1和trem2中的全部。
40.实施例15是根据实施例1至14中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在确定gzmb、gzmk、trem1和trem2中的至少一种的表达水平之前从该患者获得肿瘤样品。
41.实施例16是根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中gzmb、gzmk、trem1和/或trem2的表达水平使用免疫组织化学来确定。
42.实施例17是根据实施例1至15中任一项所述的方法，其中gzmb、gzmk、trem1和/或trem2的表达水平通过测量mrna转录物水平来确定。
43.实施例18是根据实施例17所述的方法，其中该方法进一步包括确定该肿瘤样品中至少一种参考基因的表达水平，即，其中该参考基因是与研究者确定在来自该患者的肿瘤样品中其至少一种的表达水平的基因相同的基因。
44.实施例19是根据实施例17或18所述的方法，其中该方法进一步包括针对该肿瘤样品中至少一种参考基因的mrna转录物水平归一化该mrna转录物水平以提供gzmb、gzmk、trem1和/或trem2的mrna转录物的归一化水平。
45.实施例20是根据实施例17至19中任一项所述的方法，其中该mrna转录物水平通过scrnaseq确定。
46.实施例21是根据实施例1至20中任一项所述的方法，其中在评估gzmb、gzmk、trem1和/或trem2中至少一种的表达水平之前将该肿瘤样品分成肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。
47.实施例22是根据实施例21所述的方法，其中该细胞分离通过facs进行。
48.实施例23是根据实施例19至22中任一项所述的方法，其中在cd8 t细胞中gzmk的mrna转录物的归一化水平增加。
49.实施例24是根据实施例23所述的方法，其中gzmk阳性的cd8 t细胞的数量大于gzmk阴性的cd8 t细胞的数量。
50.实施例25是根据实施例19至24中任一项所述的方法，其中在巨噬细胞中trem2的mrna转录物的归一化水平增加。
51.实施例26是根据实施例2至4或6至25中任一项所述的方法，其中该化学疗法包括白蛋白结合的紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)、六甲蜜胺卡培他滨卡铂、顺铂、环磷酰胺多西他赛依托泊苷(vp-16)、吉西他滨异环磷酰胺伊立替康(cpt-11)、阿霉素(诸如脂质体阿霉素美法仑、紫杉醇培美曲塞拓扑替康、长春瑞滨氯硝柳胺、二甲双胍、bay 87-2243、地西他滨、鸟地西他滨、氮杂胞苷、阿巴伏单抗、奥戈伏单抗、neovax与纳武单抗、安罗替尼、依诺肝素与瑞舒伐他汀、尼拉帕尼、西奥罗尼、曲贝替定与聚乙二醇化脂质体阿霉素、acb-s6-500、sgi-110、来曲唑、帕唑帕尼、帕博西尼、阿帕替尼、马赛替尼、卡巴他赛、imab027、氟达拉滨、abt-888、福他替尼、奥拉帕尼、替莫唑胺、他拉唑帕尼、p53-slp、omp-54f28、肼屈嗪和丙戊酸镁、氟达拉滨、拉帕替尼、盐酸苯达莫司汀、索拉非尼、卡瑞利珠单抗、替西木单抗、生育三烯酚和/或依西美坦。
52.实施例27是根据实施例2至4、7至12或14至25中任一项所述的方法，其中靶向mdsc骨髓细胞的疗法包括：
53.a.顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨和/或紫杉醇；
54.b.肝脏x受体(lxr)β激动剂；
55.c.检查点抑制剂，诸如
56.i.抗pd-1疗法(诸如抗pd-1抗体，包括派姆单抗纳武单抗西米普利单抗特瑞普利单抗、ct-011、单克隆抗体hx0088和抗体
ak105；
57.ii.抗pd-l1疗法(诸如抗pd-l1抗体，包括阿特珠单抗阿维单抗德瓦鲁单抗(medi4736抗pd-l1；)、曲美木单抗、mab zkab001、曲美木单抗和雷莫芦单抗(cyramza)；和/或
58.d.抗tgfβ疗法(诸如抗tgfβ抗体，包括派姆单抗和非苏木单抗)。
59.实施例28是根据实施例6至13或15至26中任一项所述的方法，其中癌症免疫治疗剂包括德瓦鲁单抗(medi4736抗pd-l1；)、莫托莫德、溶瘤病毒、ny-eso-1癌症疫苗、抗xbp1疗法、抗血管生成素疗法、抗dll/notch疗法、抗her2疗法、抗间皮素疗法、抗rankl疗法、抗trop2疗法和/或vegf/vegf-r疗法。
附图说明
60.图1a-g示出了由scrnaseq分析的所有15个卵巢癌样品的肿瘤、免疫和基质区室。图1a示出了从所有测序文库聚集的所有细胞的umap投影，该投影组合了所有患者的肿瘤、基质和免疫区室。细胞根据其facs分选的区室着色。已组合用于单细胞rna测序的基质细胞和免疫细胞以深蓝色着色。图1b示出了由seurat louvain聚类索引的umap。基于上皮标记物(pifo、caps、tmem190、sntn)的表达，簇34被鉴定为正常上皮细胞，并从进一步分析中去除。lambretchs,d.等人，nat.med.1-19,doi:10.1038/s41591-018-0096-5(2018)；wu,t.d.等人，nature,579:274
–
278(2020).图1c示出了与b中相同的umap投影，但去除了正常上皮细胞，并且按照患者身份着色。图1d示出了计算过滤的细胞子集的umap投影，并且按照计算指定的肿瘤、基质和免疫区室着色。图1e示出了代表性基质细胞标记物(col3a1、dcn)、免疫细胞标记物(ptprc、cd79a)和正常上皮细胞标记物(pifo、caps、tmem190、sntn)的标记物基因表达。颜色越深表示表达越高。图1f示出了按照患者来源着色的所有患者的基质细胞的umap投影。图1g示出了按照患者来源着色的所有患者的免疫细胞的umap投影。
61.图2a-f示出了由scrnaseq定义的患者来源的原发性卵巢肿瘤的完整细胞生态系统。图2a示出了研究设计和工作流程的概述。对42个卵巢癌样品进行了批量rna测序和cd8 ihc染色。组合信息用于确定每个样品的免疫表型。在42个样品中，选择了15个免疫表型最清晰的样品，每种免疫表型(浸润型、排斥型和沙漠型)5个样品。对来自各单细胞分离样品的肿瘤细胞、免疫细胞和基质细胞群进行分选，然后进行10x单细胞rna测序。计算分析包括聚类、细胞类型和单一患者分析、批次效应校正以及功能和细胞相互作用分析。使用免疫荧光和rnaish测定以及临床批量rnaseq数据集的反卷积分析验证研究结果。图2b示出了按照患者着色的所有15名患者的肿瘤细胞的umap投影。图例中的缩写对应于肿瘤免疫表型和每个肿瘤免疫表型内的患者编号：des＝沙漠型，exc＝排斥型，inf＝浸润型。图2c示出了按照识别细胞类型着色的所有患者的基质细胞的umap投影。相同的umap示出了细胞类型标记物的基因表达水平。颜色越深表示表达越高。图2d示出了按照识别细胞类型着色的所有患者的免疫细胞的umap投影。相同的umap示出了细胞类型标记物的基因表达水平。颜色越深表示表达越高。图2e示出了每个患者的与总基质细胞计数相比的的基质细胞类型比例。每个堆叠条代表总基质细胞计数调节至1的患者。图2f示出了每个患者的与总免疫细胞计数相比的免疫细胞类型比例。
62.图3a-d示出了scrnaseq选定的卵巢癌样品的基因表达和免疫细胞浸润分析。图3a示出了免疫表型分类器基因的热图，先前描述于desbois,m等人，nature communications,11:5583,doi:10.1038/s41467-020-19408-2(2020)。来自15个卵巢癌样品的批量rna测序的基因表达。图3b示出了以下15个选定的卵巢癌样品的cd8 ihc染色：5个浸润型肿瘤，5个排斥型肿瘤和5个沙漠型肿瘤。图3c示出了用于每个患者的肿瘤、基质和免疫细胞的细胞分选的流式细胞术门控策略。图3d示出了针对每个患者的并按照免疫表型分组的facs分选的epcam (肿瘤)、cd45 (免疫)和cd45-epcam-(基质)细胞的百分比。该图示出了平均值
±
sd，其中每个点代表一名患者。堆叠箱线图示出了使用活细胞中肿瘤、基质、免疫细胞的平均百分比按照免疫表型的区室分布。
63.图4a-c示出了与不同肿瘤免疫表型相关联的肿瘤内在特征。图4a示出了与排斥型/浸润型肿瘤的组合集相比，沙漠型肿瘤细胞中显著富集的标志性基因集(调整后的p值《0.05)。进行伪批量差异表达分析，比较沙漠型肿瘤的肿瘤细胞表达与排斥型/浸润型肿瘤的肿瘤细胞表达，同时针对差异表达模型中每个肿瘤的g2/m状态进行校正(方法)。将表达倍数变化值和调整后的p值组合以对基因进行排序，作为基因集富集分析的输入。图4b示出了按照患者的抗原呈递基因集表达的热图。基于scran归一化表达值计算z评分基因表达。小提琴图示出了按照免疫表型的每个细胞的抗原呈递特征评分的分布。抗原呈递特征评分基于热图中显示的基因计算。图4c示出了按照患者的氧化磷酸化基因集表达的热图。基于scran归一化表达值计算z评分基因表达。小提琴图示出了按照免疫表型的每个细胞的氧化磷酸化特征评分的分布。特征评分基于热图中显示的基因计算。
64.图5a-b示出了由scrnaseq分析的所有15个卵巢癌样品的肿瘤、免疫和基质区室。图5a示出了来自沙漠型(des)与浸润型(inf)/排斥型(exc)基因集富集分析的标志性emt前沿基因的热图。图5b示出了来自des与inf/exc基因集富集分析的标志性血管生成前沿基因的热图。
65.图6示出了浸润卵巢肿瘤的t细胞的细胞和功能特征。图6示出了批量平衡k近邻校正之前和之后所有患者的t细胞的umap投影。
66.图7示出了卵巢癌中骨髓细胞子集的特征。图7示出了批量平衡k近邻校正之前和之后所有患者的骨髓细胞的umap投影。
67.图8a-j示出cd8 t细胞的不同状态表征免疫浸润型和排斥型肿瘤免疫表型。图8a示出了按照识别细胞群着色的来自所有患者的所有t细胞的umap投影。图8b示出了按照cd4 和cd8 t细胞标记物的表达着色的所有t细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图8c示出了每个t细胞群的前20个显著标记(调整后的p值《0.05)的z评分基因表达的热图，示出了选定的基因标签。基于scran归一化的和每个细胞群平均化的表达值计算z评分基因表达。图8d示出了按照gzmb和gmzk的表达着色的所有t细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图8e示出了cd8 gzmb和cd8 gzmk群的t细胞活化和耗竭标记物的z评分基因表达值的热图。基于相应细胞群中以及来自排斥型或浸润型免疫表型的所有细胞的平均scran归一化表达计算z评分。图8f示出了按照eomes、klrg1、cmc1、entpd1和cxcl13的表达着色的所有t细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图8g示出了rnascope测定定量箱线图(顶部)。每个数据点代表基质或肿瘤中双阳性cd8a/gzmk或cd8a/gzmb细胞相对于肿瘤和基质中cd8a/gzmk或cd8a/gzmb阳性细胞总数的比例。cd8a/gzmb(左下)和cd8a/gzmk(右下)共杂交的代表性
