专利名称：：鉴定患卵巢癌的可能性增加的患者的方法及其组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及鉴定患卵巢癌的可能性增加的女性的方法和组合物。
背景技术：
：卵巢癌代表了在整体基础上影响女性的一组不同种类的疾病。存在几种形式的卵巢癌，包括卵巢上皮癌，种系癌和卵巢间质癌。上皮卵巢癌代表了该病最常见的形式。约5-10%的上皮卵巢癌代表了该病的遗传类型，并且识别了三种常见模式单独的卵巢癌；与分别在染色体17q21和13ql2上brac1和brca2遗传连锁相关的卵巢和乳腺癌；和卵巢和结肠癌。卵巢癌的最重要的危险因素在于与该病的一级亲缘关系(例如患有卵巢癌的母亲，姊妹或女儿)。例如，参见patridge等(1999)ca-acancerjournalforclinicians49:297-320。在2005年，据估计有22，000个卵巢癌诊断新病例且16，000人死于卵巢癌。一般参见americancancersocietywebsiteatwww.cancel,org;在www.cancer,gov.上的nationalcancerinstitutewebsite。卵巢癌为主要影响具有平均年龄在63岁时诊断的绝经后女性。然而，该病可以影响所有年龄组的女性。nationalcancerinstitutesurveillance,epidemiology和在www.seer,cancer,gov.上的endresults(seer)program。卵巢癌阶段的分类基于定位与该病从卵巢扩散的程度。阶段1的卵巢癌限于卵巢一侧或两侧。阶段2的疾病包括卵巢一侧或两侧中的肿瘤与骨盆扩散。在阶段3的卵巢癌中，肿瘤存在于卵巢一侧或两侧，用显微镜证实从腹膜转移到骨盆外部和/或局部淋巴结转移。阶段4的卵巢癌的特征在于远端转移超过了腹腔。一般在该病的晚期阶段诊断卵巢癌，这是因缺乏可以表示存在小肿瘤的特异性临床症状所致。6就年龄为50岁以下的女性而言，在治疗位于一侧或两侧卵巢且疾病预后最佳时检测到40%以下的卵巢癌。就在50岁以下的女性而言，该病的数量下降至15%以下。在全部年龄组中受卵巢癌侵害的约68%的女性未得到诊断，直到存在远端转移。一般参见nationalcancerinstitutesurveillance,epidemiology和www.seer.cancer.gov.上的endresults(seer)program。卵巢癌通过从卵巢上皮局部脱落入腹腔扩散，随后种植在腹膜上并且局部侵入肠和膀胱。涉及卵巢癌的淋巴结的存在诊断的卵巢癌的所有阶段中均是明显的。阳性淋巴结的百分比随疾病的进展显著增加(即阶段l，24%;阶段2，50%;阶段3，74%;阶段4，73%),文献同上。具有卵巢癌的患者存活率为诊断该病时的阶段的函数，其中5-年存活随晚期疾病而下降。超过90。/。的诊断为阶段l中的卵巢癌的女性在诊断后存活至少5年。5-年存活率在该病直到阶段4(即远端转移)也未未得到诊断时低于30%,文献同上。上皮卵巢癌为最常见形式的疾病。存在上皮卵巢癌的4种可识别的主要组织学类型，并且包括血清，子宫内膜样，透明细胞和粘蛋白亚型。卵巢癌的发病机制难以理解，但认为由卵巢表面上皮产生。参见bell(2005)mod.pathol.18(suppl2):s19-32。在卵巢癌危险方面提供最大程度降低的生活因素包括经产，使用口服避孕药和人乳喂养，所有这些均可以防止排卵。因为排卵导致上皮损害，随后是修复和可能的炎症反应，所以该过程在整个女性育龄过程中不间断地反复导致细胞损害并且增加卵巢癌的危险。例如，参见ness等(1999)j.natl.cancerinst.91:1459-1467。然而，未认识到卵巢癌通过确定的前体损害逐步进展，诸如对宫颈癌和结肠癌认识到的那些。因此，大量的研究定向于理解卵巢癌的分子基础和理解卵巢癌的不同组织学亚型之间的基本差异。这些研究利用了基因表达分析来提供这一理解并且已经鉴定了一系列用于评价诊断应用的可能的生物标记。例如，参见0no等(2000)cancerres.60:5007-11;welsh等(2001)proc.natlacad.sci.usa98:1176-1181;donninger等(2004)oncogene23:8065-8077;和lee等(2004)int.j.oncol24(4):847-851。卵巢癌通常因明显的临床症状出现而被检测到，最显著的是出现腹痛，附件肺块，腹部气胀和尿急。照此，通常在晚期阶段上检测到卵巢癌，其中预后和临床效果差。在早期阶段(即阶段l)检测到卵巢癌导致使用标准手术和化疗的治愈率约为90%;因此，在临床上存在在治疗最为有效的早期阶段检测到卵巢癌的需求。令人遗憾的是，目前检测早期阶段卵巢癌的篩选方法不足。用于卵巢癌筛选的最新实践使用应用ca125和经阴道超声(超声检查)。ca125血清水平升高与卵巢癌相关且随后联用经阴道超声有助于检测存在的卵巢癌。卵巢疾病的证实基于侵害性操作，诸如剖腹术(laprotomy)。然而，ca125的应用对一般群体篩选不足，这是因灵敏性有限，特异性有限和<3%的极差阳性预测值所致。bast(2003)jclinoncol.21(10s叩pl):200-205。作为结果，对在无症状患者群体中对卵巢癌进行一般性篩选的建议没有一致性。参见nationalcancerinstitutewebsiteatwww.cancer.gov.。就高危患者而言，用于卵巢癌检观'j的一般可接受的操作包括使用骨盆检查，使用ca125血清测试和经阴道超声(超声检查)。patridge等(1999)ca-acancerjournal或ciinicians49:297-320。cau5为一般在上皮细胞表面上表达的充分表征的肺瘤标记，并且通常在3su/ml下在正常患者血清中检测到。通常在约85%的卵巢癌患者中检测到升高的ca125血清水平(〉35u/ml);剩余的15%的卵巢癌患者具有正常的cau5血清水平。此外，ca125仅在50°/。的阶段1卵巢癌患者中升高，由此限制了其在早期卵巢癌检测中的卵巢应用。然而，cau5升高的血清水平用于监测治疗千预后的疾病复发，并且它代表了fda目前批准的ca125的应用。此外，ca125升高的血清水平预示了未来可检测到的卵巢癌。一般群体中的卵巢癌低发生率对研发可以促进该病早期检测的筛选试验产生了明显的挑战。用于具有低发生率的疾病，诸如卵巢癌的篩选方法通常产生假阳性与真阳性的高比率，这限制了这类筛选程序的临床应用。由于与可能的卵巢癌手术探查相关的高风险，临床有用的筛选试验应指不超过10位女性中实施手术的实际具有卵巢癌的女性为l位(即至少10。/。的阳性预测值(ppv))。skates等(2004)j.clin.oncol.22:4059-4066。ppv高度依赖于特定疾病或疾患的发生率并且显著地转移为疾病发生率差别的结果。因此，由于是低发生率疾病，诸如卵巢癌，所以具有相对低ppv的筛选诊断试验仍然具有显著的临床应用。可能的卵巢癌篩选程序必须为低发生率卵巢癌进行调整并且评价生物标记性能和临床要求。例如，参见skates等(2004)j.clin.oncol.22:4059-4066;bast等(2005)int.j.gynecol.cancer15:274-281;和rosen等(2005)gyn.oncol.99:267-277。尽管做出了鉴定用于卵巢癌检测，特别是早期检测的生物标记或生物标记组的努力，目前不存在满足临床要求的充分的篩选或诊断试验。目前可利用的方法，诸如ca125的检测表现出不可接受的高假阳性比例。来自nationalcancerinstitute的最新建议认为"建立使用血清标记，诸如ca125,经阴道超声或骨盆检查筛选卵巢癌导致死于卵巢癌的比例下降的证据不足"(ncisummaryofevidence(level4，5);截止到2005年2月为止)。鉴于使用目前可利用筛选技术的严重风险，所以nci不支持卵巢癌一般筛选操作的公共机构。照此，尽管早期诊断明显改善了5-年存活率，但是不存在用于卵巢癌的标准化筛选试验。因此，本领域中对能够特异性鉴定具有卵巢癌的女性的可靠方法和组合物存在明显需求。特别地，需要鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法。可以将鉴定为具有卵巢癌可能性增加的女性选择用于更具有侵害性的诊断方法以便最终确定她们目前是否存在该病。此外，这类筛选方法可以基于常规在一般女性患者群体中进行以便有利于在该病的早期阶段检测卵巢癌，此时预后和疾病结果最佳。发明概述提供了鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法。本发明的方法一般包括检测患者身体样品中在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记。所述生物标记的超表达预示该中具有卵巢癌的可能性增加。本发明的方法可以包括，例如"两步"分析，其中进行第一测定步骤以便检测第一种生物标记或生物标记组的表达。如第一种生物标记或生物标记组得到超表达，那么进行第二测定步骤以便检测第二种生物标记或生物标记组的表达。第一种和第二种生物标记或生物标记组的超表达预示患者具有卵巢癌的可能性增加。可以设计第一测定步骤以便通过排除为"真阴性"的较大病例的女性来富集的研究的患者群体。第二测定步骤一般指定用于通过从富集的群体中排除额外的真阴性患者而排除在富集的群体中未表现出具有卵巢癌的那些患者。这些测定步骤可以作为包括两测定步骤的单一试验或作为两种不同试验进行，其中每一试验包括所述测定测定步骤之一。单一生物标记或生物标记组可以用于每一分析步骤以便实现灵敏性，特异性，阴性预测值(npv)和阳性预测值(ppv)的所需值。可以研发算法以便在不同的测定步骤中合并特定的生物标记而实现所需的灵敏性，特异性，npv和ppv。在本发明的其它方面中，鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法包括进行"单步"或"一步"测定，其中评价患者身体样品中在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记。这些生物标记的超表达预示患者具有卵巢癌的可能性增加。与上述两步筛选方法相反，单步筛选测定法无需进行第一测定步骤来检测特定生物标记的超表达，随后进行第二测定步骤评价第二种生物标记是否也得到超表达，以便鉴定患者具有卵巢癌的可能性增加。可以对通过本发明筛选方法鉴定未具有卵巢癌可能性增加的患者进行进一步诊断试验以便最终确定该患者是否患有卵巢癌。一般基于增加，但确定目前并"具(该病的患者:此外:本发明的方法;以用于基于常规筛选女性卵巢癌患者群体。因此，本发明的篩选方法可以允许在该病的早期阶段诊断卵巢癌，此时预后明显较好。还提供了用于实施本发明方法的试剂盒。可以在蛋白质或核酸水平上评价生物标记表达。在某些实施方案中，使用生物标记特异性抗体在蛋白质水平上检测生物标记表达。还可以通过基于核酸的技术检测本发明的生物标记，包括，例如杂交和rt-pcr。可以评价各种身体样品中的生物标记表达，包括，但不限于血液(例如全血，具有除去血小板的血清等)，淋巴液，腹水，尿，妇科流体(例如卵巢，输卵管和子宫分泌物，月经等)，活检组织和在腹腔镜检查过程中获得的流体。本发明还包括诊断患者卵巢癌的方法。这些诊断方法一般包括检测身体样品中在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记的表达。多个生物标记的超表达预示存在卵巢癌。还提供了用于实施本发明诊断方法的试剂盒。本文还披露了用于评价卵巢癌特定疗法功效的方法。本发明进一步涉及监测患者卵巢癌退化或进展的方法。附图简述图l提供了用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的典型"两步"筛选试验的图示。本实施例中筛选的8百万个女性患者代表了如下文中所定义的高危的无症状美国患者群体。在第一测定步骤中，从进一步的测试中排除大量真阴性，由此保留在第二测定步骤中进一步分析的富集的群体。第二测定步骤进一步排除属于真阴性的额外患者以便鉴定具有最高卵巢癌风险的某些女性。在本文中提供了有关两步筛选方法的额外详细描述。图2提供了使用来自55岁以上患者样品(a)和所有患者样品的he4的受者作用特征(r0c)图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图3提供了使用来自55岁以上患者样品(a)和所有患者样品的抑制素a(i冊)的roc图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图4提供了获自所有患者样品的促乳素的roc图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图5提供了获自所有患者样品的plau-r的roc图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图6提供了使用来自55岁以上患者样品(a)和所有患者样品的妊娠相关蛋白(gly)的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图7提供了使用所有患者样品获得的slpi的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图8提供了使用所有患者样品获得的cthrc1的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图9提供了使用所有患者样品获得的pai-1的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图io提供了使用所有患者样品获得的klk-10的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图ll提供了使用来自55岁以上患者样品(a)和所有患者样品的ca125的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图12提供了使用所有患者样品获得的klk-6的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图13提供了使用所有患者样品获得的muc-1(mu)的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。