1.本文披露了白介素15(il15)构建体以及用于治疗癌症的使用方法。
背景技术：
2.il15是一种细胞因子，最初描述为t细胞生长因子。细胞因子属于四种α-螺旋束家族，并且其受体由两种负责信号转导的亚单位(il-2r/il-15rβ和γ链)组成。这些受体在例如激活的t细胞(并且可用皮摩尔浓度的il15激活)上表达。
3.作为治疗剂，il15表现出激活t细胞、特别是cd8 t细胞的潜力，但是由于分子半衰期短并且清除速度快，在专利给药方面存在问题。目前，虽然正在进行多项临床试验，但重组il-15还没有被批准使用。
4.因此，本领域对提供il15构建体存在未满足的需求，这些构建体能够以提供卓越分子递送的方式直接将il15递送至肿瘤微环境。
技术实现要素：
5.本披露涉及il15构建体。在一个实施例中，il15构建体为二价同源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)白介素2受体β(il2rb)结构域；和f)igg1 fc区，其中该二价il15构建体包含：(i)示于seq id no:4(m123)的同源二聚体；(ii)示于seq id no:5(m135)的同源二聚体；(iii)示于seq id no:6(m140)的同源二聚体；(iv)示于seq id no:7(m145)的同源二聚体；(v)示于seq id no:8(m175)的同源二聚体；(vi)示于seq id no:9(m176)的同源二聚体；(vii)示于seq id no:10(m177)的同源二聚体；(viii)示于seq id no:11(m178)的同源二聚体；(ix)示于seq id no:12(m207)的同源二聚体；(x)示于seq id no:13(m231)的同源二聚体；(xi)示于seq id no:14(m233)的同源二聚体；(xii)示于seq id no:15(m234)的同源二聚体；(xiii)示于seq id no:16(m238)的同源二聚体；(xiv)示于seq id no:17(m239)的同源二聚体；
(xv)示于seq id no:18(m240)的同源二聚体；(xvi)示于seq id no:19(m241)的同源二聚体；(xvii)示于seq id no:20(m243)的同源二聚体；(xviii)示于seq id no:21(m244)的同源二聚体；(xix)示于seq id no:22(m245)的同源二聚体；(xx)示于seq id no:23(m246)的同源二聚体；(xxi)示于seq id no:24(m247)的同源二聚体；(xxii)示于seq id no:25(m248)的同源二聚体；(xxiii)示于seq id no:26(m249)的同源二聚体；(xxiv)示于seq id no:27(m327)的同源二聚体；(xxv)示于seq id no:28(m328)的同源二聚体；(xxvi)示于seq id no:29(m329)的同源二聚体；(xxvii)示于seq id no:30(m330)的同源二聚体；(xxviii)示于seq id no:31(m331)的同源二聚体；或(xxix)示于seq id no:32(m332)的同源二聚体。
6.一种二价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，该结构域包含第一分子和第二分子，其从n-末端至c-末端包含：x)il15受体α(il15ra)结构域；和y)igg1 fc区，其中该异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:33(m43)的第一分子和示于seq id no:34(m24)的第二分子；(ii)示于seq id no:35(m61)的第一分子和示于seq id no:36(m60)的第二分子；或(iii)示于seq id no:37(m62)的第一分子和示于seq id no:38(m60)的第二分子。
7.一种二价同源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的可裂解的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域；和f)igg1 fc区，其中该二价il15构建体包含：(i)示于seq id no:40(m148)和seq id no:41(m174)的同源二聚体。
8.一种二价同源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)igg1 fc区，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；
d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；f)第三接头(l3)，连接至；g)il15结构域；并且其中该二价il15构建体包含：(i)示于seq id no:42(m232)的同源二聚体；(ii)示于seq id no:43(m1001)的同源二聚体；(iii)示于seq id no:44(m1002)的同源二聚体；(vi)示于seq id no:45(m1003)的同源二聚体；(v)示于seq id no:46(m1004)的同源二聚体；(vi)示于seq id no:47(m1005)的同源二聚体；或(vii)示于seq id no:48(m1006)的同源二聚体。
9.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)白介素2受体β(il2rb)结构域；和f)第一igg1 fc区，作为第一分子和第二分子，包含第二igg1 fc区，其中该异源二聚体il15构建体包含：示于seq id no:49(mk107)的第一分子和示于seq id no:50(mh2)的第二分子。
10.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)第一igg1 fc区，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；f)第三接头(l3)，连接至；g)il15结构域；作为第一分子和第二分子，包含第二igg1 fc区，其中该一价异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:63(m111)的第一分子和示于seq id no:64(mh2)的第二分子；(ii)示于seq id no:65(m2001)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；或(iii)示于seq id no:66(m2002)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子。
11.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；