图像。蓝色：cd8a。粉色：gzmb或gzmk。箭头突出显示双阳性细胞。t：肿瘤区域。s：基质区域。图8h示出了堆叠条形图，其中cd8 gzmk t细胞相对于所有cd8 t细胞的比例为绿色，并且cd8 gzmb t细胞相对于所有cd8 t细胞的比例为蓝色。每个条代表一个肿瘤，前5个条示出排斥型肿瘤，并且后5个条示出浸润型肿瘤。图8i示出了使用icon7(n＝351)、rosia(n＝308)和tcga(n＝412)批量rna测序数据计算的按照免疫表型的每个样品gzmk/cd8 或gzmb/cd8 评分的箱线图。使用wilcoxon检验确定统计显著性。右图示出条形图，表明逻辑回归模型中gzmb/cd8 评分、gzmk/cd8 评分或其组合的解释方差，从而预测样品在三个数据集中的每一个中具有排斥型还是浸润型免疫表型。使用卡方检验来测试每个模型的解释方差的显著差异。图8j示出了针对cd8 评分和gzmk/cd8 评分变量的具有95％置信区间的cox比例风险模型风险比。模型基于仅具有浸润型和排斥型肿瘤的icon7化学疗法组患者。条形图示出了仅具有cd8 评分或gzmk/cd8 评分的单一模型的解释方差与具有cd8 评分和gzmk/cd8 评分的加性模型的解释方差的比较。使用卡方检验来测试模型的统计差异。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
68.图9a-h示出了浸润卵巢肿瘤的t细胞的细胞和功能特征。图9a示出了具有每个患者中每个t细胞群相对于总t细胞计数的比例的堆叠条形图。图9b示出了具有按照肿瘤免疫表型分组的cd4 il7r细胞、cd4 cxcl13和cd4 foxp3细胞与总cd4 t细胞计数相比的比例的条形图。图9c示出了具有按照免疫表型分组的tgd/nk fgfbp2和cd8 fgfbp2细胞相对于总t细胞计数的比例的条形图。图9d示出了按照所选效应和记忆t细胞标记物的基因表达着色的所有t细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图9e示出了多重if量化箱线图。每个数据点代表肿瘤或基质区域中三阳性cd3 gzmb pd-1 细胞相对于双阳性cd3 gzmb 细胞的比例。排斥型肿瘤(顶部)和浸润型肿瘤(底部)的代表性if图像。深蓝色：dapi，浅蓝色：cd3，粉色：颗粒酶b(gzmb)，黄色：pd-1，绿色：pd-l1和红色：panck。黄色箭头代表双阳性cd3 gzmb 细胞，并且绿色箭头代表三阳性cd3 gzmb pd-1 细胞。图9f示出了rnascope测定定量箱线图。每个数据点代表肿瘤和基质中总基质 肿瘤双阳性cd8a/gzmk或cd8a/gzmb细胞相对于cd8a总数的比例。图9g示出了具有已针对本研究、icon7和rosia临床试验数据集和tcga进行单细胞分析的15个卵巢癌样品的批量rna测序数据的按照免疫表型的每个患者cibersort cd8 t细胞特征z评分的箱线图。gzmb和gzmk基因表达已从特征z评分计算中排除。图9h示出了具有cd8 评分、gzmb/cd8 评分和gzmk/cd8 评分变量的具有95％置信区间的cox比例风险模型风险比。模型基于仅具有浸润型和排斥型肿瘤的icon7化学疗法组患者。对于图9b-c，通过t统计量将患者变异性解释为随机效应来确定显著性。对于图9e-g，通过wilcoxon检验确定显著性。*p值《0.05，****p值《0.0001。n.s：不显著。
69.图10a-d示出了成纤维细胞表型与t细胞定位的关联。图10a示出了按照识别细胞群着色的来自所有患者的成纤维细胞的umap投影。图10b示出了按照特征评分表达着色的所有成纤维细胞的umap投影。特征评分表达如之前在dominguez,c.x等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；和elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019)中所述得出。图10c示出了每个成纤维细胞群的前20个标记物的z评分基因表达的热图。基于scran归一化的和每个细胞群平均化的表达值计算z评分基因表达。图10d示出了具有按照肿瘤免疫表型分组的tgfb caf和il1 caf细胞与总成纤维细胞计数相比的比例的条形图。每个单一点代表一名患者。通过t统计量将患者变异性解释为随机效应来确定显著性。
70.图11a-b示出了卵巢癌中的成纤维细胞群。图11a示出了按照识别的umap簇分组的每个细胞caf特征评分分布的小提琴图。caf特征评分的推导如之前在dominguez,c.x.等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；和elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019)中所述得出。图11b示出了具有每个患者中每个成纤维细胞群相对于总成纤维细胞计数的比例的堆叠条形图。
71.图12a-f示出了与不同肿瘤免疫表型相关的表型和功能多样的骨髓细胞子集。图12a示出了按照识别细胞群着色的来自所有患者的骨髓细胞的umap投影。图12b示出了按照选择的细胞群标记物基因的表达着色的所有骨髓细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图12c示出了按照识别的单核细胞/巨噬细胞群着色的来自所有患者的所有单核细胞/巨噬细胞的扩散映射投影。基于bbknn校正数据投影计算扩散映射。图12d示出了按照来自zhang,q.等人，cell,179,829-845e820(2019)的tam样和mdsc样骨髓子集的特征评分着色的骨髓细胞的umap投影。具有按照识别的巨噬细胞/单核细胞群分组的每个细胞特征评分的小提琴图。图12e示出了按照trem1和trem2表达着色的所有骨髓细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图12f示出了组合的cd169/cx3cr1巨噬细胞和marco巨噬细胞/fcn1单核细胞相对于总单核细胞和巨噬细胞细胞计数的比例的条形图。通过使用wilcoxon秩和检验来确定显著性。
72.图13a-d示出了卵巢癌中骨髓细胞子集的特征。图13a示出了按照选定的骨髓细胞群标记物的表达着色的所有患者的骨髓细胞的umap投影。颜色越深表示表达越高。图13b示出了每个鉴定的单核细胞/巨噬细胞群的前20个标记物的z评分基因表达的热图。基于scran归一化的和每个细胞群平均化的表达值计算z评分基因表达。图13c示出了基于scran归一化表达值的按照细胞的cibersort单核细胞和巨噬细胞特征评分的小提琴图。小提琴图按照已识别的巨噬细胞/单核细胞群分组。图13d示出了具有每个患者中每个单核细胞/巨噬细胞群相对于总单核细胞/巨噬细胞计数的比例的堆叠条形图。
73.图14a-g示出了由跨区室相互作用形成的肿瘤免疫表型。图14a示出了按照区室和细胞类型的cxcl16和cxcr6表达的点图。图14b示出了按照免疫表型分组的每个患者的肿瘤细胞中平均cxcl16 scran归一化表达的箱线图。图14c示出了按照细胞类型的cxcr3和相应趋化因子配体表达的点图，其中的热图描绘了三种肿瘤免疫表型中相应细胞的富集。图14d示出了免疫和基质群以及肿瘤细胞区室中cxcl14、cxcl12和cxcr4的平均表达的点图，其中的热图描绘了三种肿瘤免疫表型中相应细胞的富集。图14e示出了按照细胞类型的cx3cr1和相应趋化因子配体表达的点图。图14f示出了按照骨髓细胞类型的cx3cr1表达的箱线图。图14g示出了在每种免疫表型的tme背景下的跨区室趋化因子配体-受体相互作用的模型。基于浸润型肿瘤中il1 caf较高的趋势来描绘成纤维细胞模型。对于图14a、c、d和e，每个点的颜色强度表示所有患者的平均scran归一化表达；大小代表表达基因的细胞与该组细胞总数相比的百分比。对于图14b和f，每个点表示每个患者的平均表达水平。使用wilcoxon检验计算统计显著性。
74.图15a-i示出了跨越肿瘤、免疫和基质区室的趋化因子配体-受体分析。图15a示出了按照免疫细胞群的cxcl16表达的箱线图。图15b示出了按照免疫表型着色的t细胞中的cxcr6表达与肿瘤细胞中的cxcl16表达的散点图。图15c示出了按照免疫表型着色的所有免疫细胞中的cxcr3表达与单核细胞/巨噬细胞中的cxcl19、cxcl10或cxcl11表达的散点图。
点大小表示cd169巨噬细胞与所有单核细胞/巨噬细胞相比的相对比例。图15d示出了按照细胞类型的cxcr5和cxcl13表达的点图。图15e示出了按照免疫表型着色的所有b-til中的cxcr5表达与cd4 t细胞中的cxcl13表达的散点图。点大小表示cd4 cxcl13 t细胞与所有cd4 t细胞相比的相对比例。图15f示出了按照免疫表型着色的所有免疫细胞中的cxcr4表达与成纤维细胞中的cxcl12或cxcl14表达的散点图。点大小表示il1 caf与所有成纤维细胞相比的相对比例。图15g示出了按照免疫表型着色的所有骨髓细胞中的cx3cr1表达与基质细胞中的ccl26或cx3cl1表达的散点图。图15h示出了按照细胞类型的ccr7和相应趋化因子配体表达的点图。按照免疫表型分组的每个患者的内皮细胞中平均ccl21 scran归一化表达的箱线图。使用wilcoxon检验计算统计显著性。图15i示出了按照免疫表型着色的b-til中的ccr7表达与内皮细胞中的ccl21表达的散点图。在图15d和15h中，每个点的颜色强度表示所有患者的平均scran归一化表达；大小代表表达基因的细胞与该组细胞总数相比的百分比。
75.图16示出了小提琴图，该图示出每个患者的每个细胞抗原呈递和氧化磷酸化特征评分的分布。基于scran归一化表达值计算z评分基因表达。
76.图17a和17b示出了浸润卵巢肿瘤的t细胞的细胞和功能特征。图17a示出了按照识别的t细胞群分组的每个细胞功能障碍和耗竭评分的小提琴图。特征评分已源自li h.等人，cell,176,775-789e718(2019)和yost,k.e.等人，nature medicine,25,1251-1259(2019)。通过t统计量将患者变异性解释为随机效应来确定显著性。图17b示出了每个t细胞亚群中tcf7表达的箱线图。每个点代表一名患者和t细胞亚群中的平均tcf7表达。通过wilcoxon检验确定显著性。
77.图18示出了卵巢癌中骨髓细胞子集的特征。图18示出了bbknn校正后所有患者的dc细胞的umap投影。细胞按照其识别dc亚群簇着色。
78.图19示出了卵巢癌中骨髓细胞子集的特征。图19示出了每个识别的dc亚群的前20个标记物的z评分基因表达的热图。基于scran归一化的和每个细胞群平均化的表达值计算z评分基因表达。
具体实施方式
79.i.定义
80.除非另有说明，否则本文中使用的下列术语和短语意图具有以下含义：
81.如本文所用，术语“几乎不存在t细胞”是指存在的t细胞的量，其包括从非常低的量(小于20％的肿瘤区域被t细胞占据并且t细胞密度为在病理学家定义的t细胞相对密度范围0-3中的0)至使用常规方法或测量或检测无法检测到的量或低于检测限(lod)的量。
82.药剂(例如药物组合物)的“有效量”是指能够以必需的剂量在必需的时段内有效地实现期望的治疗或预防结果的量。
83.如本文所用，“治疗”(及其语法变体)是指试图改变所治疗个体的疾病的自然病程，并且可以执行以用于预防或可以在临床病理学过程中执行的临床干预措施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、降低疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些方面，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
