一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及分子生物学和基因工程。
【背景技术】
[0002]上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer, e0c)约占卵巢癌的90%，是女性生殖器常见肿瘤，其发病率在妇科恶性肿瘤中仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，但死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。关于卵巢癌的发生机制，有报道认为是由于排卵后的炎症和/或损伤修复，以及在修复过程中所产生的干细胞异常增殖，但是目前尚无定论。因此，探明卵巢癌发生的起因，针对病因进行有针对性治疗，尤其抑制eoc的生长和转移，进而清除eoc以及eoc肿瘤干细胞(cancer stem cells，cscs)，才能从根本上治愈卵巢癌。
[0003]目前针对卵巢癌的常规治疗是手术切除，辅以顺铂/紫杉醇化疗，该治疗方案在原发卵巢癌患者的完全缓解率可达70%，然而大部分患者在18个月内复发，残存的癌细胞对化疗药转为耐受型细胞，现有的治疗方案尚不能达到有效缓解的治疗效果。可见，卵巢癌已成为女性恶性肿瘤中的“无声杀手”，对妇女生命造成严重威胁。
[0004]干细胞是一类具有自我复制、更新功能和多向分化潜能的原始未分化细胞，分为胚胎干细胞、生殖干细胞和成体干细胞。而cscs是指肿瘤组织中具有高致瘤性、自我更新及分化能力等干细胞性质的癌细胞亚群，是形成不同分化程度的肿瘤细胞和肿瘤不断增殖的根源。cscs学说主要为肿瘤细胞间存在异质性，其中一小群具有自我更新、无限增殖能力和不定分化潜能，是肿瘤形成的起始细胞并维持肿瘤的生长；cscs对放疗、化疗不敏感，可能是肿瘤转移、复发的根源。针对cscs的靶向治疗，消灭肿瘤的“种子”细胞即cscs，只有这样方能取得较理想的疗效。
[0005]用cscs制备成以肿瘤干细胞(tsc)瘤苗可以诱导针对cscs的特异性抗肿瘤免疫应答。有研究者应用乙醛脱氢酶(aldh)作为tsc标记，从小鼠黑色素瘤d5细胞系和鳞癌scc7细胞系中分选出富含tsc的细胞群，制备成细胞裂解物，负载dcs后，作为肿瘤疫苗，分别免疫相应的c57bl/6小鼠和c3h小鼠。相较应用未经分选的全细胞裂解物负载dcs作为肿瘤疫苗接种的小鼠，前一方法在两种肿瘤模型中均诱导出了更为明显的肿瘤特异性体液和细胞免疫反应，并且其脾细胞产生的ifn-γ和gm-csf较后一方案更高。还有学者研发出cd133特异性表位疫苗，cd133是多形性胶质母细胞瘤tsc的分子标志，该分子的两个hla 限制性表位 ilsafsvyv(cd133-405)和 ylqwiefsi (cd133-753)能结合 hla_a*0201 分子。以⑶133-405或⑶133-753短肽负载dcs作为肿瘤疫苗，诱导产生的特异性⑶8 ctl能够识别并裂解cd133 hla-a*0201 ( )的多形性胶质母细胞瘤tsc。该项研究成果支持应用cd133特异性表位疫苗靶向tsc，用以防治多形性胶质母细胞瘤。
[0006]本发明以⑶117及⑶44为eoc cscs的特异性标记筛选出cscs进行卵巢癌干细胞疫苗研究。因cd117是由c-kit原癌基因编码的跨膜蛋白受体，其配体为干细胞生长因子(stem cell growth factor, scf) 0 scf是重要的造血生长因子，scf-cd117相互作用可刺激造血干/祖细胞的增殖和分化，对肿瘤细胞可能有刺激生长作用。cd44分子是一种细胞表面的跨膜糖蛋白，属于黏附分子，广泛分布于造血系统、上皮系统、内皮系统和中胚层来源的细胞上。研究表明，cd44与肿瘤的增殖、迀移、侵袭和肿瘤相关的血管生成密切相关，并且⑶44基因是cscs表型的重要标志物之一。⑶44分为两类:仅由组成型外显子编码而成，称为标准型cd44，广泛存在于各组织内，与透明质酸结合，参与细胞及细胞与基质间的黏附作用过程，对肿瘤侵袭转移发挥重要作用；由含有v区变异型外显子编码而成cd44分子，称变异型cd44，cd44变构体表达水平的变化与肿瘤细胞侵袭转移密切相关。cd44蛋白参与细胞间的黏附、淋巴细胞的活化、介导淋巴细胞归巢或再循环及细胞的运动、细胞内外的信号传导及凋亡等生理过程。
【发明内容】
[0007]本发明要解决的技术问题是提供一种卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法。
[0008]为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种卵巢癌干细胞疫苗的制备方法，其特征在于，
[0009](i)获取准备卵巢癌细胞，进行传代培养，以10%胎牛血清的rpmi1640为培养基，37°c、5% 0)2饱和湿度条件下培养。细胞长至一定密度，胰酶消化吹散后，继续传代培养；