b)第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；f)第三接头(l3)，连接至；g)第一igg1 fc区，作为第一分子和第二分子，包含第二igg1 fc区，其中该异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:51(mk114)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(ii)示于seq id no:53(mk115)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(iii)示于seq id no:54(mk117)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(iv)示于seq id no:55(mk118)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(v)示于seq id no:56(mk119)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(vi)示于seq id no:57(mk120)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(vii)示于seq id no:58(mk121)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(viii)示于seq id no:59(mk123)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(ix)示于seq id no:60(mk124)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(x)示于seq id no:61(mk125)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xi)示于seq id no:62(mk126)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xii)示于seq id no:67(mk136)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xiii)示于seq id no:68(mk137)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xiv)示于seq id no:69(mk138)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xv)示于seq id no:70(mk139)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xvi)示于seq id no:71(mk140)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分
子；(xvii)示于seq id no:72(mk141)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xviii)示于seq id no:73(mk146)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xix)示于seq id no:74(mk145)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xx)示于seq id no:76(mk149)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxi)示于seq id no:77(mk150)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxii)示于seq id no:78(mk151)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxiii)示于seq id no:79(mk152)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxiv)示于seq id no:80(mk153)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxv)示于seq id no:81(mk154)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；(xxvi)示于seq id no:82(mk155)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(xxvii)示于seq id no:172(mk157)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子。
12.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)第一igg1 fc区，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15结构域；作为第一分子和第二分子，包含：x)第二igg1 fc区；y)接头(l3)，连接至；z)白介素2受体β(il2rb)结构域；其中该一价异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:83(m109)和示于seq id no:84(mh110)的异源二聚体；(ii)示于seq id no:85(m2003)和示于seq id no:86(mh2004)的异源二聚体；或(iii)示于seq id no:87(m2003)和示于seq id no:88(mh2005)的异源二聚体。
13.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)第一igg1 fc区，连接至；
b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域；作为第一分子和第二分子，包含：x)第二igg1 fc区；y)接头(l3)，连接至；z)白介素2受体β(il2rb)结构域；其中该一价异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:89(m005)和示于seq id no:90(mk5)的异源二聚体；或(ii)示于seq id no:91(m2006)和示于seq id no:90(mk5)的异源二聚体。
14.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；第一igg1 fc区；作为第一分子和第二分子，包含：x)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；y)接头(l3)，连接至；z)第二igg1 fc区，其中该一价异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:92(m006)和示于seq id no:93(mk6)的异源二聚体；或(ii)示于seq id no:94(m2007)和示于seq id no:93(mk6)的异源二聚体。
15.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域和；d)第一igg1 fc区；作为第一分子和第二分子，包含：x)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；y)接头(l3)，连接至；z)第二igg1 fc区，其中该一价异源二聚体il15构建体包含示于seq id no:95(m108)的第一分子和示于seq id no:96(mh4)的第二分子。
16.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)第一igg1 fc区，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；
d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)白介素2受体β(il2rb)结构域；作为第一分子和第二分子，包含：x)第二igg1 fc区，连接至；y)接头(l3)，连接至；z)il15受体α(il15ra)结构域，其中该一价异源二聚体il15构建体包含：示于seq id no:97(m112)的第一分子和示于seq id no:98(mk113)的第二分子。