84.数字范围包括定义范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关联的误差，测量和可测量值被理解为近似值。此外，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contain)”、“含有(contain)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用并不旨在是限制性的。应理解，前述通用性说明和详细说明两者均为仅仅是示例性的和解释性的，并且不是对教导的限制。
85.除非说明书中特别指出，否则说明书中记载“包含”各种组分的实施例也被认为是“由所记载的组分组成”或“基本上由所记载的组分组成”；说明书中记载“由各种组分组成”的实施例也被认为是“包含所记载的组分”或“基本上由所记载的组分组成”；并且说明书中记载“基本上由各种组分组成”的实施例也被认为是“由所记载的组分组成”或“包含”所记载的组分(这种互换性不适用于权利要求中这些术语的使用)。术语“或”以包含性含义使用，即等同于“和/或”，除非上下文另外明确指出。
86.说明书和权利要求书中的所有数字均由术语“约”修饰。这意味着每个数字都包括定义为所讨论的数值或范围的10％的微小变化。
87.现在将详细参考本发明的某些实施例，其实例在附图中示出。尽管将结合所示出的实施例描述本发明，但是应当理解，它们并不旨在将本发明限制于那些实施例。相反，本发明旨在覆盖可以包括在如所附权利要求和包括的实施例所限定的本发明内的所有替代、修改和等同形式。
88.此处使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为以任何方式限制期望的主题。如果通过引用并入的任何材料与本说明书中定义的任何术语或本说明书的任何其他明确内容相矛盾，则以本说明书为准。尽管结合各种实施例描述了本教导，但本教导并不旨在限于此类实施例。相反，本教导涵盖本领域技术人员将理解的各种替代、修改和等同物。
89.ii.用于设计治疗方案的诊断方法
90.本技术包括用于人类患者的卵巢癌的诊断方法。在一些实施例中，该方法包括基于这些诊断方法设计治疗方案。该方法涉及来自患者的肿瘤样品中颗粒酶k(gzmk)、颗粒酶b(gzmb)和在骨髓细胞上表达的触发受体(trem)蛋白trem1和trem2中的至少一种的表达。
91.在一些实施例中，该方法包括评估来自患者的肿瘤样品中的gmzk、trem1和trem2中的全部。在一些实施例中，该方法包括评估来自患者的肿瘤细胞中的gmzb、trem1和trem2中的全部。
92.因此，在一些实施例中，肿瘤样品可以是肿瘤细胞。肿瘤细胞可以为来自肿瘤的基质细胞或免疫细胞。在一些实施例中，肿瘤样品可以是肿瘤活检。
93.a.gzmk表达
94.cd8 t细胞在针对肿瘤发育和病毒或细菌感染的防御响应中发挥作用。在一些实施例中，cd8 t细胞数量与癌症的无进展存活相关联。
95.结合表面抗原后，cd8 t细胞可能差异表达编码细胞毒性关键效应分子的基因。颗粒酶是一组被表达以识别、结合和裂解靶细胞的效应分子。颗粒酶的实例包括颗粒酶a、b、h、k和m(gzma、gzmb、gzmh、gzmk和gzmm)。在许多实施例中，gzmk表达在排斥型肿瘤细胞中的cd8 t细胞中升高。在一些实施例中，表达gzmk的cd8 t细胞(gzmk/cd8 t细胞)在浸润型和沙漠型肿瘤细胞中发现。在一些实施例中，gzmk/cd8 t细胞在浸润型和沙漠型肿瘤细胞中
几乎不存在。
96.在许多实施例中，设计用于患有卵巢癌的人类患者的治疗方案的方法包括确定gzmk的表达水平。在一些实施例中，该方法包括确定来自患者的肿瘤样品中的gzmk表达水平。在一些实施例中，肿瘤样品包含tme、免疫浸润表型、免疫排除表型和/或免疫沙漠表型的细胞。
97.在许多实施例中，该方法进一步包括将gzmk的表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，如下文第ii.e节中所述。在一些实施例中，与参考样品相比，gzmk的较高表达与减少的存活相关联。在一些实施例中，与参考样品相比，增加的gzmk的水平与排斥型肿瘤相关联。
98.b.gzmb表达
99.在一些实施例中，gzmb表达而非gzmk表达在cd8 t细胞中升高。在一些实施例中，如下文第ii.e节中所述，与参考样品相比，gzmb的较高表达与浸润肿瘤表型相关联。
100.c.trem1表达
101.在许多实施例中，设计用于患有卵巢癌的人类患者的治疗方案的方法包括确定来自患者的肿瘤样品中trem1的表达水平。浸润人类肿瘤的巨噬细胞中的高trem1的表达与侵袭性肿瘤行为和患者存活差相关联。trem1的药理学抑制可以通过减弱炎性响应来提供存活优势并防止器官损伤或肿瘤生长。
102.在许多实施例中，该方法包括将trem1表达水平与参考样品进行比较，如下文第ii.e节中所述。在一些实施例中，与参考样品相比，增加的trem1表达水平与mdsc样骨髓细胞的存在相关联。在一些实施例中，与参考样品相比，增加的trem1水平与沙漠型肿瘤相关联。
103.d.trem2表达
104.在许多实施例中，设计用于患有卵巢癌的人类患者的治疗方案的方法包括确定来自患者的肿瘤样品中trem2的表达水平。trem2在肝细胞癌和结直肠癌中充当肿瘤抑制因子。trem1和trem2各自与不同的骨髓细胞子集相关，并且可以影响卵巢癌的治疗选择。
105.在许多实施例中，该方法包括将trem2表达水平与参考样品进行比较，如下文第ii.e节中所述。在一些实施例中，与参考样品相比，增加的trem2表达水平与tam样巨噬细胞的存在相关联。在一些实施例中，与参考样品相比，增加的trem2水平与排斥型和/或浸润型肿瘤相关联。
106.e.参考样品的使用
107.在许多实施例中，将gzmk、gzmb、trem1和/或trem2的表达水平与参考样品进行比较。
108.在一些实施例中，参考样品是健康受试者。在一些实施例中，参考样品是正常组织，诸如来自身体的相同部分。正常组织可以来自健康受试者或健康受试者池、相同患者、不同患者或患者池。
109.在一些实施例中，参考样品是患有已知的沙漠型肿瘤、已知的排斥型肿瘤或已知的浸润型肿瘤的患者。参考样品可以指跨越患者肿瘤样品的tme的细胞，或具有特定免疫表型(诸如浸润型、排斥型或沙漠型)的细胞。在一些实施例中，参考样品是浸润型细胞、排斥型细胞和/或沙漠型细胞的样品。在一些实施例中，参考样品是在受试者病史或患者治疗方
案中在特定时间点获得的肿瘤样品。在一些实施例中，参考样品可以来自相同患者、不同患者或患者池。
110.在一些实施例中，参考样品是响应疗法的患者。
111.在一些实施例中，参考样品是跨越多个患者和/或受试者编译的数据。在一些实施例中，参考样品将是患者肿瘤组织样品池，其中预先验证gzmk、trem1和trem2基因表达水平中的每一种相对于一种或多种参考基因(即，管家基因)的阈值的高与低。
112.f.基因表达剖析
113.可以使用多种技术来测量来自患者肿瘤样品的gzmk、gzmb、trem1和/或trem2的表达水平。在一些实施例中，使用dna或rna测序方法确定表达水平。在一些实施例中，该方法包括测量mrna或rna转录物。在一些实施例中，rna转录物通过scrnaseq确定。gzmk、gzmb、trem1和/或trem2的mrna转录物的测量水平可以针对肿瘤样品中至少一种参考基因(即，管家基因)的mrna转录物进行归一化。
114.在一些实施例中，gzmk的rna转录物的归一化水平在cd8 t细胞中增加。在一些实施例中，gzmk阳性的cd8 t细胞的数量大于gzmk阴性的cd8 t细胞的数量。在一些实施例中，trem2的rna转录物的归一化水平在巨噬细胞中增加。
115.在一些实施例中，使用免疫组织化学确定gzmk、gzmb、trem1和/或trem2的表达水平。
116.在一些实施例中，基因表达剖析可以包括细胞分选技术，诸如荧光激活细胞分选(facs)。
117.在一些实施例中，在评估gzmk、gzmb、trem1和/或trem2中至少一种的表达水平之前，可以将肿瘤样品分成肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞。
118.iii.将卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型肿瘤的方法
119.本发明的方法包括根据免疫表型：沙漠型、排斥型和浸润型来表征人类患者的卵巢癌的方法。该方法可以包括确定来自患者的肿瘤样品中gzmk、gzmb、trem1和trem2中的至少一种的表达水平。如上文第ii节所述，将每种基因表达水平与参考样品中的表达水平进行比较。本文公开的表征方法可以用于影响治疗患有卵巢癌的人类患者的方法。在一些实施例中，治疗方法包括将卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型。
120.在一些实施例中，与参考样品相比，更高的gzmk的表达与排除肿瘤表型相关联。
121.在一些实施例中，与参考样品相比，更高的gzmb的表达与浸润肿瘤表型相关联。
122.在一些实施例中，与参考样品相比，更高的trem1的表达与沙漠肿瘤表型相关联。
123.在一些实施例中，与参考样品相比，更高的trem2的表达与排除和浸润肿瘤表型相关联。
124.因此，这些关联或者作为唯一数据点或者与其他数据点相结合，允许临床医生将卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型。
125.iv.治疗方法
126.本发明的方法包括治疗人类患者的卵巢癌的方法。在许多实施例中，该方法包括确定来自患者的肿瘤样品中gzmk、gzmb、trem1和trem2中的至少一种的表达水平，如上文第ii节中所述。在许多实施例中，该方法包括将gzmk、trem1和trem2中的至少一种的表达水平与参考样品中的表达水平进行比较，如上文第ii.e节中所述。
127.在一些实施例中，如上文第iii节中所述的将卵巢癌表征为沙漠型、排斥型或浸润型的方法可以影响该治疗方法。表征方法包括确定来自患者的肿瘤样品中gzmk、gzmb、trem1和trem2中的至少一种的表达水平。如上文第ii节所述，将每种基因的表达与参考样品进行比较。
128.a.与患者存活增加相关联的治疗具有较低的gzmk表达的肿瘤的方法
129.在一些实施例中，与参考样品相比，较低的gzmk表达与增加的患者存活相关联。在一些实施例中，该方法包括向患者施用化学疗法。在一些实施例中，化学疗法包括白蛋白结合的紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)、六甲蜜胺卡培他滨卡铂、顺铂、环磷酰胺多西他赛依托泊苷(vp-16)、吉西他滨异环磷酰胺伊立替康(cpt-11)、阿霉素(诸如脂质体阿霉素)、美法仑、紫杉醇培美曲塞拓扑替康、长春瑞滨氯硝柳胺、二甲双胍、bay 87-2243、地西他滨、鸟地西他滨、氮杂胞苷、阿巴伏单抗、奥戈伏单抗、neovax与纳武单抗、安罗替尼、依诺肝素与瑞舒伐他汀、尼拉帕尼、西奥罗尼、曲贝替定与聚乙二醇化脂质体阿霉素、acb-s6-500、sgi-110、来曲唑、帕唑帕尼、帕博西尼、阿帕替尼、马赛替尼、卡巴他赛、imab027、氟达拉滨、abt-888、福他替尼、奥拉帕尼、替莫唑胺、他拉唑帕尼、p53-slp、omp-54f28、肼屈嗪和丙戊酸镁、氟达拉滨、拉帕替尼、盐酸苯达莫司汀、索拉非尼、卡瑞利珠单抗、替西木单抗、生育三烯酚和/或依西美坦。