图14提供了使用所有患者样品获得的匪p-7(薩)的r0c图。实施例2中提供了额外的实验详细描述。发明详述本发明提供了用于鉴定具有卵巢癌的患者的筛选方法和组合物。这些筛选方法一般包括检测来自患者的身体样品，特别是血液样品，更具体地说是血清样品中多个生物标记的表达。用于实施本发明的生物标记的超表达预示存在卵巢癌的可能性。在本发明特定的筛选方法中，两步分析用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者。进行第一测定步骤以便检测患者身体样品中第一种生物标记或生物标记组的表达。如果确定了第一种生物标记或生物标记组在样品中得到超表达，那么进行第二测定步骤以便检测第二种生物标记或生物标记组的表达。第一种和第二种生物标记或生物标记组的超表达预示该患者具有卵巢癌的可能性增加。在某些实施方案中，抗体用于检测生物标记蛋白表达。在本发明的其它方面中，当检测到生物标记组表达时，仅分析的亚组生物标记的超表达足以预示该患者具有卵巢癌的可能性增加。尽管本发明并不限于特定机制，但是一般设计第一测定步骤以便通过从进一步测试中排除大量真阴性而富集真阳性患者群体(即基于百分比)。第一测定步骤可以使用较高的灵敏性和阴性预测值(npv),以便实现所需的真阳性患者群体的富集。一般指定第二测定步骤用于排除富集群体中目前不具有卵巢癌的那些患者，即从富集的群体中排除额外的真阴性。第二测定步骤可以使用较高的特异性和阳性预测值(ppv),同时维持合理的灵敏性，以便从富集的真阳性患者群体中排除真阴性。图1中提供了两步篩选试验和可以使用该方法获得的结果的图示。本领域技术人员公认可以将这些测定步骤作为包括两测定步骤的单一筛选试验或作为两种不同的试验进行，其中每种试验包括所迷测定步骤之一。单一生物标记或生物标记组可以用于每一测定步骤以便获得所需的灵敏性，特异性，npv和ppv的值。可以研发算法以便选择特定的生物标记或生物标记组合，从而对每一测定步骤和包括两测定步骤的合并筛选试验实现所需的灵敏性，特异性，npv和ppv。除上文所述的两步分析外，用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的篩选方法还包括进行"单步"或"一步"筛选方法或测定法，其中评价患者身体样品中在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记的表达。至少一种生物标记的超表达预示该患者具有卵巢癌的可能性增加。在本发明特定的方面中，单步或一步筛选方法包括检测身体样品中多个生物标记的表达，包括，例如he4，ca125,妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素a，plau-r，促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶，其中所述生物标记中至少一种，特别是两种，更具体地说是三种的超表达预示具有卵巢癌的可能性增加。在本发明单步筛选方法的具体实施方案中，评价妊娠相关蛋白，he4和ca125的表达并且所述生物标记中至少一种，两种或三种的超表达预示具有卵巢癌的可能性增加。例如，参见表54和实验例4。本领域技术人员可以理解与上文所述的两步筛选方法相反，单步篩选方法无需进行第一测定步骤来检测特定生物标记或生物标记组的超表达，随后是第二测定步骤以便评价第二种生物标记或生物标记组是否也得到超表达，以便鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者。照此，在本文所述的单步筛选方法中不需要用于富集"真阳性"患者群体的第一测定步骤和从富集群体中排除那些实际上不具有卵巢癌的患者("假阳性")的第二测定步骤。足以构成"超表达"的特定生物标记的表达水平可以根据所有特异性生物标记的不同而改变。在本发明具体的实施方案中，对特定的生物标记建立表达的"阈水平"，其中高于该值的表达水平被视为超表达。用于建立表达的阈水平的各种统计学和数学方法为本领域公知的。例如，可以基于来自如实施例2和3中所述受者作用特征(roc)图的数据或来自正常患者样品的编辑数据(即正常患者群体)选择用于特定生物标记的阈水平。例如，可以基于来自未受到卵巢癌侵害的正常患者的样品分析建立平均表达水平加上2倍标准偏差的阈表达水平。本领域技术人员可以理解，例如，可以通过沿特定生物标记的r0c图运动改变这些阈表达水平以获得灵敏性，特异性，阳性预测值(ppv)和阴性预测值(npv)的不同值，由此影响总体测定性能。可以对按照披露方法鉴定未具有卵巢癌可能性增加的患者进行进一步诊断测试以便最终确定该患者是否患有卵巢癌。"进一步诊断测试，，包括，但不限于骨盆检查，经阴道超声，ct扫描，mri，剖腹术，腹腔镜检查和活組织检查。这类诊断方法为本领域众所周知的。此外，可以基于发生卵巢癌的规则密切监测分类为基于卵巢癌可能性增加的患者，但通过进一步的诊断测试确定她们目前不具有卵巢癌。对这类患者的监测可以包括，但不限于骨盆检查，经阴道超声，ct扫描和mri。本领域普通临床医师可以理解用于监测发生卵巢癌的适当技术。通过鉴定和监测具有卵巢癌可能性增加的患者，本发明的篩选方法可以允许在该病的早期阶段，特别是阶段1或阶段2检测到卵巢癌，此时预后和疾病后果得到显著改善。在具体的实施方案中，抗体用于检测蛋白质水平的生物标记表达。在本发明的其它方面中，检测核酸水平的生物标记表达。进一步提供了用于实施本发明篩选方法，包括两步筛选方法的试剂盒。所谓"卵巢癌"指的是那些通过剖腹术探查后分类为恶变前病理学情况，恶性病理学情况和癌症的情况(figo阶段1-4)。上文详细描述了卵巢癌的阶段和分类。"早期-阶段卵巢癌"是指那些分类为阶段1或阶段2癌的疾病状态。卵巢癌的早期检测显著增加了5-年存活率。术语"筛选方法"是指鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的策略，使得可以选择这类患者进行更具有侵害性的诊断方法以便最终确定该患者是否患有卵巢癌。本发明的"筛选方法"或"诊断筛选方法"一般并非指定最终诊断为患有或不患有卵巢癌。而是指定这类方法鉴定具有卵巢癌可能性增加的女性，使得可以使用其它方法最终诊断这些女性(例如骨盆检查，经阴道超声，ct扫描，mri，剖腹术，腹腔镜检查和组织样品的活组织检查)。还可以制订方案以便通过本发明方法监测鉴定为具有卵巢癌可能性增加，但确定目前不具有该病的患者。本发明的筛选方法可以基于逐一病例进行或作为用于一般女性群体的定期常规筛选试验。在某些实施方案中，可以观察到用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法与用于鉴定具有宫颈癌可能性增加的患者的巴氏涂片相差无几。本文所用的"鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者"为用于监测女性更可能具有卵巢癌的女性的预测方法。"具有卵巢癌的可能性增加"用以指按照本发明方法确定表现出特定生物标记超表达的患者比不用次方法的患者更可能具有卵巢癌。"诊断卵巢癌，，指定包括，例如诊断或检测存在的卵巢癌，监测该病的进展和鉴定或监测预示卵巢癌的细胞或样品。术语诊断，监测和鉴定卵巢癌在本文中可以互换使用。卵巢癌的最终诊断一般包括对来自患者的组织样品进行活组织检查。本发明的方法在与本领域中目前公知的提出的筛选方法比较时能够对具有卵巢癌的可能性进行优先评价(例如测定ca125水平)。本文所用的"特异性，，是指本发明方法可以精确鉴定通过探查性剖腹术证实为非恶性(即真阴性)的样品的水平。即特异性为属于试验阴性的疾病阴性比例。在临床研究中，通过用真阴性的数量除以真阴性和假阳性的总和计算特异性。所谓"灵敏性"是指本发明方法可以精确鉴定剖腹术-证实为卵巢癌阳性(即真阳性)的样品的水平。因此，灵敏性为属于试验阳性的疾病阳性比例。在临床研究中通过用真阳性的数量除以真阳性和假阴性的总和计算灵敏性。用于监测卵巢癌的披露方法的灵敏性至少约为70%,特别是至少约为80%,更具体地说至少约为90，91，92，93，94，95，96，97，98，99%或99%以上。此外，本发明方法的特异性至少约为70%，特别是至少约为80%,最具体地说至少约为90，91,92，93，94，95，96，97，98，99%或99%以上。术语"阳性预测值"或"ppv"是指在本发明方法中具有阳性试验结果的实际上具有卵巢癌的患者百分比。在临床研究中，通过用真阳性的数量除以真阳性和假阳性的总和计算ppv。ppv高度依赖于特定疾病或疾患的发生率并且作为疾病发生率的结果显著变化。因此，由于为低发生率疾病，诸如卵巢癌，所以具有相对低ppv的筛选试验具有显著的卵巢实用性。相反，具有高发生率的疾病可能需要较高的ppv在临床上有用。例如，参见skates等(2004)j.clin.oncol.22:4059-4066;bast等(2005)int.j.gynecol.cancer15:274-281;rosen等(2005)gyn.oncol.99:267-277;和pepe(2004)thestatisticalevaluationofmedicaltestsforclassification和prediction(oxforduniversitypress),将所有这些文献完整地引入本文作为参考。用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的本发明方法的ppv—般至少约为7，8，9，10，15，20，25，30%或30%以上。在某些实施方案中，本发明方法的ppv至少约为10°/。。用于诊断筛选方法的至少约为10%的ppv在本领域中被视为具有临床实用性。参见skates等，文献同上。试验的"阴性预测值"或"npv"为具有阴性试验结果的实际上不具有卵巢癌的患者百分比。在临床研究中，通过用真阴性的数量除以真阴性和假阴性的总和计算npv。用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的本发明方法的npv—般至少约为80%，特别是至少约为90%，更具体地说是至少约为91，92，93，94，95，96，97，98，99，99.1，99.2，99.3，99.4，99.5，99.6，99.7，99.8，99.9%或99.9°/。以上。在某些实施方案中，用于本发明方法的npv至少约为99%。本领域技术人员可以理解用于本发明方法的ppv和npv值基于发生率调节的群体并且反映出在美国女性群体中卵巢癌的发生率。"生物标记，，为任何基因或蛋白质，其在组织或细胞中的表达水平比它们在正常或健康细胞或组织中改变。本发明的生物标记对卵巢癌具有选择性。所谓"在卵巢癌中选择性超表达"是指所关注的生物标记在卵巢癌中超表达，但在分类为非恶性的，良性和其它不视为临床疾病的情况中并不超表达。因此，检测本发明的生物标记能够将预示具有卵巢癌可能性增加或存在卵巢癌的样品与正常样品(即来自无卵巢癌的患者的样品)和预示为非恶性和良性增殖的样品区分开来。在本文中涉及的本发明的生物标记中"卵巢癌生物标记"，"标记"或"卵巢癌标记"可以互换使用。本发明的生物标记包括基因和蛋白质。这类生物标记包括dm,其包含编码该生物标记的核酸序列的全部或部分序列或这类序列的补体。生物标记核酸还包括rna，其包含所关注的核酸序列中的任何种的全部或部分序列。生物标记蛋白质为由本发明的dna生物标记编码或相对于本发明的dm生物标记的蛋白质。生物标记蛋白质包含生物标记蛋白质或多肽类中任何种的全部或部分氨基酸序列。生物标记基因和蛋白质的片段和变体也包括在本发明中。所谓"片段"是指部分多核苷酸或部分氨基酸序列和由此编码的蛋白质。为生物标记核苷酸序列片段的多核苷酸一般包含至少10，15，20，50，75，100，150，200，250，300,350，400，450，500,550，600,650，700,800，900，1,000，1,100，1,200，1，300或1，400个连续的核苷酸或达以本文披露的全长生物标记多核苷酸存在的核苷酸数量。生物标记多核苷酸片段一般编码至少15，25，30，50，100，150，200或250个连续的氨基酸或达以本发明全长生物标记蛋白质存在的氨基酸总数。"变体"指定是指基本上相似的序列。一般而言，本发明特定生物标记的变体与通过序列对比程序测定的该生物标记具有至少约40%,45%,50%,55%，60%,65%，70%，75%，80%,85%，90%，91°/。，92%,93%,94%,95°/。，96%,97%，98%,99%或9m以上的序列同一性。本发明的生物标记如上文定义包括在卵巢癌中选择性超表达的任何基因或蛋白质并且可以包括公知的生物标记以及本领域目前公知的那些。在具体的实施方案中，生物标记为分泌的蛋白质或预测编码具有跨膜片段和胞外域的膜蛋白。