[0010](2)取免疫磁珠分选macs缓冲液悬浮卵巢癌细胞?’每i x 17?i x 10 8卵巢癌细胞，加入100 μ i fcr阻断剂，混匀后4°c孵育30min ；
[0011](3)每ix 17?i x 10 8细卵巢癌胞，加入⑶44 磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4°c孵育一段时间，之后加pbs洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复pbs洗涤2-4次；
[0012](4)取免疫磁珠分选macs用缓冲液悬浮卵巢癌细胞，
[0013](5)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入步骤(4)的细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞(cd44-卵巢癌细胞)；
[0014](6)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞(cd44 卵巢癌细胞)；
[0015](7)取免疫磁珠分选macs用缓冲液悬浮分选步骤(6)得到的⑶44 卵巢癌细胞，过夜培养48h ;
[0016](8)每ix 17?ix 10 8细胞，加入100 μ i fcr阻断剂，混匀后4°c孵育30min ;
[0017](9)每i x 17?i x 108细胞，加入cd 117 磁珠标记的直标单克隆抗体，混匀后4 v孵育一段时间，之后加pbs洗涤后离心，弃上清，将细胞沉淀重复pbs洗涤2-4次；
[0018](10)取免疫磁珠分选macs用缓冲液悬浮卵巢癌细胞；
[0019](11)把分离柱放入磁场中，加入缓冲液平衡分离柱后；加入细胞悬液，稍后加入缓冲液冲洗收集阴性细胞(cdl 17-卵巢癌细胞)；
[0020](12)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞；
[0021](13)将分离柱移出磁场，放于一个合适的收集试管上，用少量缓冲液匀速冲洗，收集阳性细胞⑶117 卵巢癌细胞，即为⑶117 ⑶44 卵巢癌细胞；
[0022](14)培养至细胞状态稳定，48h内制备卵巢癌干细胞疫苗。
[0023]根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下:将cd117 cd44 卵巢癌干细胞用mit，2 μ g/ml处理20-30h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。
[0024]根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下:将cd117 cd44 卵巢癌干细胞用50 μ g/ml丝裂霉素c处理10-15h，灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。
[0025]根据本发明的优选技术方案，所述步骤(14)具体如下:将cd117 cd44 卵巢癌干细胞用放射线灭活后作为卵巢癌干细胞疫苗。
[0026]根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞来自人。
[0027]根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞选自sk0v3细胞系或h08910细胞系。
[0028]本发明的第二方面提供一种前述方法制备得到的卵巢癌干细胞疫苗。
[0029]根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞来自人。
[0030]根据本发明的优选技术方案，所述的卵巢癌干细胞系选自sk0v3细胞系或h08910细胞系。
[0031]本发明的第三方面提供一种前述卵巢癌干细胞疫苗在制备治疗卵巢癌症药物中的应用。
[0032]优选地，卵巢癌干细胞疫苗在制备治疗上皮性卵巢癌症药物中的应用。
[0033]本发明的卵巢癌细胞来源包括:手术切除来源的自体肿瘤组织、切检的自体肿瘤转移淋巴结、粗针穿刺活检来源的自体肿瘤组织、癌性腹水中的肿瘤细胞。卵巢癌干细胞来源还包括来源于异体的卵巢癌细胞系和/或细胞株。
[0034]本发明中⑶117 ⑶44 卵巢癌干细胞疫苗在动物实验中能够提高血清ifn- γ水平，下调tgf- β的表达，增强nk细胞活性，显著降低⑶117 ⑶44 卵巢癌干细胞数量，抑制肿瘤的生长。本发明中cd117 cd44 sk0v3细胞少量细胞致瘤实验及无血清培养成球实验结果，说明⑶117 ⑶44 sk0v3细胞具有cscs的高致瘤性、自我更新及分化能力特性。
【附图说明】
[0035]图1是裸鼠卵巢癌模型中的⑶117 ⑶44 干细胞疫苗的活性对比。图1a为不同疫苗组小鼠接种sk0v3致瘤后47天后麻醉处死检测各组肿瘤大体标本，最长径线多20mm ;图1b为裸鼠致瘤后，各组肿瘤体积变化情况；图1c为各组裸鼠接种sk0v3细胞后，无瘤生存时间曲线。