130.b.表示排斥型肿瘤的治疗具有较高gzmk表达的肿瘤的方法
131.在一些实施例中，较高的gzmk表达与患者减少的存活相关联和/或表示排斥型肿瘤。在一些实施例中，该方法包括向患者施用化学疗法。在一些实施例中，较高的gzmk表达与患者减少的存活相关联。在一些实施例中，在肿瘤中已显示gzmk表达后停止化学疗法。在一些实施例中，在肿瘤中已显示gzmk表达后向患者给予姑息治疗。
132.c.表示沙漠型肿瘤的治疗具有较高trem1表达的肿瘤的方法
133.在一些实施例中，较高的trem1表达表示沙漠型肿瘤。在一些实施例中，肿瘤是卵巢肿瘤。在这些实施例的一些中，治疗方法包括用化学疗法或自体/同种异体效应细胞治疗患者。在一些实施例中，化学疗法包括白蛋白结合的紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)、六甲蜜胺卡培他滨卡铂、顺铂、环磷酰胺多西他赛依托泊苷(vp-16)、吉西他滨异环磷酰胺伊立替康(cpt-11)、阿霉素(诸如脂质体阿霉素)、美法仑、紫杉醇培美曲塞拓扑替康、长春瑞滨氯硝柳胺、二甲双胍、bay 87-2243、地西他滨、鸟地西他滨、氮杂胞苷、阿巴伏单抗、奥戈伏单抗、neovax与纳武单抗、安罗替尼、依诺肝素与瑞舒伐他汀、尼拉帕尼、西奥罗尼、曲贝替定与聚乙二醇化脂质体阿霉素、acb-s6-500、sgi-110、来曲唑、帕唑帕尼、帕博西尼、阿帕替尼、马赛替尼、卡巴他赛、imab027、氟达拉滨、abt-888、福他替尼、奥拉帕尼、替莫唑胺、他拉唑帕尼、p53-slp、omp-54f28、肼屈嗪和丙戊酸镁、氟达拉滨、拉帕替尼、盐酸苯达莫司汀、索拉非
尼、卡瑞利珠单抗、替西木单抗、生育三烯酚和/或依西美坦。
134.在一些实施例中，治疗包括靶向mdsc样骨髓细胞的疗法。在一些实施例中，mdsc样骨髓细胞是卵巢肿瘤细胞。在一些实施例中，靶向mdsc样骨髓细胞的疗法可以包括顺铂、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、紫杉醇、肝脏x受体(lxr)β激动剂、检查点抑制剂和/或抗tgfβ疗法(诸如抗tgfβ抗体，包括派姆单抗和非苏木单抗)。在一些实施例中，检查点抑制剂疗法是抗pd-1疗法，诸如派姆单抗纳武单抗西米普利单抗特瑞普利单抗、ct-011、单克隆抗体hx0088和抗体ak105。在一些实施例中，检查点抑制剂疗法是抗pd-l1疗法，诸如阿特珠单抗阿维单抗德瓦鲁单抗(medi4736抗pd-l1；)、曲美木单抗、mab zkab001、曲美木单抗和雷莫芦单抗(cyramza)。
135.d.表示浸润型肿瘤的治疗具有较高gzmb和/或较高trem2表达的肿瘤的方法
136.在一些实施例中，较高的gzmb表达和/或较高的trem2表达表示浸润型肿瘤。在一些实施例中，浸润型肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施例中，治疗包括靶向tam样巨噬细胞的疗法。在一些实施例中，治疗方法包括用癌症免疫疗法(诸如例如检查点抑制剂疗法)来治疗患者。在一些实施例中，检查点抑制剂疗法是抗pd-1疗法，诸如派姆单抗纳武单抗西米普利单抗特瑞普利单抗、ct-011、单克隆抗体hx0088和抗体ak105。在一些实施例中，检查点抑制剂疗法是抗pd-l1疗法，诸如阿特珠单抗阿维单抗德瓦鲁单抗(medi4736抗pd-l1；)、曲美木单抗、mab zkab001、曲美木单抗和雷莫芦单抗(cyramza)。在一些实施例中，癌症免疫治疗剂可以包括德瓦鲁单抗(medi4736抗pd-l1；)、莫托莫德、溶瘤病毒、ny-eso-1癌症疫苗、抗xbp1疗法、抗血管生成素疗法、抗dll/notch疗法、抗her2疗法、抗间皮素疗法、抗rankl疗法、抗trop2疗法和vegf/vegf-r疗法。
137.e.治疗具有较高gzmb、trem1和/或trem2表达的肿瘤的方法
138.在一些实施例中，治疗具有较高gzmb、trem1和/或trem2表达的肿瘤的方法包括用免疫效应细胞治疗患者。免疫效应细胞的实例包括t细胞运输调节剂、表观遗传调节剂、tme重塑分子和放射疗法。
139.实例
140.以下是本发明的方法和组合物的实例。应当理解，在给出以上提供的一般描述的情况下，可以实践各种其他实施方案。
141.我们通过转录剖析人类卵巢癌的肿瘤免疫连续体，从而利用scrnaseq分析和免疫组织化学来表征这个复杂生态系统的组成和细胞-细胞相互作用。分析了源自15名新诊断卵巢癌患者的肿瘤组织中总共93,218个单细胞，使得我们能够在三种免疫表型的背景下定义针对肿瘤、免疫和基质区室的细胞和功能表型。同时，我们采用原位测定来表征浸润型和排斥型肿瘤中cd8 gzmb和cd8 gzmk t细胞的空间分布，并在来自卵巢癌患者的多个独立的大型批量rnaseq临床数据集中验证它们在不同免疫表型中的差异富集。最后，我们在趋化因子配体-受体相互作用的背景下识别了这些不同细胞表型内部和之间的潜在串扰。我们全面的单细胞分析研究为形成不同肿瘤免疫表型的生物学提供了更多见解，并且可能影响
沿着免疫连续体转移肿瘤的新治疗策略，从而优化癌症免疫疗法的临床益处。
142.实例1.单细胞转录分析定义了患者来源的原发性卵巢肿瘤的完整细胞生态系统
143.1.1.临床样品-人类肿瘤样本、采购及加工
144.kiyatec样品收集。在提供书面知情同意书后，》18岁的患有疑似或已知卵巢癌的患者被纳入prisma health(以前称为greenville health system)癌症研究所的机构审查委员会(irb)(irb-委员会c)批准的生物学方案。组织采集根据prisma health指定的指南和规定进行，并获得了所有参与者的知情同意。在原发肿瘤部位的手术减积或腹腔镜活检中收集新鲜组织。
145.原位验证收集。从cureline,inc(brisbane,ca,us)采购独立的卵巢癌组织收集物(n＝17)用于原位验证。采购的样品还获得了适当的机构审查委员会(irb)的批准。
146.1.2.cd8免疫组织化学
147.将新鲜组织样品固定在福尔马林中并包埋在石蜡中，并将10μm切片安装在载玻片上。使用tris-edta缓冲液，ph 9.0(abcam,cambridge,ma)进行再水合和抗原修复。载玻片用抗cd8[144b](abcam,cambridge,ma)或igg1[b11/6]同型对照(abcam,cambridge,ma)在室温下均以1:50稀释度染色2小时。使用小鼠和兔特异性hrp/dab ihc检测试剂盒(abcam,cambridge,ma)检测染色。图像在olympus ix70显微镜上使用jenoptik(jena,germany)progres c14plus相机和progres capturepro软件拍摄。
[0148]
1.3.scrnaseq的细胞制备
[0149]
在手术后24小时内，收到卵巢组织并立即酶促解离成单细胞，将该单细胞冷冻保存在含有10％ dmso的培养基中，但exc5除外，其组织在解离前被冷冻。该方案已由kiyatec验证。将冷冻的肿瘤细胞悬浮液解冻并在facs染色缓冲液(1x pbs ph 7.4，0.2％ bsa，0.09％ naazide)中稀释。在具有双荧光ao/pi的cellometer auto 2000上对细胞进行计数。然后，将细胞与fcr阻断试剂一起孵育30分钟，然后与抗体一起在冰上孵育另外30分钟。用活和死标记物7-aad(1/16)和钙黄绿素蓝(1/500)对细胞进行染色，紧接着在facsaria fusion上进行分选。排除双联体并基于低7-aad和高钙黄绿素蓝识别活细胞。用于将细胞分选到每个卵巢组织的肿瘤、免疫和基质区室中的抗体是抗cd45-apc-cy7(1/100,#304014,biolegend)和抗epcam-apc(1/20,#324208,biolegend)。分选后，立即根据细胞分选仪提供的细胞计数旋转样品并以600-1,000个细胞/μl重悬于pbs中。为了制备预混液 细胞悬浮液，我们参考chromium单细胞3'试剂盒用户指南(v2 chemistry)(10x genomics,california,usa)中的细胞悬浮液体积计算表将适当体积的无核酸酶水和相应体积的单细胞悬浮液(目标细胞回收为5000-6000个细胞)添加到预混液中，每管中总共100μl。将90μl上述混合物加载到chromium芯片b中，随后根据方案(凝聚珠和多重试剂盒v2和芯片试剂盒(#pn-120237,10x genomics))将凝胶珠和其他试剂加载到芯片中。在运行chromium控制器进行乳液包凝胶珠(gem)生成和细胞条形码后，将gem转移到热循环仪中进行gem逆转录孵育，然后进行gem-rt后清理、cdna扩增、qc和定量。
[0150]
1.4.scrnaseq文库的制备
[0151]
对于每位患者，我们为每个区室(肿瘤、免疫和基质)生成一个文库，从而为每个患者产生三个文库，但四个沙漠型肿瘤除外，该沙漠型肿瘤的免疫细胞和基质细胞没有分离，并且每个区室(肿瘤和免疫/基质)生成两个文库。根据制造商的说明
(support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep/doc/user-guide-chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v2-chemistry)，使用chromium单细胞3'文库(v2 chemistry)进行3'基因表达文库的构建。为了减少技术批次效应，我们按照区室和免疫表型二者随机化文库的生成。文库构建后qc由agilent生物分析仪高灵敏度芯片(#5067-4627,agilent technologies,santa clara,california,usa)完成，并且文库由kapa文库定量通用试剂盒(#07960140001,roche)定量。
[0152]
1.5.scrnaseq文库的测序和原始数据处理
[0153]
汇集每个患者的所有文库并在带有高输出试剂盒v2或v2.5的illumina nextseq500上测序(150个循环)。我们确认，试剂盒v2和v2.5均生成相似的结果，并且通过比较两个试剂盒对相同文库的测序结果，未检测到技术批次效应。使用cellranger v3.0.2(10xgenomics.com)将读数映射到人类基因组(grch38)。首先，使用cellranger mkfastq命令和cellranger样品单将每个流动池的碱基识别文件多路分解为fastq文件。其次，通过在引数中指定文库名称，调用cellranger count命令来生成每个文库的单细胞特征计数。过滤的特征条形码矩阵用于进一步的数据分析。
[0154]
1.6.scrna测序数据分析
[0155]