17.一种二价同源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)具有第一igg1 fc区的肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域；f)il15结构域；其中该二价同源二聚体il15构建体包含示于seq id no:99(m001)的序列和示于seq id no:100(mh333lc)的序列。
18.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)具有第一igg1 fc区的肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；d)包含蛋白酶可激活部分的第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域，连接至第三接头，连接至；和f)il15结构域；其中该一价异源二聚体il15构建体包含示于seq id no:101(m002)的序列、示于seq id no:102(mh2)的序列和示于seq id no:100(mh333lc)的序列。
19.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)具有第一igg1 fc区的肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15结构域；其中该一价异源二聚体il15构建体包含示于seq id no:103(mk3)的序列，和x)包含第二igg1 fc区的肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；y)第一接头(l3)，连接至；z)白介素2受体β(il2rb)结构域，其中该序列示于seq id no:104(mh3)以及示于seq id no:100(mh333lc)。
20.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)具有第一igg1 fc区的第一肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；
b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15受体α(il15ra)结构域，其中该一价异源二聚体il15构建体包含示于seq id no:105(mk4)的序列，和x)具有第二igg1 fc区的第一肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；y)第一接头(l3)，示于；z)白介素2受体β(il2rb)结构域，其中该序列示于seq id no:106(mh3)以及示于seq id no:100(mh333lc)。
21.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；b)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；c)il15结构域；作为第一分子；和第二分子，包含x)il15受体α(il15ra)结构域；和y)第一igg1 fc区，以及第三分子，包含第二igg1 fc区，其中该异源二聚体il15构建体包含：示于seq id no:107(mk143)的第一分子、示于seq id no:108(mk144)的第二分子和示于seq id no:52(h7)的第三分子。
22.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)第一igg1 fc区，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15结构域；f)包含蛋白酶可激活部分的第三接头(l3)，连接至；g)白介素2受体β(il2rb)结构域；作为第一分子和第二分子，包含第二igg1 fc区，其中该一价异源二聚体il15构建体包含：(i)示于seq id no:109(mk142)的第一分子和示于seq id no:52(mh7)的第二分子；(ii)示于seq id no:173(mk156)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子；或(iii)示于seq id no:174(mk165)的第一分子和示于seq id no:75(mh8)的第二分子。
23.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)作为第一分子的il15受体α(il15ra)结构域，经由二硫键连接至；b)il15结构域，连接至；
c)包含蛋白酶可激活部分的第一接头(l1)，连接至；d)白介素2受体β(il2rb)结构域，连接至；e)第二接头(l2)，连接至f)第一igg1 fc区，以及第三分子，包含第二igg1 fc区，其中该异源二聚体il15构建体包含：示于seq id no:110(mk147)的第一分子、和示于seq id no:111(mk148)的第二分子、和示于seq id no:52(mh7)的第三分子。
24.一种一价异源二聚体白介素15(il15)构建体，该构建体从n-末端至c-末端包含：a)具有第一igg1 fc区的肿瘤相关抗原(taa)结合抗体，连接至；b)第一接头(l1)，连接至；c)il15受体α(il15ra)结构域，连接至；d)第二接头(l2)，连接至；e)il15结构域，连接至；f)包含蛋白酶可激活部分的第三接头(l3)，连接至；g)白介素2受体β(il2rb)结构域；和其中该一价异源二聚体il15构建体包含seq id no:175(mk14)中所示的序列、seq id no:102(mh2)中所示的序列和seq id no:100(mh333lc)中所示的序列。
25.一种药物组合物，该药物组合物包含与至少一种另外的il15构建体组合的il15构建体。
26.一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用有效量的il15构建体
27.该方法，其中该癌症是胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
28.该方法，其中将该il15构建体与另一种治疗剂组合施用。
29.该方法，其中该治疗剂为免疫检查点剂。
30.该方法，其中该免疫检查点剂为pd-1、pd-l1、pd-l2、tim3、lag-3、ox40或tigit抗体。
31.一种增加免疫细胞的存活的方法，该方法包括在向患者施用有效量的免疫细胞之前、期间或之后，施用il-15构建体。
32.在所述方法中所述免疫细胞表达嵌合抗原受体(car)。
33.在所述方法中所述免疫细胞是nk细胞。
34.在所述方法中所述免疫细胞是t细胞。
附图说明
35.图1示出了二价il15构建体a。
36.图2示出了二价il15构建体b。
37.图3示出了二价il15构建体c。
38.图4示出了二价il15构建体d。
39.图5示出了一价构建体e1和e2。
40.图6示出了一价构建体e3。
41.图7示出了一价构建体f1、f2和f3。
42.图8示出了一价构建体g1和g2。
43.图9示出了双价构建体h1和一价构建体h2。
44.图10示出了一价构建体k1和k2。
45.图11示出了一价构建体m。
46.图12示出了一价构建体n。
47.图13示出了一价构建体p。
48.图14示出了一价构建体q。
49.图15-25示出了基于细胞的pstat5激活测定的结果。
50.图26显示il15构建体在细胞增殖测定中具有活性。
51.图27a-27c示出了用于il15构建体的最大耐受剂量的图形给药方案(图27a)、用il15构建体处理的小鼠的存活曲线(图27b)以及小鼠的体重变化(图27c)。
52.、图28a-28b示出了在最大耐受剂量水平下，依据相关il-15浓度，icr小鼠中mk137/mh7的cmax和暴露比p22339高53倍和98倍。
53.图29a-29b显示mk137/mh7对于外周血细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(tils)的剂量依赖性药效动力学作用。
