fam3c的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及序列相似性蛋白家族3成员c(fam3c)的反义核苷酸的新用途，具体涉 及fam3c的反义核苷酸在制备抑制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用，属于肿瘤 生物治疗技术领域。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌的致死率位居所有妇科肿瘤的首位，是一种严重危害女性生命健康的疾 病。卵巢癌按照其来源不同分为：上皮性卵巢癌、性索间质性卵巢癌、生殖细胞性卵巢癌和 转移性卵巢癌，而上皮性卵巢癌是卵巢癌中最常见的类型，约占所有卵巢癌病例的90%。由 于卵巢癌早期缺乏明显的临床表现，因此往往被拖延，直至出现侵袭转移，发展为晚期才被 首次诊断。在临床，约75%的患者被确诊为卵巢癌晚期，尽管临床针对早期卵巢癌患者的治 疗效果尚可，但是对晚期患者的治疗效果则十分有限。
[0003] 肿瘤转移是引起临床肿瘤治疗失败和患者死亡的关键因素之一，在卵巢癌中，月中 瘤转移的意义更为突出。根据国际妇产联合会（figo)的分期标准，肿瘤的转移，尤其是在 腹腔中的转移，是卵巢癌发展进入晚期的标志之一。因此，侵袭转移极大地推进了卵巢癌发 展的进程，增加了肿瘤的恶性程度，降低肿瘤患者的生存期。因此，针对卵巢癌侵袭转移的 干预策略能够为临床治疗该肿瘤提供新思路。
[0004] 越来越多的研究显示，上皮-间质转化（emt)可以在多种肿瘤，包括上皮性卵巢癌 中促进肿瘤细胞的侵袭和转移，并且临床数据显示上皮-间质转化与卵巢癌患者的不良预 后有显著的关联。说明上皮-间质转化在卵巢癌中能够调节肿瘤的侵袭转移并发挥重要作 用。
[0005] 序列相似性蛋白家族3成员c (fam3c)在2006年首次被报道能够诱导鼠乳腺上皮 细胞发生上皮-间质转化，因此也被命名为白介素类似的上皮-间质转化诱导因子（ilei)。 有文献报道fam3c与结直肠癌的上皮-间质转化表型具有相关性，提示其在人类肿瘤中同 样是一个潜在的上皮-间质转化促进因子，但fam3c与卵巢癌的关系尚未见报道。人fam3c 基因位于染色体7q31，我们前期的研究表明，其在正常的卵巢组织中表达量很低，但在上皮 性卵巢癌尤其是转移灶中表达量明显升高，提示fam3c与卵巢癌的侵袭转移密切相关。
[0006] 目前临床针对上皮性卵巢癌的治疗采用包括手术切除或减瘤，辅以紫杉醇和铂类 药物的联合化疗等传统治疗方法，缺乏较强的特异性。针对肿瘤细胞的特点进行特异性治 疗，有的放矢，可以提高肿瘤治疗的敏感性和特异性。本发明发明人发现通过靶向基因沉默 fam3c基因的表达，可以反转卵巢癌中上皮-间质转化过程并抑制肿瘤细胞的迀移和侵袭 能力，是一种特异性的肿瘤生物治疗策略，可以为临床提供针对fam3c高表达的上皮性卵 巢癌侵袭转移治疗手段研发的基础。
【发明内容】
[0007] 目前，临床针对卵巢癌转移的治疗效果有限，因此提供一种靶向稳定沉默基因 fam3c的生物治疗策略，通过反义核苷酸序列沉默fam3c基因的表达，能够特异性地阻断上 皮性卵巢癌发生上皮-间质转化（emt)，进而抑制卵巢癌的侵袭和转移的进程。
[0008] 为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：
[0009] 本发明的技术方案针对上皮性卵巢癌，应用慢病毒转染反义核苷酸序列对肿瘤细 胞中fam3c基因进行靶向稳定沉默，有效抑制fam3c基因在rna和蛋白水平上的表达，从而 引起上皮-间质转化的逆转以及肿瘤细胞迀移和侵袭能力的下降。
[0010] 1.上皮性卵巢癌细胞的常规培养
[0011] 选择人上皮性卵巢癌细胞0vcar3作为研究对象，该细胞系购自美国标准生物品 收藏中心（atcc)，具有相对较高的fam3c基因的表达基础。
[0012] 2.应用反义核苷酸序列对fam3c基因进行靶向稳定沉默
[0013] 选择使用两条针对fam3c基因的不同的反义核苷酸序列以及其相应的对照序列 构建成的慢病毒质粒（购自广州复能基因有限公司）作为材料。
[0014] (1)人胚胎肾细胞293tn的常规培养；
[0015] (2)利用fam3c靶向反义核苷酸序列和对照序列的质粒进行慢病毒包裹；
[0016] 使用lenti_pac?hivexpressionpackagingkit(购自广州复能基因有限公司） 进行慢病毒的包裹；
[0017] (3)利用包裹好的慢病毒上清液分别感染上皮性卵巢癌0vcar3细胞；
[0018] (4)应用嘌呤霉素对感染后的0vcar3细胞进行药物筛选，获得稳定感染的细胞克 隆。
[0019] 3. fam3c稳定沉默后的表达情况检测
[0020] (1)利用半定量rt-pcr技术在rna水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和fam3c稳 定沉默后的两个实验组细胞克隆的基因沉默效果；
[0021] (2)利用western blot技术在蛋白水平检测稳定沉默后对照细胞克隆和fam3c稳 定沉默后的两个实验组细胞克隆的基因沉默效果。
[0022] 4.检测fam3c基因稳定沉默后对细胞emt过程的影响
[0023] 通过检测细胞中上皮以及间质细胞标志物的表达情况可以判断细胞上皮-间 质转化的进程。我们运用western blot的方法，选择上皮细胞标志物e-cadherin、 0ccludin(均购自santa cruz公司）和间质细胞标志物n-cadheriruvimentin(购自bd公 司）和twist (购自abcam公司），对这些分子的蛋白水平进行检测。