cellranger的核心scrnaseq步骤使用seurat v3.0.0进行。首先，使用read10x和makeseuratobject将每个文库转换为seurat对象。为了对区室注释进行过滤，并将在汇集文库中测序的沙漠型基质与沙漠型免疫细胞分离，将所有44个文库的数据合并(图1a-e)。将数据过滤以包括在至少10个细胞中表达的基因以及表达至少200个基因、不超过6000个基因和少于5％的线粒体转录物的细胞。这些截止值通过每个文库的qc检查来确定。随后，对数据进行对数归一化，通过均值方差检查检测可变基因，缩放并计算主成分。使用肘部图确定重要主成分，并将其用于umap降维。基于facs基质和肿瘤注释，以能够最好地分离混合基质-肿瘤界面的分辨率进行簇识别。为了识别免疫、基质、肿瘤和正常上皮簇，计算每个簇的以下基因标记物的平均表达：1)免疫区室：ptprc、cd79a，2)基质区室：vwf、pecam1、col1a1、col3a1、dcn，3)肿瘤区室：epcam，4)正常上皮细胞：pifo、caps、tmem190、sntn。簇身份在平均表达截止值大于0.8时确定，这产生与facs注释最一致的注释。与其facs注释的区室以外的区室聚类的细胞和正常上皮细胞簇(簇34)被排除在进一步分析之外。
[0156]
每个过滤和新注释的区室的原始数据被单独处理以用于如上所述的进一步下游分析。分别确定每个区室的降维主成分的数量。基质和免疫区室中的主要细胞类型通过以下基因标记物的每簇平均表达来定义：1)成纤维细胞：dcn、c1r、pdgfra、ogn，2)内皮细胞：pecam1，3)周细胞：rgs5，4)b-til：ms4a1，5)浆细胞：sdc1，6)t细胞：cd2、cd3e，7)骨髓细胞：cd14、csf1r、lilra4。为了进一步分析成纤维细胞、t细胞和骨髓细胞群，将数据子集化到这些细胞中，并如上所述从原始数据开始进行处理。
[0157]
对每个单独患者的t细胞和骨髓细胞群的分析通过按照患者划分子集化群并如上所述处理原始数据来进行。骨髓细胞或t细胞少于50个的患者数据被排除在单一患者分析之外。使用seurat findallmarkers函数和wilcoxon检验识别阳性簇基因标记物。为了分析成纤维细胞表型，4个沙漠型成纤维细胞被排除在外，因为它们与所有其他肿瘤分开聚类。
[0158]
umap、热图、小提琴图、箱线图中绘制的基因表达值是基于原始表达值(scran v1.10.2)计算的scran归一化表达值。lun,a.,genome biol.1-14(2016)；doi:10.1186/
scientific)使用40倍物镜对所得载玻片进行扫描。使用图像分析软件(indica labs)分析扫描图像的肿瘤和肿瘤相关基质区域中的cd8a、gzmb和gzmk染色。基于每个细胞的点数对rnascope信号进行计数并分箱为5类(箱0＝0点/细胞、箱1＝1
–
3点/细胞、箱2＝4
–
9点/细胞、箱3＝10
–
15点/细胞，箱4＝》15点/细胞，其中簇中的点》10％)。计算综合h评分以结合信号水平和每个箱中的细胞百分比，如下所示：h评分＝(0x箱0中的细胞百分比) (1x箱1中的细胞百分比) (2x箱2中的细胞百分比) (3x箱3中的细胞百分比) (4x箱4中的细胞百分比)。h评分范围为0到400。分别对肿瘤和基质区域的h评分进行评分。
[0176]
3.4.批量rnaseq文库的制备和测序
[0177]
使用rlt缓冲液(#79216,qiagen)，接着使用rna提取(#74136,qiagen)机械解离新鲜组织样品。按照制造商的说明使用truseq(#20020595,illumina)生成文库，汇集并在带有高输出试剂盒v2(#20024907,illumina)的illumina nextseq500上测序。
[0178]
3.5.批次效应校正和扩散伪时间分析
[0179]
由于对成纤维细胞、t细胞和骨髓细胞群的分析揭示了患者驱动的聚类，因此我们使用批量平衡k近邻校正(bbknn)方法校正患者效应(本文的批次效应)。polanski,k.等人，bioinformatics.36:964-965(2020)。为此，我们使用reticulate v1.12将python模块scanpy v1.4.3(包括anndata v0.6.21、numpy v1.17.0、bbknn v1.3.9)导入到r中。简而言之，将bbknn应用于由seurat计算并由肘部图确定的重要主成分，使用scanpy识别簇并将所有结果传输回seurat。为了验证bbknn仅校正技术差异而不校正生物学差异，将所得簇及其标记物与单个文库簇分析的结果肘部图手动比较(图11a和11b)。
[0180]
3.6扩散伪时间分析
[0181]
扩散伪时间分析通过在bbknn校正的nndata对象上的scanpy扩散映射函数进行，并传输回seurat。
[0182]
3.7.亚群和亚细胞功能的识别
[0183]
使用先前识别的成纤维细胞表型(icaf、mycaf以及il1驱动和tgfb驱动的caf)的seurat addmodulescore通过计算基因特征评分来确定成纤维细胞簇身份。dominguez,c.x等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019)。
[0184]
使用以下基因标记物的簇平均表达来注释已建立的骨髓细胞和t细胞类型簇：1)树突状细胞：cd1c、clec10a、csf2ra、ccl19、ccr7，2)浆细胞样树突状细胞：lilra4，3)增殖细胞：mki67，4)tgd和nk细胞：trdc、ncam1，5)cd8 t细胞：cd8a、cd8b，6)cd4 t细胞：cd4、cd40lg。在分析的每种细胞类型中都观察到具有增殖基因(诸如mki67、pcna和birc5)的高表达的细胞簇，这在单细胞分析中经常出现。这些增殖细胞簇通常代表不同亚群的混合物，由于占主导地位的细胞周期基因表达程序，该混合物无法分离，并且我们从所有下游分析中去除了这些不提供信息的簇。通过手动检查簇和基因表达分布来确定平均表达注释的截止值。t细胞、骨髓细胞和成纤维细胞群的亚群基因标记物绘制在基因标记物热图上，并使用wilcoxon检验通过测试亚群相对于所有其他细胞中的显著差异表达来识别。
[0185]
3.8.批量rna测序数据处理和免疫表型预测
[0186]
kiyatec、icon7、rosia和tcga数据集的原始数据处理如前所述进行。desbois,m.等人，cancer res.,79:463(2019).简而言之，针对低表达基因过滤原始计数，其中至少
10％的样品中每百万计数(cpm)小于0.25。cpm用edger包中的cpm函数计算。基于过滤后的基因表达矩阵的原始计数，使用calcnormfactors(edger包)计算大小因子，并将其用于后续的voom-limma差异表达分析。使用我们之前构建的基于基因表达的分类器来预测每个样品的免疫表型，该分类器应用于如前所述的管家基因归一化数据。(desbois,m等人，nature communications,11:5583,doi:10.1038/s41467-020-19408-2(2020)。
[0187]
3.9.批量rna测序数据反卷积和特征评分
[0188]
为了估计cd8 gzmb和cd8 gzmk阳性细胞的比例，计算每个样品的gzmb或gzmk相对于cd8 cibersort特征评分的表达水平。newman,a.m.等人，nat.meth.,12:453-457(2015)。具体来说，log和voom转换数据用于使用multigsea包中的scoresinglesamples计算cibersort_lm22_t_cells_cd8基因集的z评分。gzmb和gzmk被排除在基因集之外。然后，从log和voom转换的gzmb或gzmk表达中减去cd8 特征评分。
[0189]
3.10.存活分析
[0190]
使用存活包对icon7化学疗法组中cd8 gzmk和gzmb t细胞与无进展存活的关联进行分析。
[0191]
3.11.结果
[0192]
为了剖析每种免疫表型的肿瘤微环境的组成，我们分别研究了每种细胞类型(即t细胞和骨髓细胞)并定义了细胞亚群和细胞功能。对所有t细胞的批量校正umap表示进行的簇分析揭示了cd8 与cd4 t细胞的分离(图8a、8b和6a)。此外，我们还识别了两个表达tγδ受体基因trdc和nk细胞标记物ncam1的簇。由于nk细胞和tγδ(tgd)细胞在转录上相似，因此我们无法区分这两种细胞类型。在cd4 t细胞中，我们根据其基因表达标记物区分了三种不同的功能和表型状态，即调节性cd4 t细胞(foxp3、ctla4、il2ra)、激活的cd4 t细胞(cxcl13、cd200、icos)和静息cd4 t细胞(il7r、gpr183、lmna、anxa1)(图8a和8c)。与浸润型肿瘤相比，静息cd4 il7r t细胞在排斥型肿瘤中显著富集(p值＝0.01)，而浸润型肿瘤往往具有更多的激活的和调节性cd4 t细胞(p值＝0.1和0.3，图9a和9b)。我们识别了以下四种cd8 t细胞状态，并且基于其特征标记物并使用van der leun和同事报告的cd8 t细胞命名法对它们进行注释：i)cd8 fgfbp2，ii)cd8 il7r，iii)cd8 gzmb和iv)cd8 gzmk(图8a和8c)。van der leun,a.m.等人，nat.rev.cancer,20:218-232(2020)。cd8 fgfbp2细胞先前已被报道为细胞毒性效应cd8 t细胞。li,t.等人，cell,176(4):775-789.e18(2019)。有趣的是，tgd/nk细胞的一个独特簇与cd8 fgfbp2群共享以下标记物：fgfbp2、prf1、gzmb、klrg1和glny(图8a和8c)。cd8 fgfbp2和tgd/nk fgfbp2群在沙漠型肿瘤中显著富集，并且在浸润型肿瘤中几乎不存在(在排斥型肿瘤中，p＝0.003和0.07，在浸润型肿瘤中，p＝1.2e-09和3.5e-05，图9a和9c)，然而，绝对细胞数相对小(数据未显示)。cd8 il7r细胞表达il7r和gpr183(图8c)，其转录谱类似于先前在nsclc和crc中观察到的中央记忆cd8 t细胞(guo,x.等人，nature medicine,24:978-985(2018)；zhang,l.等人，nature,564:268-272(2018))，并且基于van der leun,a.m.等人，nat rev cancer,20,218-232(2020)提出的命名法在幼稚样细胞下重新分组。
[0193]
接下来，我们关注两个最大的cd8 t细胞簇：cd8 gzmb和cd8 gzmk t细胞(图8c和8d)，并进一步详细表征它们的潜在功能状态和空间分布。尽管gzmb和gzmk t细胞群先前已在scrnaseq研究中报告，但以前对它们的功能知之甚少。guo,x.等人，nature medicine,
24:978-985(2018)；wu,t.d.等人，nature publishing group,579:274-278(2020)；yost,k.e.等人，nature medicine,25:1251-1259,doi:10.1038/s41591-019-0522-3(2019)；zhang,l.等人，nature,564:268-272(2018)；zhang,q.等人cell,179:829-845.e20(2019)。我们的数据揭示出两个群都表达了提示激活表型的标记物(icos、cd69)，并且都通过其他颗粒酶(gzma、gmzh)、干扰素γ(ifng)、穿孔素(prf1)、颗粒溶素(gnly)和ccl4的表达证明了效应子功能(图9d)。然而，它们在激活状态和耗竭样状态方面差异显著。cd8 gzmb群表现出深度激活和耗竭样表型，如ctla4、tox、lag3和pdcd1的表达所提示的(图8e)。此外，cd8 gzmb群以entpd1(cd39)和cxcl13的表达为标志(图8f)。cd39和cxcl13先前已分别被识别为肿瘤反应性cd8 t细胞和晚期功能障碍t细胞的潜在标记物。simoni,y.等人，nature,557:575-579(2018)；van der leun,a.m.等人，nat.rev.cancer,20:218-232(2020)。