所关注的生物标记包括he4，ca1"，妊娠相关蛋白，固p-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素，plau-r，促乳素，klk-10,klk-6和slpi，a-l抗胰蛋白酶(aat)，imp-2，flj10546，flj23499，mgc13057，sp0n1，s100a1，slc39a4，tacstd2，mbg2，hetkl27(mal2)，cox-l，蛋白激酶c-iota，钙依粘连蛋白-6，adprt，matriptase,叶酸受体，密蛋白4，mesothelin，7jc通道蛋白5，人肌动蛋白素1，钓结合微丝蛋白，丛生蛋白，a四连接素，玻连蛋白，妊娠相关血浆蛋白a(papp-a)和folistatin。特别关注的生物标记包括，但不限于he4,ca125,妊娠相关蛋白,mmp-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素，plau-r，促乳素，klk-10,klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶(aat)。更具体关注的生物标记包括he4,妊娠相关蛋白，mmp-7,slpi，plau-r，muc-l，抑制素a和pai-1。he4为首先在人附睾組织中观察到的蛋白质并且名称"he4"为"人附睾蛋白4"的缩写，随后的研究已经证实he4蛋白也存在于女性生殖道和其它上皮组织中。已经发现居于人染色体20ql2-13.1和20ql2染色体部位上的he4基因在卵巢癌中频繁扩增。研究证实服4由卵巢癌细胞表达。该蛋白质被n-糖基化并且在胞外分泌。例如参见drapin等(2005)cancerresearch65(6):2162-9;hellstr她等(2003)cancer-research63:3695-3700;和bingle等(2002)oncogene21:2768-2773。ca-125为在具有卵巢上皮癌(oec)的大比例患者中检测到的高分子量细胞表面糖蛋白。然而，尽管在该病的晚期阶段中的百分比高(75-90%),但是在具有阶段1疾病的患者中仅有50%升高。ca-125作为oec标记的应用存在疑问，因为该分子也在大量正常和病理情况中表达，包括月经，妊娠，子宫内膜异位症，炎性疾病和其它类型的癌症。在绝经后女性中报导了改善的oec灵敏性和特异性。例如，参见bast等(1998)int"j.biologicalmarkers13:170-187;和moss等(2005)j.clin.pathol.58:308-312。妊娠相关蛋白为主要在生殖轴中的细胞识别和分化中具有几种不同作用的脂质运载蛋白超家族中的成员。在先将这种糖蛋白称作孕酮相关性子宫内膜蛋白(paep)和胎盘蛋白14(pp-14)。该名称的改变部分是因妊娠相关蛋白不由子宫内膜或胎盘合成引起。在sds凝胶中将妊娠相关蛋白从羊水中纯化为28kda分子并且报导为由正常卵巢和恶性卵巢肿瘤合成。在血清中报导了其存在。一般参见seppala等u002)endocrinereviews23:401-430;pala等(1997)j.chromatographyb704:25-34;meeritkamarainen等(1996)amer.j.pathology148:1435-1443。基质金属蛋白酶(mmp)家族中的蛋白质涉及正常生理过程，诸如胚胎发育，生殖和组织重塑以及疾病过程，诸如关节炎和转移灶中的胞外基质分解。大部分醒p's作为无活性的前蛋白分泌，它们在被胞外蛋白酶裂解时活化。由匪p-7(基质溶解因子)基因编码的酶降解蛋白聚糖类，纤连蛋白，弹性蛋白和酪蛋白且不同于大部分薩p家族成员的方面在于它缺乏保守c-末端蛋白结构域。该酶涉及伤口愈合并且在小鼠中的研究提示它调节肠粘膜中防御素类的活性。mmp-7基因为位于染色体llq22.3上的一组mmp基因的组成部分。mmp-7在正常和患病组织的上皮细胞中表达。已知它在乳腺，结肠和前列腺等肿瘤中表达。它在卵巢癌细胞中丰富，但在正常卵巢上皮组织中无法通过ihc检测到。muc-l(粘蛋白1，ema，pem，抗粘着因子)为由大部分腺和导管上皮细胞和某些造血细胞镨系表达的大细胞表面粘蛋白糖蛋白。在功能上，认为muc-1涉及细胞保护和润滑并且在细胞粘着和/或细胞信号传导中起作用。muc-l基因包含7种外显子并且产生几种不同的可替代选择的剪接变体。muc-1的主要表达形式使用所有7种外显子并且为具有大的胞外串连重复结构域的1型跨膜蛋白。这种串连重复结构域为高度o-糖基化的并且已经证实在上皮癌细胞中糖基化改变。已经发现muc-l在许多类型的癌症中升高，最值得注意的是晚期乳腺癌。由于仅作为基于血清的标记，所以它几乎没有特异性，但可以与其它更具有特异性的标记一起用作预后辅助。pai-1(即1型纤溶酶原激活物抑制剂)为丝氨酸或半胱氨酸蛋白酶抑制剂。pai-1mrna为2876bp长度且编码的蛋白质为402个氨基酸长。计算的分子量为42,769da，而将亲和力纯化的蛋白质报导为约50，000da,正如通过sds凝胶电泳测定的。pai-1在plau抑制胞外基质降解中起作用并且为推定的未调节c-myc靶基因。pai-1还在控制凝固和组织重塑中起关键作用。pai-1限制了纤溶酶产生并且用于保持检查中的纤维蛋白溶解。涉及pai-1抑制纤溶酶的某些生理功能包括排卵，细胞迁移和上皮细胞分化。癌症中的高pai-1水平表示洗涤人癌，包括乳腺和肺癌存活的预后差。pappot等(nov.29，2005)lungcancer[epubaheadofprint];chazaud等(2002)americanjournalofpathology160:237-246。在筛选气囊-损伤与正常动脉的差别表达序列中鉴定了含1的胶原蛋白三链螺旋重复(cthrc1)。在pyagay等的研究中，在正常动脉中不可检测到cthrc1表达。然而，在损伤时，它由重塑的外膜成纤维细胞和新内膜平滑肌细胞短暂表达。还在钙化人粥样硬化斑块中发现它。cthrc1为分泌的28-kda蛋白，它被糖基化并且从脊索动物到哺乳动物均为高度保守的。具有12gly-x-y重复的短胶原蛋白基元表现为导致蛋白质三聚化并且这使得该分子对胶原酶裂解敏感。cthrclmrna表达水平增加作为对转化生长因子-a和骨形态发生蛋白-4的反应。使用超表达cthrc1的成纤维细胞和平滑肌细胞进行的细胞迁移测定证实增加的cthrc1水平与增强的迁移能力相关。此外，cthrc1超表达导致i型胶原蛋白mrna和蛋白质水平显著降低。pyagay等的数据表明新分子cthrc1在动脉壁中短暂表达作为对损伤的反应，其中它通过限制胶原蛋白基质沉积和促进细胞迁移促成血管重构。pyagay等(2005)circ.res.96(2):261-8。抑制素为属于转化生长因子a超家族的蛋白质激素并且为由通过二硫键连接的a和s亚单位组成的异二聚体。2种形式的抑制素(即a和b)在与a亚单位连接的§亚单位类型(即§a或ab)上不同。在生殖年龄的女性中，已知抑制素由卵巢颗粒细胞分泌并且在血液中循环。抑制素通过月经周期和妊娠过程中在浓度上改变并且影响垂体fsh产生，配子发生和妊娠结果。在绝经女性中，抑制素降至极低水平。近期的出版物表明抑制素为卵巢癌的i貪断标记。例如，参见robertson等(2002)mol.cellendocrinol.191:97-103;el-shalakany等(2004)j.obstet.gynaecol.res.30:155-161。纤溶酶原激活物尿激酶受体(plau-r或upar)为具有约60kda分子量的细胞表面糖蛋白，它通过起羧基末端与gpi谱系的细胞膜连接。plau-r用作涉及正常和病理过程中基底膜/胞外机制重建的丝氨酸蛋白酶尿激酶纤溶酶原激活物(upa)的特异性受体。据报导从细胞表面释放的可溶性plau-r在几种类型的人癌，包括结肠直肠，乳腺和卵巢癌血清中的浓度升高。例如，参见sier等(1998)cancerres.58:1843-1849;和begum等(2004)anticancerresearch24:1981-1986。促乳素为由前叶垂体大量分泌的198个氨基酸的23kda蛋白质激素。与雌激素一致，促乳素在乳腺生长和泌乳开始中起重要作用。此外，认为促乳素在细胞生长和免疫功能中具有显著作用。使用商购elisa试剂盒的近期报导报告了血清中的促乳素水平在卵巢癌中显著升高。一般参见mor等(2005)proc.natlacad.sci.102:7677-7682。激肽释放酶类为具有不同生理功能的丝氨酸蛋白酶亚族。它们簇集染色体为19ql3上的族群体。生长证据提示许多激肽释放酶涉及癌发生且某些具有作为新癌和其它疾病生物标记的潜能。klk-6为位于染色体19上的簇的15种激肽释放酶亚族成员，编码的酶由类固醇激素调节。在组织培养物中，发现该酶产生来自淀粉样蛋白前体蛋白的淀粉样蛋白形成状态片段，从而提示了涉及阿尔茨海默病的可能性。已经将klk-6验证为分泌蛋白并且发现它在卵巢癌患者中升高。因此，将其推定为具有作为该病血清学标记的价值。人激肽释放酶10基因(klkio，也称作正常上皮细胞特异性1基因(nes-1))为激肽释放酶基因家族中的成员。该基因产物为分泌的丝氨酸蛋白酶，已知其在各种生物流体中的浓度在某些疾病状态中改变。特别地，klk10在卵巢上皮细胞中表达并且据报导这种表达在具有卵巢癌的患者血清中升高。因此，klk10可以用作卵巢癌的血清生物标记。例如，参见liu-ying等(2003)cancerres.63:807-811;yousef和diamandis(2003)thrombhaemost.90:7-16。分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)为首先在人腮腺分泌物中分离的蛋白质。随后的研究证实slpi蛋白也存在于唾液和大量粘膜表面，诸如肺，鼻通道，宫颈和精嚢的那些中。认为slpi作为对慢性肺病的防御物起作用，因为它是嗜中性粒细胞弹性酶的有效抑制剂，其存在在慢性炎性肺病中提高并且可以破坏肺组织中的许多成分。slpi还抑制组胺从肥大细胞中释放，由此它还在过敏反应中具有活性。还认为胎膜和宫颈组织的保护是slpi的功能。已经发现编码slpi蛋白的基因在卵巢癌中得到增量调节并且已经发现在基因恶性卵巢癌的患者血清中的slpi升高水平与在具有良性卵巢囊肿的患者或正常患者中发现的水平之间具有显著性差异。slpi蛋白具有12kda的质量，为非糖基化的，疏水性的和阳离子型。一般参见hollander等(2003)cancercellinternational3:14;helmig等(1995)eur.j.obstet.gynecol.reprod,biol.59(1):95-101;hough等(2001)cancerresearch61:3869-3876;和tsukishiro等(2005)gynecologiconcology96:516-519。a-l抗胰蛋白酶(aat)为由肝合成的急性期蛋白和蛋白水解酶类，诸如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，纤溶酶和凝血酶的主要血清抑制剂。在炎症反应中，aat的血清浓度升高至3-4倍。该分子作为具有40-50kda单体分子量的遗传变体成员存在。据报导平均血清浓度(mg/ml)为2.21±0.35和2.14±0.37。aat作为卵巢癌生物标记受到关注是因自身2d凝胶电泳/质镨研究所致，该研究显示aat在卵巢癌患者血清中升高。例如，参见song等(1994)j.affect.disorders30:283-288;ledue等(1993)clin.chim.acta.223:73-28。尽管详细讨论了上述生物标记，但是其表达对卵巢癌具有选择性的任何生物标记均可以用于实施本发明，包括本领域中已知的生物标记和尚未得到鉴定的那些。这类生物标记包括例如涉及dna复制/细胞周期控制中的缺陷，细胞生长和增殖，脱离细胞凋亡或淋巴生成或癌细胞运动型和侵害机制的基因和蛋白质。特别关注在早期-阶段卵巢癌中选择性超表达的生物标记。所谓"在早期阶段的卵巢癌中选择性超表达"是指所关注的生物标记在阶段1或阶段2卵巢癌状态中超表达，但在正常样品或分类为非恶性，良性和其它不视为临床疾病的情况中不会超表达。本领域技术人员可以理解早期-阶段卵巢癌生物标记包括对卵巢癌具有特异性的那些基因和蛋白质，它们最初在阶段1或阶段2中超表达，并且其超表达在该病的整个晚期阶段持续；和仅在阶段1或阶段2卵巢癌中超表达的生物标记。在早期-阶段卵巢癌中选择性超表达的生物标记表达的检测能够允许进行卵巢癌的早期检测和诊断且由此改善了患者预后。本发明的方法包括检测多个生物标记的表达。本文所用的"多个"生物标记是指2，3，4，5，6，7,8，9，10或10个以上生物标记。特别地，当本发明的两步筛选方法用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者时，多个生物标记可以指在第一测定步骤中检测至少一种生物标记并且在笫二测定步骤中检测至少一种额外的生物标记。本领域技术性增加的患者。生物标记组可以包括所关注的生物标记的任何数量或组合。在某些实施方案中，包括多个生物标记的组选自he4，ca125，妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素，plau-r，促乳素，klk-io，klk-6和slpi，a-1抗胰蛋白酶(aat)。在其它实施方案中，提供了选自生物标记亚组的生物标记组，其包括ca125，he4，妊娠相关蛋白，謝p-7，slpi，plau-r，muc-l，抑制素a和pai-1。可以使用本发明的筛选和诊断方法评价任何女性患者或患者群体。例如，本文披露的方法可以对一般女性患者群体和较窄范围的绝经后女性群体进行。术语"绝经后"为本领域技术人员所理解。在具体的实施方案中，绝经后一般指，例如年龄超过55岁的女性。在具体的实施方案中，定期对一般女性群体实施'歸选方法(例如每年，每两年等)。例如，对患者的定期筛选可以在年龄为30岁的月经开始时开始或在绝经开始时开始。