54.图30和图31显示mk137/mh7在ht29/hh异种移植小鼠模型中的pd/pk特性，其中mk137/mh7表现出更大的治疗窗。定义
55.除非在本文件的其他地方具体定义，否则本文所用的所有其他技术和科学术语具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。
56.如本文所用，包括所附权利要求，除非上下文另外明确说明，否则如“一个”、“一种”和“该”的单数形式包括它们相应的复数指代。
57.除非上下文另外明确说明，否则术语“或”意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
58.如本文所用的术语“抗癌剂”是指可用于治疗细胞增殖性障碍(如癌症)的任何药剂，包括但不限于细胞毒性剂、化学治疗剂、放射疗法和放射治疗剂、靶向性抗癌剂、和免疫治疗剂。
59.术语“白介素-15”或“il15”为刺激t淋巴细胞增殖的细胞因子。人il15的氨基酸序列(seq id no:1)也可在登录号x94223中找到。seq id no:1mriskphlrsisiqcylclllnshflteagihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints
60.术语“白介素-15受体α”或“il15ra”为il15的高亲和力受体。il15ra的氨基酸序列(seq id no:2)也可在登录号cr542023中找到。seq id no:2maprrargcrtlglpalllllllrppatrgitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvtpqpeslspsgkepaasspssnntaattaai
示例性氨基酸取代示例性氨基酸取代
67.如本文所用的术语“杵臼(knob-into-hole)”技术是指氨基酸在体外或体内通过在它们相互作用的界面上将空间突起(杵)引入一个多肽并将穴袋或空腔(臼)引入另一个多肽从而引导将两条多肽配对在一起。例如，杵臼已经被引入了抗体的fc:fc结合界面、cl:chi界面、或vh/vl界面(参见，例如，us 2011/0287009、us 2007/0178552、wo 96/027011、wo 98/050431、和zhu等人,1997,protein science[蛋白质科学]6:781-788)。在一些实施例中，杵臼确保了特异性il15构建体表达期间两个不同重链正确配对在一起。例如，在其fc区具有杵臼氨基酸的il15构建体可以进一步包含il15构建体的第一分子和il15构建体的第二分子，其中这两种分子至少部分地通过杵臼相互作用来组装。
[0068]
如本文在“杵臼”技术的上下文中所用的术语“杵”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入突起(杵)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有臼突变。
[0069]
如本文在“杵臼”的上下文中所用的术语“臼”是指向多肽在该多肽与另一多肽相互作用的界面处引入穴袋或空腔(臼)的氨基酸改变。在一些实施例中，另一多肽具有杵突
变。
[0070]
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的实例为blast算法，其分别描述于altschul等人,nuc.acids res.[核酸研究]25:3389-3402,1977；和altschul等人,j.mol.biol.[分子生物学杂志]215:403-410,1990。用于进行blast分析的软件可通过国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)披露获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中短字长w鉴定高得分序列对(hsp)，当与数据库序列中相同字长比对时，其匹配或满足一些正值阈值得分t。t被称为邻域字得分阈值。这些初始邻域字命中作为开始搜索以找到包含它们的较长hsp的值。字命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励得分；始终》0)和n(错配残基的罚分；始终《0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用得分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，将停止字命中在每个方向上的延伸：累积比对得分从其最大实现值下降了数量x；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。blast算法参数w、t和x决定了比对的灵敏度和速度。blastn程序(对于核苷酸序列)默认使用字长(w)11，期望值(e)10，m＝5，n＝-4并比较两条链。对于氨基酸序列，blast程序默认使用字长3，期望值(e)10和blosum62得分矩阵(参见henikoff和henikoff,(1989)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]89:10915)比对(b)50，期望值(e)10，m＝5，n＝-4并比较两条链。
[0071]
blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报]90:5873-5787,1993)。blast算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(p(n))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则认为该核酸与参考序列相似。
[0072]
两个氨基酸序列之间的同一性百分比还可使用以下的算法来确定：e.meyers和w.miller,comput.appl.biosci.[生物科学中的计算机应用]4:11-17,(1988)，其已并入align程序(2.0版本)，使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，可以使用以下确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比：needleman和wunsch,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:444-453(1970)的算法，其已并入gcg软件包中的gap程序中，使用blosum62矩阵或pam250矩阵，空位权重为16、14、12、10、8、6或4，并且长度权重为1、2、3、4、5或6。
[0073]
术语“核酸”在本文中可与术语“多核苷酸”互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知的核苷酸类似物或经修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成的，天然存在的和非天然存在的，具有与参考核酸相似的结合特性，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。
[0074]
在核酸的上下文中，术语“可操作地连接”是指两个或更多个多核苷酸(例如，dna)区段之间的功能关系。通常，它是指转录调节序列与转录序列的功能关系。例如，启动子或增强子序列如果在合适的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接至转录序列的启动子转录调节序列与转录序列
在物理上邻接，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列(如增强子)不需要在物理上邻接或紧邻它们增强其转录的编码序列。
[0075]
术语“接头”、“连接的”、“连接至”或“连接(linkered)”是指至少两个氨基酸的多肽(蛋白质)插入两个多肽之间从而使其连接在一起。接头可以是可裂解的或不可裂解的。接头的实例示于以下表3和表4中。