[0194]
有趣的是，与排斥型肿瘤相比，在浸润型肿瘤中cd8 gzmb t细胞的激活/耗竭状态显著更高，其中激活和耗竭标记物(诸如layn、cd69和tnfrsf9)的表达更高(图8e)。将先前开发的功能障碍评分(li h.等人，cell,176,775-789e718(2019))和核心t细胞耗竭特征(yost,k.e.等人，nature medicine,25,1251-1259(2019))应用于我们的数据集也证实了cd8 gzmb t细胞显示出最高程度的功能障碍和耗竭(图17)。为了在蛋白质水平上验证浸润型肿瘤与排斥型肿瘤中cd8 gzmb t细胞的激活状态，我们对来自独立验证集合的17个卵巢癌组织(9个浸润型，8个排斥型)进行针对细胞角蛋白(panck)、cd3、pd-1和gzmb的多重免疫荧光。在所有gzmb t细胞(cd3/gzmb双阳性)中，在肿瘤上皮中与排斥型肿瘤相比，在浸润型肿瘤中pd-1阳性的gzmb t细胞比例显著更高(p值＝0.077)(图9e)，这支持了肿瘤区域中的gzmb t细胞(具体是浸润型肿瘤中的gzmb t细胞)的激活状态较高。
[0195]
相比之下，cd8 gzmk细胞先前被描述为潜在的效应记忆t细胞或前功能障碍t细胞。guo,x.等人，nature medicine,24:978-985(2018)；li,h.等人，cell,176:77-789(2019)；doi:10.1016/j.cell.2018.11.043；wu,t.d.等人，nature publishing group,579:274-278(2020)；zhang,l.等人，nature,564:268-272(2018)；zheng,c.等人，cell,169:1342-1356.e16(2017)。我们在cd8 gzmk细胞群中发现了类似的标记物表达谱，包括eomes、klrg1和cmc1(图8f)，如这些研究中所报告的。总之，这些观察结果提示cd8 gzmb细胞的更高级功能障碍状态可能与其肿瘤反应潜力有关，而cd8 gzmk t细胞代表前功能障碍效应记忆细胞。
[0196]
考虑到cd8 gzmb和cd8 gzmk t细胞的不同功能障碍状态，我们探讨了这些t细胞子集在基质与肿瘤上皮中的空间分布是否导致其功能状态的差异。我们对来自验证集合的相同的17个卵巢癌样品进行rnascope测定，以进行gzmk/cd8a和gzmb/cd8a的原位共杂交，以及通过h&e染色在基质与肿瘤区域内进行定位。cd8a/gzmk和cd8a/gzmb双阳性t细胞在排斥型肿瘤的瘤周基质中和浸润型肿瘤的肿瘤上皮中积累(图8g)。根据这一观察结果，我们得出结论：cd8a/gzmk和cd8a/gzmb t细胞至少在浸润型肿瘤中都具有浸润肿瘤上皮的能力，并且因此与肿瘤上皮的接近程度不能解释gzmb 和gzmk 群的功能障碍状态的差异。
[0197]
接下来，基于我们的scrnaseq分析，我们询问功能障碍的cd8 gzmb和前功能障碍的cd8 gzmk t细胞在排斥型肿瘤中是否显示出与浸润型肿瘤不同的发生率：与所有排斥型肿瘤相比，5个浸润型肿瘤中有3个显示出较低的cd8 gzmk比例，而cd8 gzmb亚群则相反(图8h和9a)。我们假设cd8 gzmk前功能障碍亚群与排斥型肿瘤有关，并且cd8 gzmb功能障碍亚
群与浸润型肿瘤有关。为了验证这一假设，我们使用了rnascope测定和批量rnaseq反卷积方法。我们的rnascope测定结果显示，与浸润型样品相比，排斥型样品中cd8a/gzmk双阳性细胞的比例显著更高(p＝0.03)，但cd8a/gzmb双阳性细胞的比例没有显著差异(图9f)。
[0198]
除了原位验证之外，我们还通过研究来自以下三个卵巢癌队列的批量rnaseq数据，在更大规模的研究中验证了我们的scrnaseq研究结果：tcga(n＝412)(cancer genome atlas research,2011)，icon7临床试验集合(n＝351)和rosia临床试验队列(n＝308)。bell,d.等人，nature publishing group,474:609-615(2011)；oza,a.m.等人，int.j.gynecol.cancer,27:50-58(2017)；perren,t.j.等人，n.engl.j.med.,365:2484-2496(2011)。我们首先用我们之前建立的分类器预测这些样品的肿瘤免疫表型。desbois,m.等人，cancer res.,79:463(2019).使用cibersort cd8特征对批量rnaseq数据进行去卷积证实在所有三个队列中cd8
t细胞含量在排斥型和浸润型肿瘤中均较高，这与在我们研究中使用的15个卵巢癌样品中观察到的情况类似(图9g)。为了验证cd8 gzmk与gzmb t细胞群的免疫表型特异性富集，我们使用每个样品的gzmk或gzmb表达与cd8 t细胞特征评分的比率替代每个群在cd8 t细胞中所占比例。与我们的模型一致，在所有三个临床队列中，与浸润型肿瘤相比，排斥型肿瘤显示出显著更高的gzmk/cd8 替代比率(图8i)。同样，浸润型肿瘤中的gzmb/cd8 比率高于排斥型肿瘤，尽管这种差异的统计学显著性仅在较大的tcga数据集中才能实现。此外，组合在预测浸润表型与排除表型的逻辑回归模型中的gzmb/cd8 和gzmk/cd8 比率显著增加了所有三个队列中任一单一比率模型的解释方差(图8i)，强调了cd8 gzmk和gzmb细胞群的比例均与表型相关联，并且因此支持了这些肿瘤免疫表型在其cd8 t细胞功能状态中显示出重要的定性和定量差异。
[0199]
在我们之前的研究中，我们观察到，与浸润表型或沙漠表型相比，当卵巢癌患者的肿瘤表现出排除表型时，处于化学疗法的卵巢癌患者的减少的存活。desbois,m.等人，cancer res.,79:463(2019).由于cd8 gzmb和gzmk细胞与浸润型和排斥型肿瘤的差异关联，我们询问cd8 t细胞状态是否也与化学疗法治疗下的临床结果相关。在来自icon7临床试验化学疗法治疗组的103名患者的队列中，我们观察到cd8 t细胞数量与较长的无进展存活(pfs)弱相关联(p＝0.093，图8j)，这与之前的研究结果一致，表明在卵巢癌中cd8 t细胞浸润的良好预后作用。hwang,w.t.等人，gynecol.oncol.,124:192-198(2012)；lo,c.s.等人，clinical cancer research,23:925-934(2017)；zhang,l.等人，n.engl.j.med.,348:203-213(2003)。有趣的是，虽然gzmb/cd8 比率与该队列中的临床结果无关，但gzmk/cd8 比率与较短的pfs显著相关联，特别是在多变量模型中与总体cd8 t细胞评分相结合时(p＝0.029，图8j和9h)。因此，gzmk阳性cd8 t细胞的相对比例与减少的存活相关联，并且该比率提供比总体cd8 t细胞含量更多的有关患者结果的信息。
[0200]
总之，激活的cd4 和cd8 gzmb t细胞在浸润型肿瘤中富集，而静息cd4 和cd8 gzmk t细胞在排斥型肿瘤中富集，并且两种cd8 t细胞类型都可以在肿瘤上皮中找到。cd8 t细胞群的表征揭示了耗竭更多的cd8 gzmb t细胞的细胞毒性效应功能表型，而效应记忆t细胞的标记物则表征了cd8 gzmk t细胞。最后，较高比例的cd8 gzmk t细胞与卵巢癌化学疗法结果较差相关联。
[0201]
实例4.成纤维细胞表型与t细胞的定位相关
[0202]
4.1.结果
[0203]
最近的研究揭示了几种肿瘤类型中癌症相关成纤维细胞(caf)的不同子集。avery,d.等人，matrix biol.,67:90-106(2018)；costa,a.等人，cancer cell,33:463-479.e10(2018)；dominguez,c.x.等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；ohlund,d.等人，j.exp.med.,214:579-596(2017)。然而，对它们与肿瘤免疫表型的关联知之甚少。我们确定了三个主要的成纤维细胞簇(图10a)。三个成纤维细胞簇中的两个显示出pancaf特征的高表达(源自elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019))，表明存在caf(图10b和11a)。此前，caf已被描述为炎性caf(icaf)和肌成纤维细胞(mycaf)或被描述为il1激活的caf(il1caf)和tgfb激活的caf(tgfb caf)。dominguez,c.x.等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019)。在具有最强pancaf信号的两个簇中，一个簇展示出高icaf和il1_caf特征表达，而另一簇显示出高mycaf和tgfb_caf表达(图10b和11a)。因此，我们将这些簇分别注释为il1 caf和tgfb caf。
[0204]
为了进一步深入了解这些不同caf群的功能，我们探究了区分tgfb caf和il1 caf的基因表达谱。tgfb caf群的前20个标记物包括先前与tgfβ诱导的反应性基质相关联的基因：骨膜素(postn)、平滑肌肌动蛋白(acta2)、软骨寡聚基质蛋白(comp)以及胶原亚基(col10a1、col11a1)、基质金属蛋白酶(mmp11)、转胶蛋白(tagln)和纤连蛋白(fn1)(图10c)。ryner,l.等人，clinical cancer research,51:2941-2951(2015)。另一方面，表征il1 caf群的标志物包括细胞因子/趋化因子信号传导特征，诸如cxcl14、ccl2和细胞因子信号转导抑制因子3(socs3)。dominguez,c.x.等人，cancer discovery,10:232-253(2020)；elyada,e.等人，cancer discovery,9:1102-1123(2019)；higashino,n.等人，lab.invest.,99:777-7992(2019)。我们之前识别了卵巢癌中tgfβ介导的反应性基质与t细胞排除免疫表型之间的关联。desbois,m.等人，cancer res.,79:463(2019).因此，我们分析了不同的成纤维细胞亚群是否可能与不同的肿瘤免疫表型相关：il1 caf显示出在浸润型肿瘤中富集的趋势(p＝0.11)，然而，tgfb caf与排斥型肿瘤的关联并不显著(图10d和11b)。尽管这些tgfb caf表达反应性基质基因，从而形成致密基质，其可能有助于排除肿瘤细胞，并且在5个排斥型肿瘤中的4个中并且在5个浸润型肿瘤中的仅2个中代表≥40％的成纤维细胞，但仍有必要进行额外的研究，包括这些细胞在tme中的分布，以进一步剖析它们与排斥型肿瘤的关联。
[0205]