都如下文定义的高危患者群体的筛选一般基于常规进行，与患者的年龄无关。可以使用本发明的筛选和诊断方法评价无症状和有症状(即展示出卵巢癌特征症状，诸如骨盆或腹部疼痛或膨胀)的患者具有卵巢癌的可能性增加。还可以使用本发明的方法评价处于低危发生卵巢癌的女性和基于临床和家族史危险因素被视为高危的那些女性。基于这类临床和家族史危险因素被视为"高危"的患者包括，但不限于具有乳腺癌，结肠癌或乳腺/卵巢综合征的存活患者，具有与卵巢癌一级亲缘关系的女性(例如母亲，女儿或姊妹)，至少一种癌基因(brca1或2)阳性的患者和患有hnpcc(即遗传性非息肉性结肠直肠癌)的女性。在本发明的一个方面中，用于筛选和诊断方法的目标群体为基于例如上述参考的临床和家族危险因素分类为高危的无症状患者群。这种高危无症状群体在美国占8百万以上的女性。认为本发明的方法，组合物和试剂盒对发生卵巢癌的风险增强的患者和对其临床医师而言均具有特别的实用性。本领域中被识别为具有发生卵巢癌的危险增加的患者包括，例如具有卵巢癌家族史的患者和高龄患者(即一般年龄常规55岁的女性)。大量与卵巢癌无直接相关性的临床情况或特征可以在按照本发明方法测试的患者中存在，由此干扰了本文披露的筛选和诊断方法的结果。这类临床情况和特征在本文中称作"干扰物质和病理学情况"，并且包括，但不限于妊娠(前三个月)，乳腺癌，慢性肝炎，结肠癌，口服避孕药疗法，冠状动脉病,深静脉血栓形成，糖尿病，子宫内膜异位症，激素替代疗法，月经，多发性骨髄瘤，卵巢囊肿/多囊性疾病，多肌痛，多肌炎，直肠癌，类风湿性关节炎，系统性红斑狼療(sle)和华法林治疗。额外典型的干扰性病理学情况包括子宫疾患(例如肌瘤，子宫腺肌病和子宫内膜癌)，卵巢疾患(例如良性生长，诸如功能性嚢肿，鞘-黄体嚢肿，妊娠黄体瘤，硬化性嚢性卵巢，血清囊腺瘤，粘蛋白嚢腺瘤，嚢性畸胎瘤，纤维瘤，泡膜细胞瘤和勃勒纳瘤；恶性肿瘤；和恶性情况，诸如囊腺癌和腺癌)，输卵管疾患(例如输卵管卵巢脓肿，输卵管积水，卵巢冠囊肿，异位妊娠和输卵管癌)，肠疾患(例如具有气体和/或粪便的膨胀，憩室炎，回肠炎，阑尾炎和结肠癌)和其它各种情况(例如膨胀的膀胱，骨盆肾，脐尿管囊肿，腹壁血肿，腹壁脓肿和腹膜后肿瘤，诸如淋巴瘤，肉瘤和畸胎瘤。在具体的实施方案中，选择用于本文所述筛选和诊断方法的生物标记，阚表达水平和数学模型以便将干扰物质和病理学情况对请求保护的方法的性能(即特异性，灵敏性，ppv和npv)的影响降至最低限度。所谓"身体样品"是指从来自患者的细胞，组织或体液中的任何取样，其中可以检测到生物标记的表达。这类身体样品的实例包括，但不限于血液(例如全血，血清，除去血小板的血液等)，淋巴液，腹水，尿，妇科流体(例如卵巢，输卵管和尿分泌物，月经等)，活检组织和腹腔镜检查过程中获得的流体。可以通过各种技术从患者中获得身体样品，包括，例如通过静脉穿刺术，通过刮取或涂抹区域或通过使用针头抽吸体液或组织。用于收集各种身体样品的方法为本领域众所周知的。在具体的实施方案中，身体样品包括血液或血清。本发明者已经认识到用于采集和储存血样，更具体地说是血清样品的方法影响本文披露方法的性能。几种研究表明身体样品，特别是血清样品的采集和储存方法对达到可接受的测定性能而言是关键。例如，参见diamandis(2004)j.natl.cancerinstitute95:353-356和thavasu等(1992)j,immunol.meth.153:115-124，将该文献完整地引入本文作为参考。实施例1中提供了用于血清采集和储存的典型方法。本领域可利用检测生物标记表达的任何方法均可以用于实施本发明。可以在核酸水平或蛋白质水平上检测本发明生物标记的表达。为了测定超表达，可以将检验的身体样品与来源于健康人的相应身体样品比较。即表达的"正常"水平为来自未患卵巢癌的患者的身体样品中生物标记的表达水平。这类样品可以以标准化形式存在。在某些实施方案中，测定生物标记超表达无需在身体样品与相应来源于正常人的身体样品之间进行比较。本发明任何生物标记或生物标记组合以及任何公知的卵巢癌生物标记均可以用于本发明的方法，组合物和试剂盒。一般而言，优选使用来自患有卵巢癌的患者的身体样品的生物标记的表达水平与在"正常，，身体样品(即来自无卵巢癌的患者)中相同生物标记的表达水平之间的差异尽可能大的生物标记。尽管这种差异可能小至评价生物标记表达的方法的检测限，但是优选这种差异至少大于评价方法的标准误差且最佳的情况是大于正常身体样品中相同生物标记表达水平至少2，3，4，5，6，7,8,9，10，15，20，25-倍或25倍以上的差异。可以通过评价获自未患卵巢癌的患者的身体样品中生物标记的表达测定本发明生物标记的"正常"表达水平。可选择地和特别地，当额外的信息变得可利用作为本文所述方法的通常性能效果时，可以使用生物标记表达水平的平均值。如上所述，在本发明的某些方面中，可以建立高于生物标记4皮视为患者样品中超表达的特定生物标记的表达阈水平。用于选择阈值的方法包括，但不限于分析生物标记的roc图或分析正常患者群体的生物标记表达水平。典型阈值或"截止值"包括(1)平均表达水平加上2倍标准偏差，正如从正常患者样品群中测定的；和(2)选自代表灵敏性加上特异性最高值的roc曲线的表达水平。可以与正常患者群体中的表达水平相比测定特定生物标记的表达阈水平。本领域技术人员可以理解用于选择适当阈表达值的其它方法可以用于实施本发明。用于检测本发明生物标记的方法可以包括任何测定核酸或蛋白质水平的生物标记量或存在的方法。这类方法为本领域众所周知的并且包括，但不限于蛋白质印迹，dna印迹，rna印迹，blisa，免疫沉淀，免疫荧光，流式细胞计量术，免疫细胞化学，多路的基于珠的免疫测定，核酸杂交技术，核酸逆转录法和核酸扩增法。在具体的实施方案中，例如，使用定向于特异性生物标记蛋白质的抗体在蛋白质水平上检测生物标记的超表达。这些抗体可以用于各种方法，诸如蛋白质印迹，elisa，多路的基于珠的免疫测定，免疫沉淀或免疫细胞化学技术。用于实施本发明的多路的基于珠的测定法包括，但不限于，描述在美国专利us6,599,331,6，592，822和6，268，222中的luminex才支术，将这些文献完整地引入本文作为参考。在具体的实施方案中，如国际7>开号w02005/016126中所述使用l認inexlabmap⑧系统，将该文献完整地引入本文作为参考。在本发明的某些实施方案中，对生物标记蛋白质具有特异性的抗体用于检测身体样品中的多个生物标记的表达，以便鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者。该方法包括从患者中获得身体样品，使所述的身体样品接触定向于在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记的抗体，并且检测抗体结合，以便测定所述的生物标记是否在患者样品中超表达。在本发明的筛选方法中，所述生物标记的超表达预示具有卵巢癌的可能性增加。对通过本发明筛选方法分类为具有卵巢癌可能性增加的患者进行额外的诊断测试，以便检测存在的卵巢癌。定期监测通过本发明卵巢癌筛选方法鉴定为目前未患卵巢癌的女性患者，以便能够在早期阶段检测卵巢癌。如上所述，在本发明具体的方面中，用于阶段具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法可以包括两步分析。即该方法包括进行第一测定步骤，包括检测身体样品中第一种生物标记或第一种生物标记组的表达和测定第一种生物标记或生物标记组是否超表达。如果在第一测定步骤中获得阳性结果(即第一种生物标记或生物标记组在身体样品中超表达)，该方法进一步包括进行第二测定步骤，包括检测第二种生物标记或第二种生物标记組的表达并且测定第二种生物标记或生物标记组是否超表达。第一种和第二种生物标记或生物标记组的超表达(即在两个测定步骤中的阳性结果)预示具有卵巢癌的可能性增加。在具体的实施方案中，在蛋白质水平上进行第一和第二测定步骤中的生物标记表达的检测并且包括使身体样品，更具体地说是血清样品接触对所关注的生物标记具有特异性的抗体并且检测抗体结合。在某些方法中，使用elisa或多路的基于珠的免疫测定方式检测生物标记蛋白质表达。在本发明的"两步"筛选方法中，用于第一步的生物标记或生物标记组可以用于将灵敏性和npv最大化。即可以设计第一筛选并组织以便通过本发明方法将分类为阴性的真阴性数量最大化，由此从进一步的分析中消除较大百分比的真阴性。因此，将通过第一测定步骤分类为阳性的患者群体富集在真阳性患者中。可以设计两步法中的第二筛选步骤以便ppv和特异性最大化，同时维持合理的灵敏性，以便鉴定具有最高卵巢癌可能性的女性。可以如上所述测定每一单个测定步骤的特异性，灵敏性，ppv和npv值。当使用两步筛选方法时，就该方法的整体而言，可以测定合并的灵敏性，特异性，ppv和npv值。在具体的实施方案中，用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的两步法具有至少90%的合并的灵敏性，至少98%的合并的特异性，至少10%的合并的ppv和至少99.9°/。合并的npv。本领域技术人员进一步理解尽管详细描述了两步筛选方法，但是包括3，4,5或5个以上测定步骤的类似篩选方法也包括在本发明中。这类经过一段时间再继续的测定步骤可以从存在的卵巢癌中排除其它疾病，诸如心血管疾病。在本发明的某些实施方案中，算法或数学模型可以应用于研发患者样品为"阳性"时(即预示具有卵巢癌的可能性增加)用于测定的"试验规则，，。例如，当检测到he4,ca125,plau-r，妊娠相关蛋白，muc-l和pai-1表达时，篩选试验被视为阳性，只要(1)he4,ca125，妊娠相关蛋白，pai-1和plau-r中的任何三个为阳性(即超表达)；或只要(2)he4和ca125均得到超表达；否则，该试验被视为阴性。在另一个实例中，试验被视为阳性，只要(1)he4，ca125，妊娠相关蛋白，醒p-7和plau-r中的任何三个为阳性(即超表达)；或只要(2)he4得到超表达且ca125,妊娠相关蛋白，画p-7或plau-r中的任何一个也为阳性；否则，该试验被视为阴性。本领域技术人员可以理解可以研发各种这类试验规则并且应用于本发明的方法中，以便鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者，诸如逻辑回归。可以应用的其它数学模型描述在zhou等(2002)statisticalmethodsindiagnosticmedicine(wiley,newyork)中，将该文献完整地引入本文作为参考。在本发明的其它方面中，用于诊断患者卵巢癌的方法包括从患者中获得身体样品，使该身体样品接触定向于在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记的抗体并且检测抗体结合，以便测定所述的生物标记是否在患者样品中超表达。在本发明的诊断方法中，所述生物标记的超表达预示存在卵巢癌。在本发明的其它实施方案中，提供了用于评价疗法在治疗患者卵巢癌中的功效的方法。这类方法一般包括将在疗法开始前获得的第一种患者身体样品中的本发明多个生物标记的表达水平与来自给予所述疗法的至少部分后获得的第二种样品的表达水平进行比较。与在疗法开始前获得的第一种样品相比在第二种患者样品中的生物标记的表达水平明显较低为该疗法在治疗患者卵巢癌中的功效的阳性指征，而在第二种样品中的生物标记表达水平明显较高为该疗法功效的阴性指征。本文所用的"该疗法功效的阳性指征，，是指该疗法在治疗卵巢癌中产生有益效果(例如肿瘤退化等)。"该疗法功效的阴性指征"是指该疗法在治疗卵巢癌方面不具有有益作用。特定治疗功效的阴性指征可能与例如剂量相关。在较高剂量下，疗法可能有效。本领域技术人员公认在这些方法中，术语"疗法"包括治疗卵巢癌的任何疗法，包括，但不限于化疗，放疗，手术摘除肿瘤组织，基因疗法和生物疗法。本发明的方法可以用于在疗法前，过程中和之后评价患者以便评价肿瘤负荷的减少。本发明还提供了监测方法以便评价患者卵巢癌的退化或进展，包括在第一时间点检测第一种患者样品中本发明多个生物标记的表达水平，试验在随后时间点获得的第二种患者样品重复该分析并且比较两个时间点的生物标记表达水平。在随后时间点时患者身体样品中生物标记的表达水平明显较高表明卵巢癌已经发生进展，而表达水平明显较低为卵巢癌已经退化的指征。本文所用的"卵巢癌退化"是指患者在卵巢癌方面的情况已经改善，其特征在于为，例如肿瘤大小减小。"卵巢癌进展"是指患者在卵巢癌方面的情况已经恶化，其特征为，肿瘤大小增加，转移等。术语"退化"和"进展"在疾病状态方面的含义为本领域技术人员所理解。在本发明的某些方面中，使用抗体在蛋白质水平上检测生物标记表达。术语"抗体"广泛包括抗体的天然存在形式和重组抗体，诸如单链抗体，嵌合和人源化抗体和多特异性抗体以及所有上迷的片段和衍生物，这些片段和衍生物具有至少一个抗原结合位点。抗体衍生物可以包括与抗体缀合的蛋白质或化学部分。"抗体，，和"免疫球蛋白"(ig)为具有相同结构特征的糖蛋白。尽管抗体表现出与抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其它抗体类分子。例如，后者类型的多肽类以低水平由淋巴系统并且以增加水平由骨髓瘤产生。术语"抗体"以最广泛的含义使用并且覆盖完全装配的抗体，可以结合抗原的抗体片段(例如fab'，p(ab)2，fv，单链抗体，双抗体)和包括上述的重組肽类。本文所用的术语"单克隆抗体"是指获自基本上同源抗体的抗体，即包含所述群体的各个抗体相同，但除外可以以少量存在的可能天然存在的突变。"