[0076]
在一些方面，本披露提供了组合物，例如药学上可接受的组合物，其包含与至少一种药学上可接受的赋形剂一同配制的本文所述的il15构建体。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”包括生理学上相容的任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。赋形剂可适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(例如通过注射或输注)。
[0077]
本文披露的组合物可以是多种形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如可注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。合适的形式取决于预期的施用方式和治疗应用。典型的合适组合物是可注射或输注溶液的形式。一种合适的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一些实施例中，il15构建体通过静脉内输注或注射来施用。在一些实施例中，il15构建体通过肌内或皮下注射来施用。
[0078]
如本文所用的术语“治疗有效量”是指当施用于受试者以治疗疾病、或疾病或障碍的至少一种临床症状时，足以影响该疾病、障碍或症状的治疗的il15构建体的量。“治疗有效量”可以随il15构建体，疾病，障碍，和/或疾病或障碍的症状，疾病、障碍、和/或疾病或障碍的症状的严重程度，待治疗的受试者的年龄，和/或待治疗的受试者的体重而变化。在任何给定情况下的合适量对于本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过常规实验确定。在组合疗法的情况下，“治疗有效量”是指用于有效治疗疾病、障碍或病症的组合对象的总量。
[0079]
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂以治疗本披露中所述的治疗病症或障碍。这种施用涵盖以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂。这种施用也涵盖在多个容器中或在每种活性成分的独立容器(例如，胶囊、粉末和液体)中共同施用。可以将粉末和/或液体在施用之前重构或稀释到所期望的剂量。此外，这种施用也涵盖在大致相同的时间或在不同的时间以顺序方式使用每种类型的治疗剂。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文描述的病症或障碍方面提供药物组合的有益作用。
[0080]
如本文所用，短语“与
……
组合”意指在施用另外的治疗剂的同时、之前或之后将il15构建体施用给受试者。在某些实施例中，将il15构建体作为与另外的治疗剂的共同配制品来施用。
具体实施方式
[0081]
本披露提供了与il15信号传导通路结合并且将其激活的il15构建体。此外，本披露提供了具有期望的药代动力学特征和其他期望的属性的il15构建体，并且因此可用于降低癌症的可能性或治疗癌症。本披露进一步提供了包含il15构建体的药物组合物，和制备以及使用此类il15构建体的药物组合物预防和治疗癌症及相关障碍的方法。
[0082]
本披露的其他il15构建体包括氨基酸或编码氨基酸的核酸已经改变，但仍与表2中所述的序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或99％的同一性百分比的那些。在一些方面，它包括氨基酸序列的改变，其中与表2中所述的序列相比，改变的氨基酸不超过1、2、
3、4或5个，同时保持基本上相同的治疗活性。表2
接头
[0083]
还应理解，il15构建体的多肽链的结构域和/或区域可含有各种长度的接头区域。在一些实施例中，il15构建体结构域是通过接头区域彼此分开的。例如，il15ra-(接头)-il15。在一些方面，接头包含蛋白酶可激活(可裂解)的部分。
[0084]
在一些实施例中，氨基酸甘氨酸和丝氨酸包含接头(“gs”接头)的氨基酸。在另一个实施例中，接头可以但不限于是表3中的接头或其任何组合。表3
[0085]
在其他实施例中，接头包含蛋白酶可激活(可裂解)的部分。在某些实施例中，蛋白酶可激活的部分可以是但不限于表4中的接头或其任何组合。表5示出了在代表性构建体中蛋白酶可激活的部分的位置。表4
表5
fc区
[0086]
在又其他方面，通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基替换来改变fc区，以改变效应子功能。例如，可以将一个或多个氨基酸用不同的氨基酸残基替换，使得fc区对效应子配体具有改变的亲和力。亲和力改变的效应子配体可以是例如fc受体或补体的c1组分。这种方法描述于例如winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
[0087]
在另一方面，可以将一个或多个氨基酸残基用一个或多个不同的氨基酸残基替换，使得fc区具有改变的c1q结合和/或降低的或消除的补体依赖性细胞毒性(cdc)。该方法描述于例如idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
[0088]
在又另一方面，改变一个或多个氨基酸残基从而改变fc区固定补体的能力。该方法描述于例如bodmer等人的公开wo 94/29351中。在特定方面，本披露的il15构建体的一个或多个氨基酸被(igg1亚类和κ同种型的)一个或多个异型氨基酸残基替换。同种异型氨基酸残基还包括但不限于igg1、igg2和igg3亚类的重链恒定区以及κ同种型的轻链恒定区，如jefferis等人,mabs[单克隆抗体].1:332-338(2009)所述。
[0089]
在另一方面，如果期望adcc的降低，许多先前的报道显示igg4的fc区仅具有适度的adcc并且几乎没有cdc效应子功能(moore g l等人,2010mabs[单克隆抗体],2:181-189)。然而，发现天然igg4在应激条件下(如在酸性缓冲剂中或在升高的温度下)较不稳定(angal,s.1993mol immunol[分子免疫学],30:105-108；dall'acqua,w.等人,1998biochemistry[生物化学],37:9266-9273；aalberse等人,2002immunol[免疫学],105:9-19)。降低的adcc可以通过将il5构建体可操作地连接至用降低fcγr结合或c1q结合活性的改变的组合工程化的igg4 fc，从而降低或消除adcc和cdc效应子功能来实现。将il15构建体的物理化学特性看作生物治疗剂，igg4的较不期望的固有特性之一是其两条重链在溶液中动态分离(van der neut kolfschoten m等人,2007 science[科学],317:1554-157)。228位(eu编号系统)丝氨酸突变为脯氨酸表现出对igg4重链分离的抑制作用(angal,s.1993 mol immunol[分子免疫学],30:105-108；aalberse等人,2002 immunol[免疫学],105:9-19)。据报道，铰链区和γfc区中的一些氨基酸残基对fc区与fcγ受体的相互作用具有影响(chappel s m等人,1991 proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院学报],88:9036-9040；mukherjee,j.等人,1995 faseb j[美国实验生物学学会联合会杂志],9:115-119；armour,k.l.等人,1999 eur j immunol[欧洲免疫学杂志],29:2613-2624；clynes,r.a.等人,2000 nature medicine[自然医学],6:443-446；arnold j.n.,2007 annu rev immunol[免疫学年鉴],25:21-50)。此外，在人群中一些罕见的igg4同种型也可引起不同的
