b2m在作为卵巢癌治疗靶点中的应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，涉及b2m在作为卵巢癌治疗靶点中的 应用。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌 而列居第三位。其病因不明确，可能与以下几个方面有关:癌症发病外部因素(包括化学、物 理、生物等致癌因子），癌症发病内部因素(包括免疫功能、内分泌、遗传、精神因素等），以及 饮食营养失调和不良生活习惯等。多发生于围绝经期的妇女。35岁以上者多发卵巢上皮性 癌，而青年及幼年女性多为生殖细胞类恶性肿瘤。
[0003] beta-2-微球蛋白（b2m，beta-2-microglobulin)是主要组织相容性复合体mhci 类分子的轻链，它与重链(α-chain)以非共价键连接，位于几乎所有有核细胞的细胞膜上。 另外，它还有游离形式，可以与膜上b2m相互转换。游离型b2m在多种肿瘤中被检测到，包括 乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌、口腔癌、前列腺癌和睾丸癌，并且与肿瘤细胞的免疫逃逸和 肿瘤的免疫治疗相关。
[0004] sirna，即小干扰rna(smal1interferingrna)，有时也称短干扰rna(short interferingrna)或沉默rna(silencingrna)，是一段长度为20-25个核苷酸的双链rna分 子。它主要通过与特定基因的mrna碱基形成特异性结合并使之降解，从而抑制该基因的表 达(geneknock-down)。近年来，由于sirna以其在极低浓度下特异性的高效作用，它已经成 为在哺乳动物细胞中抑制特定基因表达的有力工具，也越来越多地应用于哺乳动物神经系 统基因功能的研究。
[0005] 目前b2m在卵巢癌中的相关研究非常少，也没有b2m抑制肿瘤细胞迀移、侵袭的报 道，同时尚未见使用sirna高效抑制b2m表达而显著抑制卵巢癌细胞增殖等能力的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供b2m在作为卵巢癌治疗靶点中的应 用。
[0007]在本发明的第一方面，提供了b2m基因或蛋白的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物 中的应用。
[0008] 所述的抑制剂选自以b2m蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制b2m蛋白表达或基 因转录的小干扰1?嫩、(1成熟、此1?财、微小1?嫩、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰1?财、 dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。
[0009] 作为本发明的一个优选例，所述的抑制剂是序列如seqidn0.3和seqidn0.4所 示的sirna。
[0010] 在本发明的第二方面，提供了b2m基因或蛋白的抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞株 增殖、迀移或侵袭的试剂中的应用。
[0011]作为本发明的一个优选例，所述的卵巢癌细胞株为0vcar-3或sk-ov-3。
[0012]所述的抑制剂选自以b2m蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制b2m蛋白表达或基 因转录的小干扰1?嫩、(1成熟、此1?财、微小1?嫩、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰1?财、 dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。
[0013]作为本发明的一个优选例，所述的抑制剂是序列如seqidn0.3和seqidn0.4所 示的sirna。
[0014] 在本发明的第三方面，提供了一种治疗卵巢癌的sirna分子，所述的sirna分子序 列如seqidn0.3和seqidn0.4所示。
[0015]本发明优点在于：
[0016] 1、本发明发现敲低b2m后可显著抑制卵巢癌细胞株的增殖、迀移和侵袭，表明针对 卵巢癌b2m高表达的病人给予降低b2m的处理存在潜在的治疗效果，证实了b2m是一种潜在 的治疗卵巢癌的新型靶点，具有很大的临床应用价值。
[0017] 2、本发明设计了可显著敲低b2m表达的sirna分子，取得了预料不到的技术效果。
【附图说明】
[0018]图1.sirna的敲除效果检测。a. 0vcar-3中的敲除效果检测;b.sk-0v-3中的敲除效 果检测。
[0019 ] 图2 ·b2m对卵巢癌细胞株增殖的影响。a和c: 0vcar-3;b和d:sk-0v-3。**ρ〈0 · 01。
[0020]图3.b2m对卵巢癌细胞株迀移和侵袭能力的影响。a和b，细胞划痕实验；c和d， transwell侵袭实验。*p〈0 · 05。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0022]如本文所用，所述的"b2m抑制剂"包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要 它们能够下调b2m的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子 可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是抑制b2m表达的病毒产品。
[0023] 所述的b2m抑制剂是指任何可降低b2m的活性、降低b2m的稳定性、下调b2m的表达、 减少b2m有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调b2m有用的物质。例 如，所述的抑制剂是:核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调b2m 的表达。
[0024] 实施例1b2m_sirna序列的筛选