抗体片段，，包括完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括fab，fab'，f(ab')2和fv片段；双抗体；直链抗体(zapata等(1995)proteineng.8(10):1057-1062);单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作"fab"片段，它们各自具有单一抗原结合位点；和残留"fc"片段，其名称反映出它易于结晶35的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原合并位点并且仍然能够交联抗原的f(ab')2片段。"fv"为包含完全抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链fv种类中，该区由紧密非共价结合的一个重链和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链fv种类中，一个重链和一个轻链可变域抗原通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以域双链fv种类类似的方式结合在"二聚化，，结构中。正是在这种构型中每个可变域的三种cdrs相互作用以便在vh-vl二聚体表面上确抗原结合位点。6种cdrs共同赋予抗体抗原结合特异性。然而，甚至单一可变域(或仅包含对抗原具有特异性的三种cdrs的一半fv)具有识别和结合抗原的能力，不过，亲和力低于完全结合位点。fab片段还包含轻链恒定域和重链的第一恒定域(chl)。fab片段因在包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的重链ch1结构域羧基末端上的几个残基的添加而不同于fab'片段。fab'-sh为在本文中对fab'的命名，其中恒定域的半胱氨酸残基具有游离巯基。f(ab02抗体片段最初作为fab'片段对产生，它们在其之间带有铰链半胱氨酸。可以通过给合适的受试者(例如家兔，山羊，小鼠或其它哺乳动物)免疫接种生物标记蛋白质免疫原制备多克隆抗体。可以通过标准技术，诸如使用酶联免疫吸附测定(elisa)，应用固定化生物标记蛋白质监测随时间变化的抗体滴度。在免疫接种后的适当时间，例如在抗体滴度最高时，产生抗体的细胞可以获自受试者并且用于通过标准技术，诸如最初由kohler和milstein(1975)nature256:495-497描述的杂交瘤技术，人b细杂交瘤技术(kozbor等(1983)immunol.today4:72)，ebv-杂交瘤技术(cole等(1985)，monoclonalantibodiesandcancertherapy,ed.reisfeld和sel1(alanr，liss,inc.，newyork,ny)，pp.77-96)或三源杂交瘤技术制备单克隆抗体。用于产生杂交瘤的技术为众所周知的(一般参见coligan等eds.(1994)currentprotocolsinimmunology(johnwiley&sons,inc.,newyork,ny);galfre等(1977)nature266:550-52;kenneth(1980)，monoclonalantibodies:anewdimensioninbiologicalanalyses(plenumpublishingcorp.,ny);和lerner(1981)yalej.biol,med.,54:387-402)。作为制备分泌单克隆抗体的杂交瘤的可替代选择，可以通过使用文库)鉴定并且分离单克隆抗体，由此分离结合所述生物标记蛋白质的免疫球蛋白文库成员。用于生成和筛选噬菌体文库的试剂盒为商购的(例如pharmaciarecombinantphageantibodysystem,catalogno.27-9400-01.'和stratagenesurfzap(;phagedisplaykit,catalogno.240612)。另外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可以在如下文献中找到，例如美国专利us5，223，409;pct7>开号w092/18619;w091/17271;w092/20791;wo92/15679;93/01288;w092/01047;92/09690;和90/02809;fuchs等(1991)bio/technology9:1370-1372;hay等(1992)hum.antibod.hybridomas3:81-85;huse等(1989)science246:1275-1281;griffiths等(1993)emboj.12:725-734。本发明的组合物进一步包括特异性结合所关注的生物标记蛋白质的单克隆抗体及其变体和片段。可以如下所述使用可检测物质标记单克隆抗体以便有利于样品中的生物标记蛋白质检测。这类抗体应用于实施本发明的方法。具有本文披露的抗体结合特征的单克隆抗体也包括在本发明中。组合物进一步包括单克隆抗体抗原结合变体和片段，产生这些抗体的杂交瘤细胞系和分离的编码这些单克隆抗体氨基酸序列的核酸分子。还提供了具有本发明单克隆抗体结合特征的抗体。"结合特征"或"结合特异性，，在用于涉及抗体时是指该抗体将相同或相似抗原表32位识别为对比抗体。这类抗体的实例包括，例如在竟争性结合测定中与本发明单克隆抗体竟争的抗体。本领域技术人员可以使用标准方法确定抗体是否竟争性干扰另一种抗体。所谓"表位"是指产生抗体并且该抗体结合的可以分子的部分。表位可以包含直链氨基酸残基(即在表位内的残基以直链方式依次排列)，非直链氨基酸残基(本文称作"非直链表位，，；这些表位并非依次排列)或直链和非直链氨基酸残基。一般而言，表位为短氨基酸残基，例如约5个氨基酸长度。用于鉴定表位的系统技术为本领域公知的并且描述在例如美国专利us4，708，871中。简言之，可以合成来源于抗原的一组重叠寡肽类并且它们与针型固相阵列结合，其中在每一针上具有唯一的寡肽。针型阵列可以包括96孔的微升平板，从而允许同时测定所有96种寡肽，例如结合生物标记特异性单克隆抗体的寡肽。可选择地，目前可商购噬菌体展示肽文库试剂盒(newenglandbiolabs)用于表位作图。使用这些方法可以测定每一可能亚组的连续氨基酸的结合亲和力以便鉴定指定抗体结合的表位。还可以在表位长度肽序列用于对获得抗体的动物免疫接种时通过推断鉴定表位。还可以根据作为存在于糖蛋白上的n-连接或o-连接的寡糖类的碳水化合物侧链确定表位。进一步提供了本文披露的单克隆抗体的抗原结合片段和变体。这类变体保持了亲代抗体的所需结合特性。用于制备抗体片段和变体的方法为本领域中一般可获得的。例如，可以通过在编码所关注的抗体的克隆dna序列中的突变制备单克隆抗体的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变方法为本领域众所周知的。例如，参见walker和gaastra，eds.(1983)techniquesinmolecularbiology(macmillanpublishingcompany,newyork);kunkel(1985)proc.natlacad.sci.usa82:488-492;kunkel等(1987)methodsenzymol.154:367-382;sambrook等(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(coldspringharbor,newyork);美国专利us4,873,192;和其中的引述的参考文献；将它们引入本文作为参考。在dayhoff等的才莫型(1978)atlasofproteinsequenceandstructure(natl.biomed.res.found.,washington,d.c.)中发现了有关不影响所关注的多肽的生物活性的氨基酸取代的指导原则，将该文献引入本文作为参考。可以优选保守取代，诸如一种氨基酸与另一种具有类似特性的氨基酸交换。保守取代的实例包括，但不限于gly<->ala，vak<=>ile<->uu，asp<->glu,lys<->arg，asn<=>gln和phe<->trp<=>tyr。在构建所关注的多肽变体中，进行修饰，使得变体持续具有所需活性，即与生物标记的类似结合亲和力。显然，在编码变体多肽的dna中的任何突变不一定使序列脱离读框并且优选不产生可以产生二级mrna结构的互补区。参见ep专利申请号75,444。优选参比生物标记抗体的变体与参比抗体分子或该参比抗体分子的较短部分的氨基酸序列具有至少70%或75%序列同一性，更优选至少80%或85°/。序列同一性，更优选至少90%,91%，92%，93°/。，94%或95%序列同一性的氨基酸序列。更优选所述分子共有至少96%,97%,98%或99%的序列同一性。就本发明的目的而言，使用smith-waterman同源性检索算法确定序列同一性百分比，其中使用具有空位开放罚分为12空位延伸罚分为2的，bl0sum阵列为62同源空位检索。smith-waterman同源性检索算法教导在smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482"89中。例如，变体与参比抗体的不同在于少至l-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，诸如6-10，少至5，少至4,3，2乃至1个氨基酸残基。在两个氨基酸序列的最佳序列对比方面，变体氨基酸序列的连续片段可以具有额外的氨基酸残基或在参比氛基酸序列方面可以具有缺失的氨基酸残基。用于与参比氨基酸序列对比的连续片段包括至少20个连续氨基酸残基并且可以为30，40，50或50个以上氨基酸残基。可以进行用于与保守残基取代或缺口相关的序列同一性校正(残基smith-waterman同源性检索算法)。本领域技术人员公认需要优化试剂和条件，例如抗体滴度和检测抗原-抗体结合的参数以便使特定抗体的信噪比最大化。测定使与特异性结合本发明生物标记最大化和使非特异性结合(或"背景")最小化的抗体浓度。在具体的实施方案中，通过最初对患者血清样品测试不同抗体稀释液测定适当的抗体滴度。优化抗体滴度和检测条件的测定设计为标准的并且充分属于本领域技术人员的常规能力范围。某些抗体需要额外的优化以便减少背景和/或增加特异性和灵敏性。此外，本领域技术人员公认用于实施本发明方法的特定抗体浓度根据诸如结合时间，用于生物标记蛋白质的抗体的特异性水平和身体样品制备方法这类因素的不同而改变。此外，当多个抗体用于单一样品时，所需浓度可以依次受到影响，其中将抗体施用于样品，即作为混合物同时或依次作为各个抗体试剂施用。此外，还必须优化用于使结合所关注生物标记的抗体显现的检测化学以便产生所需的信噪比。可以通过使抗体与可检测物质偶联有利于抗体结合检测。可检测物质的实例包括各种酶，假拟基团，荧光物质，发光物质，生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，a-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的假拟基团复合物的实例包括链霉抗生物素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶，荧光素和水母荧光素；且合适的放射性物质的实例包括1251,1311，"s或t选择对所关注的生物标记蛋白质具有高度特异性的抗体用于实施本发明。用于制备抗体和选择适当抗体的方法为本领域干重的。例如，参见celis，ed,(印刷中)cellbiology&laboratoryhandbook,3rdedition(academicpress,newyork),将该文献完^"地引入本文作为参考。在某些实施方案中，定向于特异性生物标记蛋白质的商购抗体可以用于实施本发明。基于细胞学而非组织学样品的理想染色选择本发明的抗体。即在具体的实施方案中，使用关注的目标样品类型(即血清样品)和结合特异性选择抗体。在其它实施方案中，在核酸水平上检测所关注的生物标记的表达。用于评价表达的基于核酸的技术为本领域众所周知的并且包括，例如测定身体样品中生物标记mrna的水平。许多表达检测方法使用了分离的rna。不针对分离mrna选择的任何rna分离技术可以从血清样品中纯化rna(例如，参见ausubel等，ed.，(1987-1999)currentprotocolsinmolecularbiology(johnwiley&sons,newyork)。另夕卜,用于使用本领域技术人员众所周知的技术加工大量血液，血清或组织样品，诸如，例如chomczynski的单步rna分离方法(1989，美国专利us4，843，155)。术语"探针"是指能够选择性结合特别指定的靶生物分子的任何分子，例如核苷酸转录物或由生物标记编码或相当于生物标记的蛋白质。探针可以由本领域技术人员合成或来源于适当的生物制品。可以具体设计标记的探针。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于rna，dna，蛋白质，抗体和有机分子。分离的mrna可以用于杂交或扩增试验，包括，但不限于dna或rm分析，聚合酶链反应分析和探针阵列。用于检测mrna水平的一种方法包括使分离的mrna接触可以与检测基因编码的mrna杂交的核酸分子(探针)。例如，核酸探针可以为全长cdm或其部分，诸如至少7，15，30，50,100,250或500个核苷酸长度并且足以在严格条件下与编码本发明生物标记的mrna或基因组dna特异性杂交的寡核苷酸。mrna与所述探针杂交表明所述生物标记被表达。在一个实施方案中，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mrna并且将mrna从凝胶上转至膜，诸如硝化纤维上使mrna固定在固相表面并且接触探针。