物理化学特性(brusco,a.等人,1998 eur j immunogenet[欧洲免疫遗传学杂志],25:349-55；aalberse等人,2002 immunol[免疫学],105:9-19)。为了产生具有低adcc和cdc但具有良好稳定性的il15构建体，可以修饰人igg4的铰链区和fc区并引入许多改变。这些修饰的igg4 fc分子可在seq id no:83-88，li等人的美国专利号8,735,553中找到。fc结构域可经由氨基酸改变来修饰，以提供“杵臼”技术并且引导两个多肽在体外或体内配对在一起。例如，引入人igg1 fc中的“杵臼”突变以促进异源二聚体形成(ridgway等人,prot.eng.[蛋白质工程]1996 9:617-621)。此外，将杵臼引入抗体的fc:fc结合界面、cl:chi界面、或vh/vl界面(参见，例如，us 2011/0287009、us 2007/0178552、wo 96/027011、wo 98/050431、和zhu等人,1997,protein science[蛋白质科学]6:781-788)。在一些实施例中，杵臼确保了两个不同重链正确配对在一起，以产生特异性il15构建体。il15构建体的产生
[0090]
il15构建体可通过本领域已知的任何方式来产生，包括但不限于重组表达或化学合成。重组表达可以来自本领域已知的任何合适的宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞、细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞等。
[0091]
本披露还提供了用于产生il15构建体的表达载体和宿主细胞。表达载体的选择取决于表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有可操作地连接至编码il15构建体的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些方面，除了在诱导条件的控制下，使用诱导型启动子来防止插入序列的表达。诱导型启动子包括例如阿拉伯糖、lacz、金属硫蛋白启动子或热激启动子。可以在非诱导条件下、而不在偏向宿主细胞更好耐受其表达产物的编码序列的群体的情况下扩大经转化的生物体的培养。除启动子外，其他调节元件也可以是有效表达il15构建体所需要或期望的。这些元件通常包括atg起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包含适合于使用中的细胞系统的增强子，可以提高表达效率(参见例如，scharf等人,results probl.cell differ.[细胞分化中的结果和问题]20:125,1994；和bittner等人,meth.enzymol.[酶学方法],153:516,1987)。例如，sv40增强子或cmv增强子可以用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
[0092]
用于携带并表达il15构建体的宿主细胞可以是原核或真核的。大肠杆菌是一种可用于克隆并表达本披露多核苷酸的原核宿主。其他适用的微生物宿主包括杆菌，如枯草芽孢杆菌，和其他肠杆菌科，如沙门氏菌属、沙雷氏菌属和各种假单胞菌属。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数量的多种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地用操纵子序列控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于启动和完成转录和翻译。其他微生物如酵母也可用于表达il15构建体。也可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
[0093]
在其他方面，哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本披露的il15构建体。例如，它们可以是携带外源表达载体的哺乳动物细胞系。这些包括任何正常死亡或正常或异常永生化动物或人细胞。例如，已经开发了几种能够分泌完整多肽的合适宿主细胞系，包括cho细胞系、各种cos细胞系和hek 293细胞。使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽一般在例如winnacker,from genes to clones[从基因到克隆],vch出版社,ny,n.y.,1987中讨论。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子
(参见例如queen等人,immunol.rev.[免疫学综述]89:49-68,1986)和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、rna剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。这些表达载体通常含有衍生自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异性的、阶段特异性的、和/或可调控的或可调节的。有用的启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型mmtv启动子、sv40启动子、mrp poliii启动子、组成型mpsv启动子、四环素诱导型cmv启动子(例如人立即早期cmv启动子)、组成型cmv启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。治疗方法
[0094]
本披露的il15构建体可用于多种应用，包括但不限于治疗癌症、感染或免疫障碍的方法。
[0095]
在一方面，本披露提供了一种治疗癌症的方法。在某些方面，该方法包括向有需要的患者施用有效量的il15构建体。癌症可包括但不限于胃癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、皮肤癌、间皮瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和肉瘤。
[0096]
如本文披露的il15构建体可以通过任何合适的方式施用，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及(如果期望用于局部治疗)病灶内施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。给药可以通过任何合适的途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射，这部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了多种给药方案，包括但不限于单次施用或在不同时间点的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
[0097]
本披露的il15构建体可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。关于这点要考虑的因素包括治疗的特定障碍、治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的起因、药剂的递送位点、施用方法、施用方案、和医疗从业者已知的其他因素。il15构建体不需要但任选地与目前用于预防或治疗所研究的障碍的一种或多种药剂一起配制。此类其他药剂的有效量取决于配制品中存在的il15构建体的量、障碍或治疗的类型、以及上文讨论的其他因素。这些通常以与如本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以本文所述剂量的约1％-99％使用，或以经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
[0098]