[0024] 5?检测fam3c基因稳定沉默后对细胞迀移能力和侵袭能力的影响
[0025] (1)运用划痕愈合实验（wound-healing)检测fam3c基因稳定沉默后的细胞克隆 相对于对照组克隆在迀移能力上的改变；
[0026] (2)运用人工基底膜侵袭实验检测fam3c基因稳定沉默后的细胞克隆相对于对照 组克隆在细胞侵袭能力上的改变；
[0027] 应用bdbiocoat?matrigel?invasionchamber(购自bd公司）进行人工基底膜 侵袭实验。
[0028] 以上方案可以有效地在上皮性卵巢癌细胞中靶向沉默fam3c，使其在细胞中rna 和蛋白水平的表达明显下降；在稳定沉默fam3c后，可以检测到肿瘤细胞发生了从间质细 胞形态到上皮细胞形态的转变，即上皮-间质转化的逆过程，并且显著地抑制了肿瘤细胞 的迀移和侵袭的能力。
[0029] 在此研究的基础上，本发明提供了序列相似性蛋白家族3成员c(fam3c)的反义 核苷酸的一种新的用途，即序列相似性蛋白家族3成员c(fam3c)的反义核苷酸在制备抑 制上皮性卵巢癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其中，所述的序列相似性蛋白家族3成员 c(fam3c)的序列如seqidn0:1 或seqidn0:2 所示。
[0030] 在本发明中，优选的，所述的上皮性卵巢细胞为上皮性卵巢癌0vcar3细胞。
[0031] 在本发明中，优选的，所述的药物是通过靶向沉默上皮性卵巢癌细胞中fam3c基 因的表达，特异性阻断上皮性卵巢癌细胞发生上皮-间质转化，进而达到抑制上皮性卵巢 癌细胞侵袭转移的目的。
[0032] 本发明取得的有益效果：
[0033] 本发明针对肿瘤转移在上皮性卵巢癌临床进程中的重要推进作用，提出了一种靶 向特异性抑制fam3c基因的生物治疗方法。通过使用反义核苷酸序列对上皮性卵巢癌细胞 中fam3c基因表达的靶向沉默，可以有效地阻断上皮性卵巢癌细胞的emt转化，并有效抑制 肿瘤细胞的迀移和侵袭能力，以实现在上皮性卵巢癌中有针对性地对肿瘤转移进行干预， 降低肿瘤的进展及恶性程度，提高患者的生存率及预后。
【附图说明】
[0034] 图1是用rt-pcr技术检测fam3c基因沉默后与对照组相比rna水平表达下降的 情况图；其中，shctrl :对照组，seql :反义核苷酸序列1，seq3 :反义核苷酸序列3 ;
[0035] 图2是用western blot技术检测fam3c基因沉默后与对照组相比蛋白水平表达 下降的情况图；其中，shctrl :对照组，seql :反义核苷酸序列1，seq3 :反义核苷酸序列3 ;
[0036] 图3是用western blot技术检测fam3c基因沉默后与对照组相比上皮、间质标志 物蛋白水平的表达改变图；其中，shctrl :对照组，seql :反义核苷酸序列l，seq3 :反义核苷 酸序列3;
[0037] 图4是对fam3c基因沉默后与对照细胞相比划痕实验的结果图（倒置相差显微镜 下观察拍摄的图片）；其中，其中，shctrl :对照组，seq3 :反义核苷酸序列3 ;
[0038] 图5是利用image j软件测量划痕实验的拍摄图片，以统计柱状图表示fam3c基 因沉默后与对照细胞相比，划痕覆盖百分比的情况图；其中，shctrl :对照组，seq3 :反义核 苷酸序列 3, * * * :p〈0. 001 ;
[0039] 图6是人工基底膜侵袭实验中fam3c基因沉默后与对照细胞相比，24小时后侵袭 的穿膜细胞的显微镜下拍摄图片；其中，shctrl :对照组，seql:反义核苷酸序列l，seq3:反 义核苷酸序列3;
[0040] 图7用统计柱状图表示人工基底膜侵袭实验中fam3c基因沉默后与对照细胞相 比，穿膜细胞的数量变化图；其中，shctrl :对照组，seql:反义核苷酸序列1，seq3:反义核 苷酸序列 3, * * * :p〈0. 001。
【具体实施方式】
[0041] 下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例 仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0042]试验例1
[0043] 1.上皮性卵巢癌肿瘤细胞的常规培养
[0044] 选择人上皮性卵巢癌细胞0vcar3作为研究对象，该细胞系购自美国标准生物品 收藏中心（atcc)，具有相对较高的fam3c基因的表达基础。在37 °c恒温孵箱中，5 % (：02浓 度的条件下，以含10%胎牛血清（fbs，购自paa公司）的rpmi-1640培养基进行培养。
[0045] 2.应用反义核苷酸序列对fam3c基因进行靶向稳定沉默
[0046] 使用的fam3c基因沉默shrna克隆质粒中包含的两条反义核苷酸序列如下：
[0047] seql:gatgtggcaccatttattg(seqid n0:1 所示）；
[0048] seq3 :atggagcaaccaaactcaa(seq id n0:2 所示）。
[0049] (1)人胚胎肾细胞293tn的常规培养
[0050] 在37°c恒温孵箱中，5% 0)2浓度的条件下，以含10%胎牛血清（fbs，购自paa公 司）的dmem培养基进行培养。
[0051] (2)利用fam3c靶向反义核苷酸序列和对照序列的质粒进行慢病毒包裹