在可选择的实施方案中，使探针固定在固相表面上并且例如在affymetrix基因芯片阵列中使mrna接触探针。本领域技术人员易于采取公知的mrna检测方法用于检测由本发明生物标记编码的mrna水平。用于测定样品中生物标记mrna水平的可选择方法包括核酸扩增方法，例如通过rt-pcr(mullis，1987，美国专利us4，683，202中所述的实验实施方案)，连接酶链反应(barany(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:189-193)，连接酶链反应(guatelli等(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:1874-1878)，转录扩增系统(kwoh等(1989)proc.natlacad.sci.usa86:1173-1177),q-a复制酶(lizardi等(1988)bio/technology6:1197)，滚动循环复制(lizardi等，美国专利us5，854，033)或任何其它核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。这些检测方案尤其用于检测核酸分子，只要这类分子以极低数量存在。在本发明具体的方面中，通过定量荧光rt-pcr(即taqmansystem)评价生物标记表达。这类方法一般使用对所关注的生物标记具有特异性的寡核苷酸引物对。用于设计对公知序列具有特异性的寡核苷酸引物的方法为本领域众所周知的。可以使用膜印迹(诸如用于杂交分析，诸如rna，dna，斑点印迹等)或微孔，样品管，凝胶，珠或纤维(或包含结合核酸的任何固相支持体)监测rna的生物标记表达水平。参见美国专利us5，770，722,5,874,219，5,744,305,5,677,195和5,445,934，将这些文献引入本文作为参考。生物标记表达的检测还可以包括使用在溶液中的核酸探针。在本发明的一个实施方案中，微阵列用于检测生物标记表达。微阵列特别充分适合于该目的，因为在不同实验之间具有再现性。dm微阵列提供了一种同时测定大量基因表达水平的方法。每种阵列由结合在固相支持体上的俘获探针的可再现模式组成。标记的rna或dna与阵列上的互补探针杂交且然后通过激光扫描检测。测定阵列上每一探针的杂交强度并且将其转化成代表相对基因表达水平的定量值。参见美国专利us6,040，138，5，800，992和6，020，135，6，033，860和6,344,316，将这些文献引入本文作为参考。高密度寡核苷酸阵列特别用于测定样品中定量rna's的基因表达概况。使用机械合成法合成这些阵列的技术描迷在例如美国专利us5,384，261中，为所有目的将该文献完整地引入本文作为参考。尽管优选平面阵列表面，但是可以将该阵列装配在实际上任何形状的表面乃至多个表面。这类可以为在珠，凝胶，聚合物表面，纤维，诸如光导纤维，玻璃或任何其它合适的底物上的肽类或核酸，参见美国专利us5，770，358，5,789,162，5,708,153，6，040，193和5，800,992，为所有目的将这些文献各自完整地引入本文。可以以这类方式包装阵列，以便能够在全包含装置中进行诊断或其它操作。例如，参见美国专利us5，856，174和5，922，591，引入本文作为参考。在一种手段中，将分离自样品的总mrna转化成标记的crna且然后与寡核苷酸阵列杂交。使每种样品与单独的阵列杂交。可以通过参比存在于阵列上和样品中的适当对照品计算相对转录物水平。进一步提供了用于实施本发明筛选和诊断方法的试剂盒。所谓"试剂盒"是指人任何制品(例如包装或容器)，其包括至少一种试剂，例如抗体，核酸探针等，该试剂盒用于特异性检测本发明生物标记的表达。该试剂盒可以作为进行本发明方法的装置加速，分配或销售。另外，这些试剂盒可以包含描述说明书及其使用方法的包装说明书。在具体的实施方案中，用于鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的篩选方法的试剂盒包括定向于所关注的生物标记蛋白质的多个抗体，特别是其中生物标记选自he4,ca125,妊娠相关蛋白，薩p-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素a，puu-r，促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶。检测结合生物标记的抗体的化学物质也可以包括在试剂盒中。本发明的试剂盒中进一步包括在elisa或多路的基于珠的免疫测定方式中使用抗体检测生物标记表达的其它试剂。在其它实施方案中，用于本文披露的筛选方法的试剂盒包括用于检测身体样品中多个生物标记表达的核酸探针，特别是其中生物标记选自he4,ca125,妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-l,cthrc1，抑制素a，plau-r，促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶。在本发明的某些方面中，提供了用于进行鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的两步筛选方法的试剂盒。可以设计试剂盒以便作为两个单独的试验进行两步筛选方法。这类试剂盒包括用于进行单一测定步骤的试剂(即第一或第二测定步骤)。在其它实施方案中，试剂盒包括试剂，使得将两步法作为单一试验进行(即包括用于第一和第二测定步骤的试剂)。本发明包括的其它试剂盒应用于实施上文所述的单步筛选方法。这些说空话可以进一步包括应用于一步或两步篩选方法的算法或数学模型说明书以及在几乎或没有人为干预下执行算法/数学模型的自动化平台。进一步提供了试剂盒，使得两步法中的每步均以自动化，半自动化或手工方式进行。还提供了用于诊断卵巢癌的试剂盒。这类试剂盒可以包括对检测在卵巢癌中选择性超表达的多个生物标记具有特异性的抗体或核酸探针，更具体地说，所述的生物标记为he4,ca125，妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-1，cthrc1，抑制素a，plau-r，促乳素，klk-10，klk-6，slpi和ot-l抗胰蛋白酶。本领域技术人员进一步理解在本发明筛选和诊断方法中的任何或所有步骤均可以通过人工执行，或可选择地以自动化方式进行。即可以以自动化，半自动化或手工方式实施这些方法。此外，还可以将本文披露的方法与其它关注或随后研发的方法联用以便能够更精确地鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者或更可靠地诊断卵巢癌。冠词"a"和"an"在本文中使用时是指一种或一种以上(即至少一种)该冠词合乎语法的对象。作为实例，"一种要素"是指一种或多种要素。在本说明书上下文中，措词"包括"或变化形式，诸如"包含"或"含有，，应理解为是指包括所述的要素，整体或步骤或要素，整体或步骤组，但不排除任何其它要素，整体或步骤或要素，整体或步骤组。通过例证提供了下列实施例，但绝不起限定作用实验实施例1:采血，将血液加工成血清的典型方法，血清储存条件和血清运送条件血液采集通过静脉穿刺术抽取足够量的血液置于不含添加剂的bectondickinsonvacutainer红盖采集管(目录号366430)。记录采血管的批号。不冷藏或冷冻全血。在采血后即刻开始将全血加工成血清。血清制备操作将采血管直立放在支架上并且在室温下储存。使血液在距釆集时间最少60分钟并且最多90分钟凝固。在离心前使血液充分凝固。记录每一样品完全凝固所需的时间。在血液充分凝固后，使用摆动头或固定角离心机转子以1300xg将样品离心10分钟。从离心机中谨慎取出管以避免破坏底部的红细胞。在不破坏细胞沉淀的情况下从每支管中取下塞。使用一次性移液管在不破坏细胞层或使任何细胞浸入移液管的情况下将来自每一供体的血清合并入标记管。如果在转移过程中破坏了细胞，那么如上所述重新离心才羊品。通过将管緩慢倒置5次混合来自每一供体的血清样品。将1ml等分部分放入标记管中并且冷冻在-20x:--80c下。在冷冻前不在室温下储存血清2小时以上或在2-8匸下储存血清8小时以上。实施例2:卵巢生物标记选择研究-各个生物标记分析生物标记选择研究的目的在于评价一组14种候选卵巢癌生物标记的最初临床应用。本研究的前提在于能够鉴定和定量患者血清中每一生物标记的量。在elisa方式中使用商购或新的生物标记特异性抗体检测血清样品中生物标记蛋白质表达。分析了14种靶生物标记，如下表1中所述tableseeoriginaldocumentpage41
本研究的靶群体和人口统计数据在这种类型的评价中，所必需的是测试样品为靶临床群体的代表并且正常对照组为人口统计学匹配的。在本研究中分析了总计900各患者的血清样品。这些样品中的200个来自疾病不同阶段的卵巢癌患者(即200个样品均匀地分离自阶段1，2，3的卵巢癌样品)。在本研究中使用总计500个正常血清。正常血清样品中的104个来自绝经后女性(在本研究中将女性年龄设定为超过55岁)，以便建立每一生物标记的基线水平并且计算适当的阈截止值。将剩余的396个正常血清样品均分在55岁以下的绝经前女性与55岁以上的绝经后女性之间。这种分布能够研究任何年龄或激素相关患者分布。如上文所述(即"干扰条件"或"干扰病理学情况")从具有各种疾患/疾病的供体中采集本研究中剩余的200个样品。包括这些样品能够分析可能影响各个生物标记性能的任何干扰病理学情况。表2-4中提供了分析的患者群体和研究人口统计数据的概述。表2:本研究中样品病例的人口统计数据
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表3:研究中卵巢癌患者的临床特征
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本研究的自动化和验证分析的一般描述对m种标记各自一式两份加工所有900血清样品。将具有条形码跟踪的自动化测定系统用于生成标记选择数据。均使用tecanevo自动化机器人液体处理机完成这种标记选择研究中运行的测定。这种平台的应用能够在单一实验运行中加工用于每一标记的的900个样品(每天运行一次)。在加工任何研究样品前验证自动化平台的精确度。使用緩冲溶液作为标准曲线稀释剂处理用于本研究的所有elisa测定。进行这一操作以便尽可能使用于每一测定的方案标准化。用于本研究的正常血清荻自适应地方irb风俗的社区输血中心。尽管这些数据可以被视为'正常的，，但是必须注意这些供体未经医学专业人员筛选以证实它们无病或为正常状态。血清样品中he4的表达检测(有代表性的实施例)材料和方法a.测定平板的包被给elisa96-孔平板包被10(^1/孔初级抗体，即在pbs中2pg/ml的抗-he4单克隆90.1#6，然后将平板在4"c下孵育过夜。第二天，用pbs将平板洗涤一次，然后将250pl/孔的pbs-3%bsa加入到所有孔中并且将平板在30c下孵育2小时。然后排空平板并且在室温下和真空烘箱内干燥2小时。随后将它们在聚酯薄膜箔袋内部与干燥包一起热密封并且储存在4c下直到用于测定为止。b.测定方法在用于测定前即刻将包含测定平板的箔袋温至室温。将血清样品按照1:4稀释入pbs-1%牛血清-0.05%tween20-1mg/ml小鼠igg。将he4抗原蛋白稀释至100ng/ml，然后连续稀释2倍入pbs-l。/。牛血清-o.05%tween20-1mg/ml小鼠igg，然按照1:4将所有个体标准曲线样品稀释入緩冲液，使得将它们按照与血清样品相同的方式稀释。将稀释的血清样品和标准曲线样品以100fil/孔体积加入到抗-he4包被测定平板中。然后将平板在30c下孵育2小时。接下来用250pl/孔的pbs-o.05%tween20将平板洗涤5x。将二次抗体抗-he4单克隆71.1#1.13-hrp按照1:16，000稀释入pbs-l。/。牛igg-o.05%tween20-1mg/ml小鼠igg。然后将二次抗体溶液以100nl/孔体积加入到抽吸平板中。将平板在30'c下孵育1小时。用250nl/孔的pbs-o.05%tween20将平板洗涤5x。在4吏用前将展开溶液tmb(3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)温至室温且然后将tmb以100pl/孔体积加入到抽吸平板中。在室温下将平板孵育10分钟且然后将终止溶液2nh2s04"100pl/孔体积加入到平板(含tmb)中。将平板在室温下孵育10分钟且然后在450nm下的moleculardevicesspectramax平板读出器上读取它们，其中参比波长为650nm，使用softmaxpro软件。将数振保存为softmaxpro文件并且还作为文本文件输出与msexcel联用q对照组所有的血清为用作高对照uniglobe#72372所有的血清为用作低对照uniglobe#7"04所用的緩冲液对照组为pbs-l。/。牛血清-0.05°/。tween20-lmg/ml小鼠igg将通过所有25个平板的对照组的cvs概括在表5中。表5:通过所有25个平板的对照组的cvs通过所有25个平板的标准品点/点cv%ng/mlmeanodsdcv02,6140.1455,6501,6810.1016.0250.9310.075汰112.50,5100.0438.46.250.2630.02710.43.130.1390.01410.01.560.0760.00810.50.780.0440.01227.6结果(标准曲线)通过在pbs/ry4牛血清/0.05%tween20-1mg/ml小鼠igg中稀释he4蛋白质制备he4的标准曲线。这类标准曲线的制备为本领域众所周知的。