[0025]为了得到好的b2m敲除效果，我们基于丰富的经验设计并合成了两条目的序列 (sir-l、sir-2)及一条阴性对照序列(一段无意义序列的sirna，c-sir)，并用它们分别转染 处理细胞，提样后用western-blot检测敲除效果。具体地，将上皮性卵巢癌细胞株0vcar-3 和sk-0v-3接种在6孔板中，24小时后分别以2微克/孔(0vcar-3)和1.5微克/孔(sk-0v-3)量 的sir-ι或sir-2通过x-tremegenesirna(roche公司）转染试剂转入细胞中，在rpmi-1640 (0vcar-3)或dmem(sk-0v-3)培养液（invitrogen公司）中培养（37°c，5 %⑶2) 24小时后提 样，用western-blot检测敲除结果。结果见图1，可见sir-ι敲除效果显著优于sir-2，在 (^^1?-3中811?-1和811?-2的敲除效率分别为75.96%和21.75%，在51(-0￥-3中811?-1和811?-2 的敲除效率分别为72.35 %和52.45 %。后续研究选择sir-1作进一步的研究。所用的sirna序列如下表所示。
[0027]注:合成sirna序列时在每个序列3 '末端加"tt"作为保护碱基。
[0028]实施例2b2m对卵巢癌细胞株增殖的影响
[0029] 在卵巢癌细胞株0vcar-3和sk-0v-3中，检测敲低b2m后对卵巢癌细胞增殖的影响。 所使用的b2m-sirna序列为sir-ι。空白组不做处理(blank)，对照组空转等量无意义序列 sirna(c-sir)，实验组用b2m-sirna干预卵巢癌细胞株(b2m-sir)，用量及细胞培养条件同 上。经western-blot验证敲除效率，wst-1法(roche公司）检测增殖效率，用酶标仪分别在0、 24、48小时检测450nm的吸光度。
[0030]结果见图2,可见敲低b2m后可显著抑制卵巢癌细胞的增殖。
[0031]实施例3b2m对卵巢癌细胞株迀移能力的影响(细胞划痕实验）
[0032] 将sk-0v-3细胞铺于六孔板中，待密度至80%左右，用200μ1无菌枪头在孔中央划 一直线，磷酸缓冲液(pbs)洗2次，用sirna干预细胞，分组及用量同上，4小时后换新鲜培养 基，继续培养并分别于〇、24、48、72小时拍照，实验重复三次并做统计分析。
[0033]图3中a是划痕后各时间点的拍照图片；图3中b是测量三处划痕距离取平均值进行 作图。b2m-sirna组细胞划痕间距在各时间点均显示比空白对照(blank)组和无意义序列对 照(c-s ir)组的间距大，表示b2m-s irna组细胞迀移能力较blank组和c-s ir组细胞低。
[0034]实施例4b2m对卵巢癌细胞株侵袭能力的影响(transwell侵袭实验）
[0035] 上室加入80μ1 浓度为250yg/ml的matrigel(dbbiosciences公司），放37度静置4 小时，吸弃上清析出液。sk-0v-3细胞用无血清dmem混悬，计数后按10000个/200μ1加入上 室，下室加入600μ1含10%胎牛血清的dmem，48小时后取出上室，pbs洗3遍，4%多聚甲醛固 定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，pbs洗3遍，用棉签轻轻擦掉上室的细胞，显微镜下计数穿过 小室的侵袭细胞，重复3次并做统计分析。
[0036] 图3中c是穿过小室的细胞拍照图片；图3中d是分别计数3个视野细胞数取平均值 做图。结果表明b2m-s irna组细胞侵袭能力较blank组和c-s ir组细胞弱。
[0037]综上所述，敲低b2m后可显著抑制卵巢癌细胞株的增殖、迀移和侵袭，表明针对卵 巢癌b2m高表达的病人给予降低b2m的处理存在潜在的治疗效果。所以b2m是一种潜在的治 疗卵巢癌的新型靶点，具有很大的临床应用价值。
[0038]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1.b2m基因或蛋白的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自以b2m蛋白或其转录本 为靶序列、且能够抑制b2m蛋白表达或基因转录的小干扰1?祖、(181?嫩、8111?祖、微小1?嫩、反义 核酸;或能表达或形成所述小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂是序列如seqidno.3和seq id从).4所示的8丨1?嫩。 4.b2m基因或蛋白的抑制剂在制备抑制卵巢癌细胞株增殖、迀移或侵袭的试剂中的应 用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的卵巢癌细胞株为0vcar-3或sk-0v-3〇6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂选自以b2m蛋白或其转录本 为靶序列、且能够抑制b2m蛋白表达或基因转录的小干扰1?祖、(181?嫩、8111?祖、微小1?嫩、反义 核酸;或能表达或形成所述小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂是序列如seqidno.3和seq id从).4所示的8丨1?嫩。8. -种治疗卵巢癌的sirna分子，其特征在于，所述的sirna分子序列如seqidno.3和 seqidno.4所示。
【专利摘要】本发明涉及b2m在作为卵巢癌治疗靶点中的应用。本发明设计了可显著敲低b2m表达的sirna分子，并进一步通过实验发现敲低b2m后可显著抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，表明针对卵巢癌b2m高表达的病人给予降低b2m的处理存在潜在的治疗效果，证实了b2m是一种潜在的治疗卵巢癌的新型靶点，具有很大的临床应用价值。
【ipc分类】a61k48/00, a61p35/00, a61k45/00, a61k31/7088
【公开号】cn105457030
【申请号】cn201610083715
【发明人】许国雄, 孙文文
【申请人】复旦大学附属金山医院
【公开日】2016年4月6日
【申请日】2016年2月6日