为预防或治疗疾病，本披露的il15构建体的合适剂量将取决于待治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用il15构建体是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、患者的临床病史和对il15构建体的反应、以及主治医生的判断。il15构建体适当地以一次或经一系列治疗施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至100mg/kg的il15构建体可以是用于向患者施用的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。取决于上述因素，一个典型的日剂量可以为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于几天或更长时间内的重复施用，取决于病症，治疗通常会持续直到出现疾病症状的期望抑制。这样的剂量可以间歇地施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约两个至约二十个，或例如约六个剂量的il15构建体)。施用初始较高负载剂量，随后施用一个或多个较低剂量。但是，其他给药方案可以是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。组合疗法
[0099]
在一方面，本披露的il15构建体可与其他治疗剂组合使用。可以与本披露的il15
构建体组合使用的其他治疗剂包括但不限于：化学治疗剂(例如，紫杉醇或紫杉醇剂(例如)；多西他赛；卡铂；拓扑替康；顺铂；伊立替康、阿霉素、来那度胺、5-氮杂胞苷、异环磷酰胺、奥沙利铂、培美曲塞二钠、环磷酰胺、依托泊苷、地西他滨、氟达拉滨、长春新碱、苯达莫司汀、苯丁酸氮芥、白消安、吉西他滨、美法仑、喷司他丁、米托蒽醌、培美曲塞二钠)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，埃罗替尼)、多激酶抑制剂(例如，司曲替尼(sitravatinib))、cd-20靶向剂(例如，利妥昔单抗、奥法木单抗)、cd52靶向剂(例如，阿仑单抗)、泼尼松龙、来那度胺、bcl-2抑制剂(例如，奥利默森钠(oblimersen sodium))、极光激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米)、mek抑制剂(例如，abt-348)、jak-2抑制剂(例如，incb018424)、mtor抑制剂(例如，坦罗莫司、依维莫司)、bcr/abl抑制剂(例如，伊马替尼)。
[0100]
在一方面，可以将本披露的il15构建体与免疫检查点剂组合施用。不受限地，免疫检查点剂可以是pd-1、pd-l1、pd-l2、tim3、lag-3、ox40或tigit抗体。在一方面，抗-pd1抗体可以是替雷利珠单抗。在一方面，抗-pd1抗体可以是欧司珀利单抗或替雷利珠单抗和欧司珀利单抗的组合。
[0101]
在一方面，il15已被施用于细胞疗法中，在对患者施用细胞疗法之前、期间或之后，对免疫细胞如t细胞或nk细胞提供有益效果。对于包含抗cd19嵌合抗原受体(car)的nk细胞，引入il15融合转基因，以便支持nk细胞功能和持久性(kaufman等人，blood 2018 v.32,supp.1,4541)。引入至nk细胞的egfr car与il15构建物组合施用，以促进成胶质细胞瘤模型的疗效(ma等人,cancer res.,2021 81(13)3635
–
48)。转导有cd123 car的nk92细胞被设计为针对急性骨髓性白血病(aml)。逆转录病毒载体用于引入转基因盒，用于人il-15的组成型表达，这使得nk细胞在体内的持久性增加(morgan等人,viruses 2021 13(7):1365)。药物组合物和配制品
[0102]
还提供了包含il15构建体的组合物，包括药物配制品。在某些实施例中，组合物包含一个或多个il15构建体，或包含编码一个或多个il15构建体的序列的一个或多个多核苷酸。这些组合物还可包含合适的载剂，例如本领域熟知的药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂。
[0103]
通过将具有期望纯度的这种il15构建体与一种或多种任选的药学上可接受的载剂混合来制备如本文所述的il15构建体的药物配制品(remington's pharmaceutical sciences[雷明顿药物科学],第16版osol,a.编辑(1980))，呈冻干配制品或水溶液的形式。药学上可接受的载剂在所采用的剂量和浓度下对于接受者通常是无毒性的，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(peg)。本文的示例性药学
上可接受的载剂还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(shasegp)，例如人可溶性ph-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuph20(百特国际有限公司(baxter international,inc.))。在美国专利号us 7,871,607和2006/0104968中描述了某些示例性shasegp和使用方法，包括rhuph20。在一方面，将shasegp与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
[0104]
示例性冻干配制品描述于美国专利号6,267,958中。水性配制品包括美国专利号6,171,586和wo 2006/044908中描述的那些，后者中描述的配制品包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
[0105]
可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有il15构建体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品的形式，例如膜或微胶囊。用于体内施用的配制品通常是无菌的。无菌可以例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。实例实例1：用不同il15构建体处理的hh细胞系中的磷酰基stat5评估
[0106]
hh细胞为从atcc获得的人类t淋巴细胞/白血病细胞系(crl-2105)。通过添加新鲜培养基或用新鲜培养基替换来维持培养。细胞培养起始于2x105细胞/ml并且维持在1x105至1x106细胞/ml之间，每2-3天更新培养基。所使用的il15为未改变的il15。p22339为已公开的il15构建体，由il15的两个分子(连接至il15ra的sushi结构域和连接至fc)组成(hu等人,sci.rep.[科学报告]2018 8:7675)。il-15刺激1.将细胞重悬浮在pbs 0.5％ bsa(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(sigma))缓冲剂中，并且以5
×
104细胞/25μl/孔接种到u 96孔板(康宁公司(corning
tm
)#3799)。2.将测试板在pbs(吉博科公司(gibco)#14190250，盖瑟斯堡(gaithersburg)，马里兰州) 0.5％ bsa缓冲剂中制备为6
×
溶液，起始于1000nm(最终浓度)4
×
连续稀释，共11个剂量。将溶剂制备为媒介物。3.每个测试孔接受5μl制备的6
×
化合物溶液，并且在37℃ 5％ co2下孵育15分钟。使用来自cisbio公司的htrf磷酸-stat5(tyr694)细胞测定试剂盒(cisbio
tm
公司#64at5peg)测试磷酸-stat5(tyr694)。4.细胞处理后，添加10μl的补充的裂解缓冲剂(4x)并且在室温在震荡下孵育至少60分钟。5.一旦细胞裂解，将16μl细胞裂解物转移至cisbio 96孔htrf检测板(cisbio 66pl96025)上，并且将4μl预混合的htrf抗体添加至每个孔中。6.将板用板封膜(plate sealer)盖住并且在室温孵育过夜。7.读取板在两个不同波长(665nm和620nm)下的荧光发射。