基本上如上文对he4所述对剩余的生物标记产生标准曲线和所有血清样品中生物标记的水平或浓度，其中的变化形式可以得到本领域技术人员理解和执行。下文中提供了用于分析的生物标记(即he4，妊娠相关蛋白，slpi,plau-r，muc-1，pai-l,醒p-7，抑制素，ca125，cthrc1，klk-6，klk-io，a-l抗胰蛋白酶和促乳素)的标准曲线范围和曲线拟合方程。堅标准曲线实验范围-0.78ng/ml-100ng/ml，在连续2倍稀释液中.曲线拟合-三级多项式，y--le-07x3-0.0001x2 0.0402x 0.0157;r2-0.9999.然后将标准曲线样品和血清样品按照1:4稀释以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度妊娠相关蛋白.标准曲线实验范围-3ng/ml-100ng/ml,在连续2倍稀释液中.曲线拟合=二次方，y--0.0003x2 0，0478x 0.0952;r2=0.9851.在未稀释的测定中运行血清样品，由此在数学分析中不使用稀释因子slpi.标准曲线实验范围=2.38ng/ml-305ng/ml，在连续2倍稀释液中曲线拟合-三级多项式，y=7e-08x3—7e-05x2 0.0237x一0.039;r2=0.9997.在自动化样品制备技术的早期阶段按照1:6.1稀释血清样品。然后在另一自动化步骤中按照1:6.6进一步稀释女性稀释的血清样品，以便获得l:40的总稀释度。然后在测定中运行1:40稀释的样品。在上述浓度下(实验范围)制备标准曲线样品，然后按照1:6.1进一步稀释所有那些标准曲线样品且然后在测定中运行那些按照1:6.l稀释的样品。由于在血清样品稀释液(l:40)与标准曲线样品稀释液(1:6.1)之间存在偏差，所以将获自标准曲线的所有血清样品浓度值乘以稀释因子"6.6"以便校准偏差(1:40=1:6.1x1:6.6)。upar(plau-r).标准曲线实验范围=62.5pg/ml-4000pg/ml，在连续2倍稀释液中-曲线拟合=线性，y=0.0006x 0.0522;r2=0.9977在自动化样品制备技术的早期阶段按照1:6稀释血清样品。然后在另一自动化步骤中按照1:3进一步稀释女性稀释的血清样品，以便获得1:18的总稀释度。然后在测定中运行1:18稀释的样品。在上述浓度下(实验范围)制备标准曲线样品，然后按照l:3进一步稀释所有那些标准曲线样品且然后在测定中运行那些按照1:3稀释的样品。.由于在血清样品稀释液(l:18)与标准曲线样品稀释液(1:3)之间存在偏差，所以将获自标准曲线的所有血清样品浓度值乘以稀释因子"6"以便校准偏差(1:18=1:3x1:6)。muc-1.标准曲线实验范围-o.3u/ml-600u/ml，在连续3倍稀释液中'曲线拟合-三级多项式，y=3e-07x3-0.ooolx2 0.0236x 然后按照1:2稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。pai-1标准曲线实验范围-o.78ng/ml-100ng/ml，在连续2倍稀释液中■曲线拟合-线性，y=0.0139x 0.0151;r2-0.9996然后按照1:4稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。mmp-7.标准曲线实验范围-o.16ng/ml-20ng/ml，在连续2倍稀释液中■曲线拟合-三级多项式，y=0.ooolx3-0.0046x2 0.1578x 0.0936;r2-0.9999.然后按照1:2稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。抑制素标准曲线实验范围=10pg/ml-1000pg/ml，在连续2倍稀释液中.曲线拟合-线性，y=0.0007x 0.0136;r2=0.9997.然后按照1:3稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。ca125'标准曲线实验范围-15u/ml-400u/ml,在连续2倍稀释液中.曲线拟合-线性，y-0.0021x 0.0892;r2-0.9986在未稀释的测定中运行血清样品，由此在数学分析中不使用稀释因子。ct匿l.标准曲线实验范围-o.78ng/ml-100ng/ml,在连续2倍稀释液中曲线拟合=线性，y=0.0261x 0.042;r2=0.9991然后按照1:2稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。klk-6.标准曲线实验范围-o.78ng/ml-100ng/ml，在连续2倍稀释液中.曲线拟合-三级多项式，y=-4e-07x3 0.ooolx2 0.0133x 0.0662;r2=1.0然后按照1:2稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。klk-10.标准曲线实验范围-lng/ml-80ng/ml,在连续2倍稀释液中.曲线拟合-线性，y=0.0758x-0.0312;r2=0.9976.然后按照1:4稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分48析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。al抗胰蛋白酶标准曲线实验范围=3.3ng/ml-90ng/ml，在连续2倍稀释液中'曲线拟合-二次方，y--0.0002x2 0.0412x 0.0592;r2=0.9997按照1:250，000稀释血清样品且然后在测定中运行。如上所述连续稀释标准曲线样品(实验范围)且然后在测定中运行那些样品。.由于在血清样品稀释液(l:250，ooo)与标准曲线样品稀释液(连续稀释外的未稀释)之间存在偏差，所以将获自标准曲线的所有血清样品浓度值乘以稀释因子"250，000"以便校准偏差。促乳素.标准曲线实验范围-2ng/ml-240ng/ml，在连续2倍稀释液中.曲线拟合-线性，y-0.0049x 0.0363;r2-0.9917.然后按照1:5稀释标准曲线样品和血清样品以便在测定中运行；由于按照相同方式稀释血清样品和标准曲线样品，所以在数据分析过程中无需使用稀释因子测定未知血清样品的浓度。结果-各标记性能在500个用于本研究的正常病例中，104个正常病例用作对照组以便选择阈截止点。表6提供了基于这l(m个正常病例的每个标记平均值，标准偏差，范围，平均值 2*81(1,平均值 3,std。表7和表8研究病例(195或195个以下)的平均标准偏差，范围，平均值 2'std。就每一生物标记而言，平均值和标准偏差在正常阈值对照组病例与年龄超过55岁患者的正常研究病例之间极为类似，但除外标记e4和抑制素。参见表6和8。表6:104个正常对照组病例中每个生物标记的平均值和std
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*正常病例中的值与正常对照组病例中的值极为不同，这意味着这些标记可能因年龄影响而敏感，表8:正常研究病例中每个生物标记的平均值和std(年龄超过55岁的患者)
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*^^常研壳病'^中'的'标准偏差大于4^正常对照組超过55岁的患者病例中的标准偏差.**在正常研究病例中的平均值和标准偏差大于在正常对照組年龄超过55岁患者病例中的平均值和标准偏差就每一单个标记而言，获得r0c曲线。r0c曲线仅由396个正常病例和200个卵巢癌病例组成。在本分析中不包括作为对照组的104个正常病例和200个干扰物质/病理学情况病例。将he4，抑制素a，促乳素，plau-r，妊娠相关蛋白，slpi，cthrc1，pai-1，klk-io，ca125,klk-6，muc-1和mmp-7的roc曲线分别列在图2-14中。此外，根据年龄组，癌症阶段和干扰物质/病理学情况类别测定每一标记的阳性和阴性样品百分比。这些测定基于两类截止点(1)平均值 2,std和(2)来自roc曲线的最佳截止值。最佳截止点选自具有最高灵敏性加上特异性值的roc曲线。将最佳截止点列在表6中。将根据年龄组，癌症阶段和干扰物质/病理学情况类别对每一生物标记概括的阳性和阴性结果列在表9-47中。生物标i己he4表9:he4的年龄组的概括
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表16:klk-6的千扰物质/病理学情况类别概括
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生物标记klk-10表18:klk-10的年龄组的概括
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表23:pai-1癌症阶段组的概括
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生物标记cthrcl表24:cthrcl的年龄组的概括
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表25:cthrcl的干扰物质/病理学情况组的概括
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生物标记slpi
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阴性822.861028.57总计35100.0035100.00血管病症阳性312.0028.00阴性2288.002392.00总计25100.0025100.00'漫性免疫性病症阳性819.0549.52阴性3480.953890.48总计42100.0042100.00表32:抑制素癌症阶段组的概括来自roc图的最佳截止值平均值 2'std阶段结果n%n%1阳性2537.312029.85阴性4262.694770.15总计67100,0067100.002阳性3553.033248.48阴性3146.973451.52总计66100.0066100.003阳性2334.331623.88阴性4465.675176.12总计67100.0067100.00生物标记妊娠相关蛋白表33:妊娠相关蛋白的年龄组的概括来自roc图的最佳截止值平均值 2"td年龄<=55年龄>55年龄<=55年龄>55组结果n%nn%n%1阳性5358.891816.673640.00109.26阴性3741.119083.33s460.009890.74总计90100.00108100.0090100.00108100.002阳性7336.32105.135627.8631.54阴性12863.6818594.8714572.1419298.46总计201100.00195100.00201100.00195100.003阳性6565.006262.004949.005252.00阴性3535.003838.005151.004848.00总计100100.00100100.00100100.00100100.00表34:妊船目关蛋白的干扰物质/病理学情况组的概括
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生物标ii:固p-7表36:mmp-7的年龄组的概括
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表37:醒p-7的干扰物质/病理学情况组的概括
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表38:画p-7癌症阶段组的概括
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生物标记plau-r表39:plau-r的年龄组的概括
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表40:plau-r的干扰物质/病理学情况组的概括
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表41:plau-r癌症阶段组的概括
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表42:促乳素的年龄组的概括
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表43:促乳素的干扰物质/病理学情况组的概括
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表47:ca125(labcorp数据)癌症阶段组的概括
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分别基于肿瘤阶段，正常2-标准偏差极限或"最佳拟合"将分析的13种生物标记的灵敏性概括列在表48-50中。表48:根据肿瘤阶段(基于最佳截止值)的个体标记灵敏性的概括
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表49:各个标记灵敏性的概括(基于正常2sd极限)
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表50:各个标记灵敏性的概括(基于最佳截止值)