第三个成纤维细胞簇显示出明显但减少的pancaf特征表达(图11a)。我们将此簇注释为成纤维细胞样群(图11b)。值得注意的是，这些成纤维细胞样细胞几乎只在一个沙漠型(des3)和一个排斥型肿瘤(exc4)中发现(图11b)。该簇的重要标记物包括已与上皮细胞相关联的基因(slpi、krt19、krt8、krt18、wfdc2)。shih,a.j.等人，plos one,13:e0206785(2018)。因此，该簇可能代表已经经历emt的肿瘤细胞。需要进行额外的研究以更好地了解这些细胞的性质。
[0206]
实例5.与不同的肿瘤免疫表型相关的表型和功能多样的骨髓细胞子集
[0207]
5.1.结果
[0208]
对骨髓区室的分析(图7a)识别了代表由cd1c和clec10a表达标记的树突状细胞(dc)的簇、代表表达lilra4的浆细胞样树突状细胞(pdc)的簇以及由cd14表达标记的四个巨噬细胞/单核细胞簇(图12a和13a)。dc群的亚簇分析识别了根据特征基因标记的五个簇，
包括：i)spp1 dc，ii)apoe dc，iii)ccr7 dc，iv)cd1c dc和v)xcr1 dc(图18)。这些簇中的三个可以自信地分配给先前描述的dc子集，其中xcr1dc代表cdc1群(xcr1、clec9a、cadm1)，cdc1 dc代表cdc2群(fcer1a、cd1c、clec10a)，并且ccr7 dc代表成熟dc(ccr7、lamp3)(zhang等人，2019)。基于mafb、fcgr3a、cd14、fcgr1a和cd163的表达，我们假设apoe dc簇代表炎性单核细胞衍生的dc群(collin和bigley，2018)，而spp1 dc与villani等人描述的cd1c-cd141-dc子集(serpina1和fcgr3a)(villani等人，2017)具有相似性(图19)。不幸的是，dc的数量太少，使得无法研究这些dc子集与肿瘤免疫表型的关联。有必要进行进一步的工作来验证这些细胞的功能及其在tme中的分布。
[0209]
我们根据之前已用于描述相似细胞群的基因标记物进一步表征了四个巨噬细胞/单核细胞簇：fcn1、marco、siglec1(cd169)和cx3cr1(图12a和12b)。aran,d.等人，nat.immunol.,20:163-172(2019)；azizi,e.等人，cell,174:1293-1308-e36(2018)；cassetta,l.等人，cancer cell,35:588-602.e10(2019)；lavin,y.等人，cell,169:750-765.e17(2017)；zilionis,r.等人，immunity,1-29,doi:10.1016/j.immuni.2019.03.009(2019)。fcn1簇的特征是先前与单核细胞相关联的vcan和s100a转录物的高表达(图12b和13b)。villani,a.-c.,等人，science,356(6335):eaah4573,doi:10.1126/science.aah4573(2017)；zilionis,r.等人，immunity,1-29,doi:10.1016/j.immuni.2019.03.009(2019)。此外，该簇表现出cibersort单核细胞特征的最高表达(图13c)。由于cd169和cx3cr1群高表达补体因子基因、成熟标记物(cd83、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-drb5)和m2 cibersort特征，因此我们将这些群表征为肿瘤相关巨噬细胞(tam)样巨噬细胞(图12b、13b和13c)。最后，marco簇的特征是与fcn1簇相比vcan表达较低，并且与tam样巨噬细胞相比m2特征和成熟标记物表达较低。因此，我们将这些细胞注释为与之前描述的群类似的marco巨噬细胞。zilionis,r.等人，immunity,1-29,doi:10.1016/j.immuni.2019.03.009(2019)。为了探究已识别细胞状态的分化轨迹，我们进行了伪时间扩散映射分析。沿扩散映射坐标2的轨迹遵循从marco未成熟巨噬细胞到cd169和cx3cr1成熟巨噬细胞的连续体，这提示成熟轨迹，而扩散映射坐标1反映了从fcn1单核细胞到成熟cd169/cx3cr1巨噬细胞的分化轨迹(图12c)。为了进一步研究骨髓细胞状态，我们衍生并应用了最近描述的肝细胞癌中tam样和mdsc样细胞的特征。zhang,q.等人，cell 179:829
–
845(2019)。事实上，tam样巨噬细胞特征在cd169和cx3cr1巨噬细胞中表达，并且mdsc样特征在fcn1单核细胞和marco巨噬细胞中高表达(图12d)。在骨髓细胞上表达的触发受体(trem)家族的两个成员(trem1和trem2)的差异表达先前已被认为与tam样和mdsc样状态相关联。zhang,q.等人，cell179:829
–
845(2019)。与此一致，我们发现trem2几乎只在tam样cd169/cx3cr1巨噬细胞中表达，并且trem1在mdsc样fcn1单核细胞/marco巨噬细胞中表达(图12e)。
[0210]
最后，我们评估了这些不同的骨髓细胞群是否与特定的肿瘤免疫表型相关联。mdsc样骨髓子集(fcn1单核细胞和marco巨噬细胞)在沙漠型肿瘤中显著富集，而tam样骨髓子集(cd169和cx3cr1巨噬细胞)在排斥型和浸润型肿瘤中富集(p＝0.02，图12f和13c)。值得注意的是，对于任一群而言，在排斥型肿瘤和浸润型肿瘤之间没有观察到差异。
[0211]
实例6.肿瘤免疫表型由跨区室相互作用形成
[0212]
6.1.伪批量差异表达
[0213]
我们使用伪批量方法进行差异基因表达(dge)分析。对于每个样品，将源自该样品的感兴趣的细胞群的细胞中每个基因的原始umi计数相加，从而得到样品水平的umi计数。细胞少于五个的样品以及样品中读取次数少于50次的基因被排除在分析之外。然后，我们使用calcnormfactors(edger)计算每个伪批量样品的大小因子，并使用voom-limma对这些样品水平的伪批量表达谱进行差异基因表达分析。对于肿瘤区室中的g2/m校正伪批量表达分析，我们如前所述使用cellcyclescoring函数和g2/m细胞周期基因计算每个细胞的g2/m评分(seurat,science.sciencemag.org/content/352/6282/189)。每个细胞的评分按照患者取平均值，并作为协变量添加到voom-limma设计矩阵中。
[0214]
6.2.基因集富集分析
[0215]
使用fgsea软件包对差异基因表达分析的结果进行基因集富集分析，并使用msigdbr软件包对来自分子特征数据库集合的标志性基因集进行基因集富集分析。korotkevich,g.等人，biorxiv 060012；doi:10.1101/060012(2019)；subramaniam,a.等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.,102:15545-15550(2005)。具体来说，差异表达基因列表根据组合的对数倍数变化和调整后的p值进行排序，并用作基因集富集分析的输入值。
[0216]
6.3趋化因子受体-配体相互作用分析
[0217]
使用来自cellphonedb(efremova等人，2020)(cellphonedb.org/)的组合信息和来自r&d systems网站(rndsystems.com/resources/technical-information/chemokine-nomenclature)的资源，构建已知趋化因子受体和配体对的数据库。使用以下标准针对可能的趋化因子-受体相互作用过滤该数据库：1)每个受体-配体对应在细胞群中至少10％的细胞中表达，2)每对应在相同的免疫表型内表达。这产生6种可能的趋化因子受体-配体相互作用，针对该相互作用，在每个单独患者中评估表达受体/配体的细胞的表达水平和数量。
[0218]
6.4结果
[0219]
我们对肿瘤微环境的单细胞表征也允许我们探究细胞区室之间潜在的相互作用，这可能有助于形成肿瘤免疫连续体。尽管单细胞数据不能提供细胞间信号传导的明确证据，但不同团队已经表明，如何考虑单细胞数据中的细胞特异性受体和配体表达模式可以用于卓有成效地生成假设。camp,j.g.等人，nature,546:533-538(2017)；costa,a.等人，cancer cell,33:463-479.e10(2018)；skelly,d.a.等人，cell reports,22:600-610(2018)；vento-tormo,r.等人，nature,563:347-353(2018)。按照此类方法，我们关注了23个已知的趋化因子配体-受体对，并确定了哪些细胞类型表达趋化因子配体或受体；对于相关细胞类型，我们进一步注意表达受体或配体的细胞的表达水平和比例。我们排除了针对以下情况的任何假定的相互作用对，其中1)受体被细胞类型或亚群中不到1％的细胞表达，和2)对于大多数患者而言，受体和配体表达不同时出现在同一患者中。这种过滤产生了六种假定的趋化因子配体-受体相互作用，我们在数据集中进一步研究了该相互作用。有趣的是，我们发现了可能涉及t细胞募集和迁移中区室(肿瘤、免疫和基质)中的每一个的证据。
[0220]
表1.基于沙漠型与浸润型/排斥型肿瘤细胞中差异表达基因的标志性基因集富集结果
[0221]
[0222]
[0223][0224]
6.4.1肿瘤细胞-免疫细胞串扰
[0225]
趋化因子cxcl16是一种已知用于募集t细胞的趋化因子，由肿瘤细胞以及免疫细胞(主要是骨髓细胞)表达(图14a和15a)。matsumara,s.和demaria,s.radiat.res.,173:418-425(2010)。此外，我们观察到，与沙漠型肿瘤相比，浸润型和排斥型肿瘤的肿瘤细胞区室中的cxcl16表达显著较高(p值分别＝0.012和0.022，图14b)。另一方面，发现cxcl16受体cxcr6在cd4 和cd8 t细胞中特异性表达，并且特别在cd8 gzmb t细胞和cd4 foxp3 tregs中高表达(图14a)。wilbanks,a.等人，j.immunol.,166:5145-5154(2001)。这种共表达模式可以在我们有其足够细胞的所有单独患者中得到证实，并且在浸润型肿瘤的肿瘤细胞中特别明显(图15b)。结合cd8 gzmb t细胞和cd4 foxp3 tregs在浸润型肿瘤中富集的我们的观察结果，这一发现提示可将cxcr6 t细胞募集到浸润型肿瘤中的肿瘤上皮的潜在机制。
[0226]
6.4.2免疫细胞-免疫细胞串扰
[0227]
与肿瘤细胞和t细胞之间潜在的cxcl16/cxcr6串扰类似，我们识别了t细胞和骨髓细胞之间的可能的串扰。cxcr3受体由cd8 和cd4 t细胞表达，并且其主要配体cxcl9、
cxcl10和cxcl11主要由树突状细胞和cd169巨噬细胞表达(图14c和15c)。此外，浸润型肿瘤中b-til表达cxcr5，cd4 cxcl13和cd8 gzmb t细胞表达相应趋化因子配体cxcl13表明了将b-til募集到浸润型肿瘤的潜在机制(kazanietz,m.g.等人，front endocrinol(lausanne)10,471(2019))(图15d-e)。
[0228]
6.4.3基质细胞-免疫细胞串扰
[0229]