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实施例3:卵巢生物标记选择研究-多个生物标记分析逻辑回归法用于选择本研究的最佳生物标记。使用逻辑回归，通过发现产生最大r-平方值与因变量的生物标记开始逐步选择。然后由于得出"最佳"生物标记在模型中，所以逻辑回归发现接下来的最佳生物标记以添加到r-平方中产生。根据确定的统计学标准，当生物标记不再添加到r-平方中时，终止这种发现添加到r-平方中的一组生物标记的方法。这些组生物标记并非唯一的，因为生物标记中的某些基于相同的预测性能。基于一种选择的模型，可以产生r0c图，它提供了灵敏性与特异性比例的相关性。因此，可以选择适当的特异性和灵敏性以便获得具有可接受灵敏性的预计的ppv。表51和52提供了几个实例，它们涉及具有较高灵敏性和适当灵敏性与约10%ppv且合并灵敏性比例约为70%-80%的一组生物标记，其中推定为该群体为8，000，000个且发病率为0.25%。可以通过选择不同的测定截止值，不同的生物标记组合和不同的合并生物标记的规则获得灵敏性，特异性，npv和ppv的不同目标值。使用生物标记值作为连续变量(表51)和作为范畴变量分析生物标记性能(表52)。作为定义，当进行两个测定步骤时，第一测定步骤称作"筛选试验，，且第二步可以称作"反应值试验，，。"最佳截止点"是指获自产生最佳灵敏性和特异性的特定生物标记的roc图的值。"平均值 2*std，，是指基于对来自未患有卵巢癌的患者的正常样品的分析的平均表达水平加上2倍标准偏差。作为连续变量的生物标记性能^51:由不同模型的发病率调节的估计的灵敏性，特异性，ppv和npv(生物标记值为连续变量)
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作为范畴变量的生物标记性能表52:由不同模型的发病率调节的估计的灵敏性，特异性，ppv和npv(生物标记值为范畴变量)
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,在最佳截止值或平均值 2std病例中ca125截止值>=35。**推定群体=8，000，000;发病率=0.25、估计的癌症病例=该群体中的20,000。 尽管在单步中测定了所有列出的生物标记，但是额外的算法也应用于获得表中所示的灵敏性，特异性，ppv和npv的值。使用"试验规则"获得的灵敏性，特异性，ppv和npv结果在本研究中，生物标记he4，ca125，plau-r，妊娠相关蛋白，muc-l，pai-l,丽p-7和抑制素为基于作为连续或范畴变量的标记性能最频繁选择的标记。与上述统计学方法相反，表53基于两种试验规则提供了灵敏性，特异性，ppv和npv(由发病率调节)(1)如果上述生物标记中的任何两个为阳性(即超表达)，那么宣布试验为阳性；或(2)如果上述生物标记中的任何3个为阳性(即超表达)，那么宣布试验为阳性。尽管与上述表51和52中提供的结果相反，但是应用任一试验规则均不会产生高特异性比例，由此在为低卵巢癌发病率调节时产生不可接受的低ppv(〈1.5%)。应用"试验规则"，诸如本文所述的那些代表了本领域目前在阶段基于卵巢癌危险增加的患者的状态。表53:基于试验规则的发病率调节的估计的灵敏性，特异性，ppv和npv
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傘在最佳截止值或平均值 2std病例中ca125截止《**推定群体=8，000,000;发病率-o.25%,估计的痛实施例4:卵巢生物标记选择研究-使用一步法的多生物标记分析使用如上文所述的一步筛选方法评价所有患者和年龄超过55岁的患者的生物标记he4，ca125和妊娠相关蛋白及其组合的表达。特别地，表54提供了年龄超过55岁的患者的一步算法的结果。该试验算法基于线性逻辑回归模型并且在该模型中使用每个标记的实际值。线性逻辑回归模型(和其它算法)为本领域常规和众所周知的。例如，参见fleiss(2003)statisticalmethodsforratesandproportions(3"ed.)，将该文献完整地引入本文作为参考。该算法在96.4%特异性下提供了76.8%的灵敏性。定义为阳性的试验结果基于下列线性逻辑回归模型:ln(p/(l-p))--4.2391 0.0888*ca125 0.1790*he4 0.2349*gly，其中p为ca125，he4和妊娠相关蛋白在患者身体样品中超表达的卵巢癌的条件概率。使用测定的ca125,应用制造商推荐的>35u/ml的截止值获得了类似的结果i。
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实施例5:引导程序分析法研究方法的验证还进行引导程序分析法以便确保用于上述研究的灵敏性和特异性的粗略估计值，因为无法利用独立和唯一组癌症血清验证该模型。引导程序分析法由人工生成iooo个随机数据集组，它们作为来自研究样品组的替代选择。选择在本研究中基于最佳性能的一组最频繁选择的标记he4，ca125,plau-r，妊娠相关蛋白，muc1和pai-1。将"试验"定义如下试验为阳性，只要(1)he4为阳性且ca125,妊娠相关蛋白，腿p-7，plau-r中的任何一个为阳性；或(2)he4为阴性，而ca125，妊娠相关蛋白，mmp-7，plau-r均为阳性；否则，"试验"为阴性。从1000个随机样品中获得这种定义试验的灵敏性/特异性的平均值/标准偏差和95%的置信区间。表55:生物标记序列信息
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本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请引入本文作为参考，其引入与将每篇单独的出版物或专利申请明确和分别引入作为参考的程度相同。尽管为清楚理解的目的已经通过说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但是显然可以在附加的实施方案范围内实施某些改变和变型。权利要求1.鉴定患卵巢癌的可能性增加的患者的筛选方法，该方法包括a)进行第一测定步骤，包括检测身体样品中的第一生物标记或第一组生物标记的表达并且确定第一生物标记或第一组生物标记是否得到超表达；和b)如果在步骤(a)中确定了第一生物标记或第一组生物标记得到超表达，那么进行第二测定步骤，第二测定步骤包括检测身体样品中的第二生物标记或第二组生物标记的表达并且确定第二生物标记或第二组生物标记是否得到超表达；其中第一和第二生物标记或第一和第二组生物标记的超表达预示患者患卵巢癌的可能性增加。2.权利要求1所述的方法，其中对鉴定为患卵巢癌的可能性增加的患者进行额外的诊断测试，以便确定该患者是否患有卵巢癌，其中额外的诊断测试选自骨盆检查，经阴道超声，ct扫描，mri,剖腹术，腹腔镜检查和组织样品活检。3.权利要求1所述的方法，其中以定期为基础进一步监测鉴定为患卵巢癌的可能性增加，而确定目前并未患有卵巢癌的患者。4.权利要求l所述的方法，其中该方法用于检测早期卵巢癌。5.权利要求1所述的方法，其中通过分析每个生物标记的受者作用特征(r0c)图确定每个生物标记的表达阈水平，其中高于阈水平的表达水平表明特定的生物标记得到超表达。6.权利要求5所述的方法，其中与正常患者群体中表达水平相比确定每个生物标记的表达阈水平。7.权利要求1所述的方法，其中按照权利要求1所述方法筛选的患者为无症状的并且具有卵巢癌家族史或指示发生卵巢癌高危险性的临床危险因素。8.权利要求1所述的方法，其中在绝经后女性患者群体中进行所述的筛选方法。9.权利要求1所述的方法，其中所述的身体样品为血液或血清样品10.权利要求i所述的方法，其中使用抗体在蛋白质水平上检测第一和第二生物标记或生物标记组的表达。11.权利要求io所述的方法，其中使用elisa方式或多路的基于重珠的免疫测定法检测第一和第二生物标记蛋白或生物标记蛋白组的表达。12.权利要求1所述的方法，其中使用rt-pcr在核酸水平上检测第一和第二生物标记或生物标记组的表达。13.权利要求1所述的方法，其中所述的生物标记选自he4，ca125，妊娠相关蛋白，画p-7，muc-l,pai-1，cthrc1，抑制素a，plau-r，促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶。14.权利要求13所述的方法，其中所述的生物标记选自ca125，he4，妊娠相关蛋白，mmp-7，slpi，plau-r，muc-l,抑制素a和pai-1。15.权利要求l所述的方法，其中第一测定步骤的合并灵敏性至少约为85。/。并且其中第一测定步骤的特异性至少约为75%。16.权利要求l所述的方法，其中第二测定步骤的灵敏性至少约为80%并且其中第二测定步骤的特异性至少约为85%。17.权利要求l所述的方法，其中第一和第二测定步骤的合并灵敏性至少约为70°/。并且其中第一和第二测定步骤的特异性至少约为95%。18.权利要求l所述的方法，其中包括第一和第二测定步骤的联合筛选方法的阴性预测值(npv)至少约为99%。19.权利要求1所述的方法，其中ppv至少约为8%。20.权利要求l所述的方法，其中包括第一和第二测定步骤的联合筛选试验具有至少约为90%的灵敏性，至少约为98%的特异性，至少约为99.9°/。的npv和至少约为10°/。的ppv。21.权利要求l所述的方法，其中第一生物标记为he4且第二生物标记组选自包括ca125，妊娠相关蛋白，muc-l,pai-1和plau-r的组，包括ca125和pai-1的组，包括ca125，妊娠相关蛋白，pai-1和mmp-7的组，包括ca125，妊娠相关蛋白，pai-1和plau-r的组，包括ca125，妊娠相关蛋白，pai-1和plau-r的组，包括妊娠相关蛋白，muc-l，plau-r和抑制素a的组，包括ca125，muc-l,妊娠相关蛋白，pai-1和plau-r的组和包括ca125,mmp-7，妊娠相关蛋白和plau-r的组。22.权利要求l所述的方法，其中所述的筛选方法以自动化，半自动化或手工方式进行。23.权利要求l所述的方法，其中将第一和第二测定步骤作为单一试验或作为分开的试验进行，其中第一测定步骤构成第一试验，而其中第二测定步骤构成第二试验。24.鉴定患卵巢癌的可能性增加的患者的筛选方法，该方法包括a)检测身体样品中的多个生物标记的表达；和b)将数学模型应用于生物标记表达水平数据以便鉴定患卵巢癌的可能性增加的患者。25.权利要求24所述的方法，其中所述的数学模型选自用于选择最佳生物标记的对数逐步回归模型和用于选择生物标记的最佳截止点的受者作用特性(roc)曲线。26.权利要求24所述的方法，其中该方法用于检测早期卵巢癌。27.权利要求24所述的方法，其中所筛选的患者为无症状的并且具有卵巢癌家族史或指示发生卵巢癌高危险性的临床危险因素。28，权利要求24所述的方法，其中所述的筛选方法在绝经后女性患者群体中进行。29.权利要求24所述的方法，其中所述的身体样品为血液或血清样品。30.权利要求24所述的方法，其中所述的多个生物标记选自he4，ca125，妊娠相关蛋白，画p-7，muc-l，pai-1，cthrc1,抑制素a，plau-r,促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶。31.权利要求30所述的方法，其中所述的多个生物标记选自he4，ca125和妊娠相关蛋白。32.鉴定患卵巢癌的可能性增加的患者的单步筛选方法，该方法包括检测身体样品中至少三种生物标记的表达，所述的生物标记选自he4，ca125,妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-l,cthrc1，抑制素a，plau-r,促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶，其中生物标记中的至少一种的超表达预示该患者患卵巢癌的可能性增加。33.权利要求32所述的方法，其中选自he4,妊娠相关蛋白和ca125的生物标记中的至少一种的超表达预示该患者患卵巢癌的可能性增加。34.试剂盒，包括多个抗体，其中所述抗体各自与在卵巢癌中选择性超表达的不同生物标记蛋白特异性结合，其中所述的生物标记蛋白选自he4，ca125,妊娠相关蛋白，mmp-7，muc-l，pai-i，cthrc1，抑制素a，plau-r，促乳素，klk-io，klk-6，slpi和a-l抗胰蛋白酶。35.权利要求34所述的试剂盒，其中所述的生物标记蛋白选自ca125，he4,妊娠相关蛋白，固p-7，slpi，plau-r，muc-l，抑制素a和pai-1。36.权利要求34所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于检测抗体与所述生物标记蛋白结合的化学物质。37.用于进行权利要求1所述筛选方法作为单一试验的试剂盒，其中该试验包括第一和第二测定步骤。38.用于进行权利要求1所述方法的第一或第二测定步骤的试剂盒。全文摘要提供了鉴定具有卵巢癌可能性增加的患者的筛选方法。该筛选方法包括检测身体样品中多个生物标记的表达，其中所述生物标记的超表达表示患有卵巢癌的可能性增加。该筛选方法可以进一步包括两步分析。所关注的生物标记包括基因和蛋白质，例如，它们与dna复制/细胞周期控制中的缺陷，细胞生长和增殖，逃脱细胞凋亡，血管发生或淋巴生成或癌细胞运动性和侵入机制有关。在本发明的某些方面中，使用生物标记特异性抗体在蛋白质水平上或使用核酸杂交技术在核酸水平上检测生物标记的表达。本文进一步披露了检测患者卵巢癌的方法。进一步提供了用于实施本发明方法的试剂盒。文档编号g01n33/574gk101410715sq200780011459公开日2009年4月15日申请日期2007年1月29日优先权日2006年1月27日发明者c·m·怀特海德,d·p·马利诺夫斯基,j·w·格勒克,q·何,r·l·齐克,t·j·费希尔申请人:三路影像公司