基质细胞也可能参与免疫细胞的募集。趋化因子cxcl14和cxcl12由il1 caf群表达(图14d)，并且已知它们与受体cxcr4结合。collins,p.j.等人，faseb j.,31:3084-3097(2017)；tanegashima,k.等人，febs letters,587:1731-1735(2013)；vega,b等人，journal of leukocyte biology,90:399-408(2011)。值得注意的是，发现这种受体几乎仅由免疫细胞表达，并且由cd8 t细胞进行的表达最为强烈(图14d和15f)，这提示了il1caf在浸润型肿瘤中的cd8 t细胞募集中的作用，因为这些肿瘤显示出il1 caf的弱富集，而t细胞在沙漠型肿瘤中是罕见的。
[0230]
内皮细胞和周细胞是唯一明显表达cx3cr1:cx3cl1的主要配体和最近描述的配体ccl26的细胞类型(图14e)。el-shazly,a.e.等人，clin.exp.allergy,43:322-331(2013)。由于cx3cr1标记了浸润型和排斥型肿瘤中主要的成熟巨噬细胞群之一(图14f)，我们假设cx3cr1巨噬细胞通过内皮细胞和周细胞的募集对于这两种免疫表型具有特异性(图15g)。
[0231]
除了骨髓细胞之外，b-til还显示出趋化因子受体-配体可能与基质细胞区室发生串扰的证据。内皮细胞表达ccl21(使得能够募集ccr7 细胞的配体)，其在排斥型肿瘤的内皮细胞中具有显著较高的表达(p＝0.03)，并且在浸润型肿瘤中具有一致但不显著的较高表达(p＝0.06，图15h和15i)。comerford,i.等人，cytokine growth factor rev.24:269-283(2013)。在我们的数据集中，大多数表达ccr7的细胞是b-til，这提示可能经由内皮细胞进行募集，特别是在排斥型和浸润型肿瘤中。
[0232]
7.结论
[0233]
为了总结这些观察结果，我们假设一个模型，其中肿瘤、免疫和基质区室内部和之间的不同组成和潜在串扰可能形成不同的肿瘤免疫表型(图14g)。在我们的模型中，tme中存在免疫的肿瘤(包括浸润型肿瘤和排斥型肿瘤二者)具有许多与沙漠型肿瘤不同的共同特征。例如，浸润型和排斥型肿瘤都显示出t细胞和tam样巨噬细胞的富集，而沙漠型肿瘤则显示出几乎完全不存在t细胞，但存在mdsc样细胞的富集。t细胞在浸润型和排斥型肿瘤中的存在可能部分通过经由cxcr3-cxcl9/10/11信号传导的t细胞-tam样巨噬细胞串扰来促进。此外，表达cx3cr1配体的内皮细胞和周细胞也可能参与浸润型和排斥型肿瘤中cx3cr1 tam样巨噬细胞的募集。另一方面，浸润型肿瘤和排斥型肿瘤之间也存在重要差异。浸润型肿瘤中较大程度的t细胞浸润可能受到两个因素的影响：1)浸润型肿瘤细胞表现出最高的cxcl16表达，这可能促进cxcr6 t细胞向肿瘤上皮的募集；和2)浸润型肿瘤富集il1 caf，其cxcl12/14的表达可能进一步促进经由cxcr4进行的t细胞募集。
[0234]
8.讨论
[0235]
虽然癌症免疫疗法在某些适应症中有效，但即使在这些适应症中，它也不是对每个人都有效，并且响应的变异性尚未完全了解。sharma,p.等人，cell,168:707-723(2017)。更好地了解肿瘤及其微环境的组成应该反过来改善癌症免疫疗法并将其益处扩大到更多患者，并实现个性化的治疗方法。hegde,p.s.和chen,d.s.,immunity,52:17-35(2020)。在
这项研究中，我们报告了在构成卵巢癌肿瘤免疫连续体的三种肿瘤免疫表型的背景下，对整个肿瘤生态系统进行的全面的scrnaseq剖析。我们的研究不仅提供了对肿瘤、免疫和基质区室中每一个中的细胞多样性的高分辨率描述，而且还强调了区室内部和之间的串扰如何可以有助于形成肿瘤免疫表型的生物学，并最终可能影响免疫治疗的响应。
[0236]
我们首先研究了肿瘤细胞本身的内在特性是否有助于有利于或阻碍免疫浸润的环境。galon,j.和bruni,d.,nat rev drug discov,18:197-218(2019)。事实上，肿瘤细胞区室的scrnaseq揭示了沙漠型和浸润型/排斥型肿瘤之间转录谱的显著差异，诸如浸润型/排斥型肿瘤中干扰素响应/抗原呈递途径的富集代表高cd8 t细胞浸润。我们之前已经在批量rna测序和原位mhc-i ihc研究中观察到在沙漠型和排斥型肿瘤中的抗原呈递下调。desbois,m等人，nature communications,11:5583,doi:10.1038/s41467-020-19408-2(2020)。尽管我们在本研究中排斥型肿瘤中没有观察到抗原呈递在基因水平上的强烈下调，但我们不能排除mhc可能在蛋白质水平上下调。表征浸润型/排斥型肿瘤的另一个特征是氧化磷酸化途径的上调。之前已报告了肿瘤细胞的代谢可以通过例如竞争t细胞功能所必需的代谢物或积累产生不利的微环境并损害t细胞迁移的废物如乳酸来直接损害t细胞的浸润和功能。haas,r.等人，plos biol,13:e1002202,(2015)；sugiura,a.和rathmell,j.c.,j immunol,200:400-407(2018)。通过使用氧化磷酸化代替有氧酵解，肿瘤细胞消耗丙酮酸并积累较少的乳酸(sugiura,a.和rathmell,j.c.,j immunol,200:400-407(2018))，并且这可能会生成更有利的用于有效免疫细胞浸润的环境。
[0237]
肿瘤免疫连续体主要通过肿瘤床中t细胞的数量和位置来表征。hegde,p.s.等人，clinical cancer research,22:1865-1874(2016)。我们对免疫区室的单细胞探究提供了多得多的细节，并且揭示了不同的表型和功能性t细胞和骨髓细胞状态，以及它们在肿瘤免疫表型中的差异富集。虽然我们识别的cd8 gzmb和cd8 gzmk t细胞亚群之前已在单细胞研究中进行过描述(guo,x.等人，nature medicine,24:978
–
985(2018)；li,h.等人，cell,176:77-789,doi:10.1016/j.cell.2018.11.043(2019)；wu,t.d.等人，nature,579:274
–
278(2020)；yost,k.e.等人，nature medicine,25:1251-1259(2019)；zhang,l.等人，nature,54:321
–
33(2018)；zhang,q.等人，cell 179:829
–
845(2019))，但是我们的主要研究结果之一是它们不仅代表不同的功能状态，而且还在不同的肿瘤免疫表型中差异富集。我们对这些cd8 t细胞亚群与肿瘤免疫表型关联的分析提供了两个见解：1)功能障碍/耗竭cd8 gzmb t细胞在排斥型肿瘤中激活/耗竭较少；和2)与浸润型肿瘤相比，前功能障碍/效应记忆cd8 gzmk t细胞在排斥型肿瘤中富集。这两种观察结果都可以通过功能障碍/激活状态与t细胞空间分布(即，t细胞从肿瘤上皮浸润或排除)之间的潜在联系来解释。排斥型肿瘤中的免疫细胞排除可能导致肿瘤细胞缺乏持续的抗原刺激，并且因此导致cd8 gzmb t细胞激活/耗竭较少以及前功能障碍的cd8 gzmk t细胞富集。与该模型一致，我们发现静息cd4 t细胞群在排斥型肿瘤中富集，以及激活的cd4 t细胞和调节性t细胞在浸润型肿瘤中富集。总而言之，这些观察结果表明，与排斥型肿瘤相比，浸润型肿瘤中抗原刺激免疫情况更多，正如人们所期望的那样。然而，我们的空间分析还表明前功能障碍的cd8 gzmk t细胞群具有浸润肿瘤上皮的能力。因此，空间定位(即从肿瘤上皮中排除cd8 gzmk t细胞)不能完全解释它们的功能状态。
[0238]
许多团队正在研究的一个重要问题是免疫检查点阻断(icb)(特别是抗pd-(l)1抗
der voort,r.等人，arthritis rheum,52:1381-1391(2005))，但更重要的是，我们的分析揭示出cxcl16也在肿瘤细胞上表达，尤其是在浸润型和排斥型卵巢肿瘤细胞中表达。已知cxcl16通过趋化因子受体cxcr6发出信号(wilbanks等人，2001)，并且我们发现cxcr6在cd4 foxp3 treg细胞和功能障碍的cd8 gzmb t细胞上的表达最高。这些观察结果提示，浸润型和排斥型肿瘤中的肿瘤细胞可能募集这些t细胞子集。支持这些研究结果的是，之前已经表明，电离辐射可以诱导cxcl16的分泌，cxcl16会以其他方式将cxcr6 cd8 激活的t细胞募集到免疫原性差的乳腺癌小鼠模型中的肿瘤中。matsumura,s.等人，j immunol.181:3099-3107(2008)。因此，cxcl16-cxcr6轴可能代表有助于卵巢癌中肿瘤免疫连续体的一个重要因素。然而，cxcl16趋化梯度的作用在排斥型和浸润型肿瘤之间可能不同，因此尽管存在趋化因子梯度，但t细胞无法到达排斥型肿瘤中的肿瘤上皮。事实上，我们发现排斥型肿瘤中大比例的肌成纤维细胞不仅表达肌成纤维细胞特异性标记物acta2(αsma)(sahai,e.等人，nat rev cancer,20:174-186(2020))，而且还表达胶原基因(fcol10a1、col11a1、col6a3、col1a1)和之前证明有助于反应性基质的基因(postn、mmp11、fn1)(planche,a.等人，plos one,6:e18640(2011)；ryner,l等人，clin cancer res,21:2941-2951(2015))。这些观察结果进一步支持了以下假设：特异性caf会产生物理屏障，该物理屏障通过产生致密的细胞外基质来阻止t细胞进入肿瘤上皮。salmon,h.等人，j clin invest,122:899-910(2012)；zeltz,c.等人，semin cancer biol,62:166-181(2020)。
[0242]
我们的研究有几个值得注意的局限性。通过基于活细胞的来源区室(即免疫区室、基质区室或肿瘤区室)对活细胞进行分选，我们能够富集低丰度细胞群，并实现每个区室的高分辨率解剖。然而，此类方法不允许描述整个微环境的组成，并且只能报告已识别的细胞状态相对于其各自单独区室的比例。此外，已报告卵巢肿瘤及其免疫微环境是异质的。jimenez-sanchez,a.等人，cell,170:927-938e920(2017)；roberts,c.m.等人，cancers(basel):11(2019)。尽管我们的研究已经利用了来自同一原发肿瘤的不同肿瘤切片，并采用正交方法(基于转录组分类器的预测和cd8 ihc分类)来为每个肿瘤分配肿瘤免疫表型，但此类分类仍然有可能不代表整个肿瘤。包括对同一肿瘤的多个部分以及同一患者不同部位的转移性肿瘤进行表征在内的未来研究可能会为卵巢癌的异质性肿瘤微环境提供更多见解。最后，我们跨不同区室的趋化因子受体-配体分析仅源自转录组分析，并且有必要在未来的研究中通过高维多重原位分析和功能测定来进一步验证这些潜在的相互作用。
[0243]
总之，我们的研究提供了对tme中的不同细胞和功能表型及其动态相互作用的深入剖析，使得能够更丰富地表征肿瘤免疫连续体。我们的工作还提供了对生物学的更多见解，这可能有助于形成tme和免疫表型。最后，我们的研究结果还可能使得能够识别治疗靶标并且影响克服免疫抑制并增加或扩大对癌症免疫疗法的响应的新治疗策略。
[0244]
尽管为了清楚理解的目的先前已通过举例说明和实施方案相当详细地描述了本发明，但是这些描述和实施方案不应解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容均全文以引用方式明确地并入。