[0107]
此测定提供了对特异性构建体的活性的理解。在图15中，m43构建体(二价构建体b)示出了在裂解蛋白酶，蛋白裂解酶(matriptase)，的存在下的pstat5激活具有与il15和p22339相似的水平和曲线。相反，无蛋白裂解酶(matriptase)裂解的m43示出了非常小的活性。m101构建体(二价构建体c)在裂解前显示出非常小的活性，并且在裂解后也未达到il15所证实的pstat5的激活水平。此数据示于图16中。当不存在基质金属蛋白酶2(mmp2)蛋白酶
时，m135(呈构建体a形式)示出了小的活性。在mmp2存在下，m135示出了在低浓度而非更高浓度下的活性与p22339相似(图17)。但是，m176(构建体a)显示出在mmp2的存在下具有与p22339非常相似的激活曲线(图18)。m178(构建体a)显示出在基质金属蛋白酶9(mmp9)的存在下具有高活性，并且在基质金属蛋白酶(mmp14)的存在下具有中等范围的活性，这表明mmp14在此特异性构建体中作为蛋白酶不如mmp9那样有效(图19)。m181(构建体a)非常高的pstat 5活性，而在mmp2缺失时具有非常低的活性(图20)。使用不同类型的构建体，mk107(构建体e1)在mmp2的存在下具有非常高的pstat 5活性，而在mmp2缺失时具有非常低的活性(图21)。从mk137/mh7构建体(构建体e3)也可看到相似结果，当不存在金属蛋白酶时，其活性非常低；但当存在mmp2时，其活性非常高(图22)。在图23(mk142，构建体n)和图24(mk6，构建体f3)中，构建体在缺乏金属蛋白酶的情况下、在高浓度下测试时示出了部分活性，但在mmp2的存在下、在低浓度时示出了高活性。mk156(构建体n)在mmp2的存在下示出了高活性，在缺乏蛋白酶的情况下、在高浓度下示出了活性。该数据在图25中显示。实例2：m07e细胞增殖测定m07e细胞
[0108]
m07e细胞为人巨核细胞系。m07e细胞是从南京cobioer生物科技有限公司(cobioer#cbp60791)获得的。通过添加新鲜培养基或用新鲜培养基替换来在含有10％ fbs和gm-csf(10ng/ml)或il-2(10ng/ml)的rpmi 1640中维持细胞培养。测定培养起始于2x105细胞/ml并且维持在1x105至1x106细胞/ml之间。在gm-csf、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、il-2、il-3、il-4、il-6、il-15、ngf、scf、tnf-α和tpo的存在下，m-07e细胞增殖。il15试剂如实例1中所述地获得。il-2是从r&d系统公司(r&d systems)(#202-il)获得的。il-15刺激了细胞增殖1.收集细胞，并将其重悬于不含任何细胞因子的1640 10％ fbs中，并且以0.8-1
×
104细胞/90μl/孔接种到96孔板。2.将测定板在pbs 0.5％ bsa缓冲剂中制备为10
×
溶液，起始于1000nm(最终浓度)4
×
连续稀释，共9个剂量。将pbs用作稀释剂。3.将10μl制备的10
×
化合物溶液一式两份分配到每个测试孔中。在37℃ 5％co2下孵育72-96小时。4.发光读数提供了用p22339或m181构建体(用或不用蛋白裂解酶)处理时m07e增殖的指标。
[0109]
如图26中所示，当未经蛋白质裂解处理时，m181构建体(构建体a)的增殖活性非常小。相反，当用蛋白裂解酶处理m181构建体时，m181构建体展现出与p22339 il15构建体非常相似的活性。实例3：icr小鼠中mk137/mh7的最大耐受剂量确定
[0110]
icr小鼠是从北京维通利华实验动物技术有限公司获得的。将雌性icr小鼠按照体重随机分成13组，每组6只小鼠。将7个组的小鼠腹腔注射单剂量的媒介物(10mm组氨酸、10mm乙酸、240mm蔗糖、0.02％吐温20，ph 5.5)，或0.3、1和3mg/kg p22339，或10、30和100mg/kg mk137/mh7，用于监测每种药物在icr小鼠中的一般的毒理学作用。每天记录体重，且整个研究期间，每天还对小鼠的毒性临床体征进行监测。
[0111]
其他6个组的小鼠同时腹腔注射单剂量的0.3、1和3mg/kg p22339以及10、30和
100mg/kg mk137/mh7，用于评估每种药物的药代动力学(pk)。其示意图示于图27a中。在异氟烷/氧气麻醉下，在给药前和给药后0.5、2、8、24、48、72、96、120、144和168小时，从眶后窦收集血液样品。通过elisa测量p22339和mk137/mh7在不同给药剂量和时间点的血清浓度。抗人igg1 fc抗体为捕获抗体，而抗人il15ra抗体为检测抗体。
[0112]
记录了全部78只小鼠的存活时间，以确定每种药物的最大耐受剂量(mtd)。此结果示于图27b中，这表明用mk137/mh7构建体处理的小鼠具有更好的存活曲线以及有限的体重减轻(图27c)，证明mk137/mh7构建体比p22339能被更好耐受。图27b中，唯一死亡的小鼠与给药3mpk的p22339和100mpk的mk137/mh7相关，其余剂量均耐受。从这些结果来看，mk137/mh7单次推注mtd为30mg/kg，这远高于p22339的mtd 1mg/kg。mk137/mh7显示出相比于p22339具有更好的pk曲线(随着t1/2的延长)以及更高的auc，这表明其比p22339具有大得多的治疗窗。这些结果示于图28a-28b中。实例4：mk137/mh7对于外周血细胞和肿瘤浸润淋巴细胞的剂量依赖性药效动力学作用
[0113]
雌性c57bl/6小鼠皮下接种1x107gl261细胞。当肿瘤体积达到约100-200mm3时，将动物按照肿瘤体积分组，每组7只小鼠。小鼠腹腔注射单剂量的媒介物(10mm组氨酸、10mm乙酸、240mm蔗糖、0.02％吐温20，ph 5.5)、或0.25mg/kg p22339或10mg/kg和30mg/kg mk137/mh7。处理5天后，使用二氧化碳对小鼠进行安乐死并且选择5只小鼠用于样品收集。
[0114]
收集血液样品并且直接用于进一步的抗体染色。使用剪刀将肿瘤样品切碎至小块，并且之后进行酶消化以分离肿瘤浸润淋巴细胞(tils)。然后用针对某些生物标记的荧光缀合抗体对血细胞和tils进行染色，以使用流式细胞仪鉴定nk细胞、cd8
t细胞、cd4
t细胞和treg细胞用于进一步分析。
[0115]
就淋巴细胞中nk百分比的增加而言，10mpk的mk137/mh7在tils而非外周血细胞中示出了显著的体内pd作用。图29a至29b示出了p22339和mk137/mh7对于外周血细胞和tils的pd作用。该数据表明mk137/mh7在10mpk下在肿瘤而非外周血液中表现出了显著的pd作用，这表明mk137/mh7具有大的治疗窗。
[0116]
实例5：mk137/mh7在ht29 hh异种移植模型中的pk/pd关联性
[0117]
ncg小鼠是三联免疫缺陷小鼠，缺乏功能性t、b和nk细胞并且巨噬细胞和树突状细胞功能降低。此类特点使得这些小鼠成为免疫肿瘤学研究的良好模型。雌性ncg小鼠是从江苏集萃药康股份有限公司获得的，且皮下接种3x10
6 ht29(人结肠腺癌)细胞和1x10
6 hh(人白血病/淋巴瘤)细胞，选择这些细胞是基于它们对il15的pstat5反应。当平均肿瘤大小达到400-600mm3时，将动物随机分组，每组3或4只小鼠。腹腔注射单剂量的载体(10mm组氨酸，10mm乙酸，240mm蔗糖，0.02％吐温20，ph5.5)、p22339、mk137/mh7或mk138/mh7(不可分解)，测试血清pk和il15诱导的肿瘤pd的相关性，其中测量ht29 hh肿瘤组织中hh细胞的pstat5信号传递。
[0118]
通过elisa检测血清完整mk137/mh7和mk138/mh7。由mk137/mh7或mk138/mh7释放的血清il-15/il-15rα通过其在hh细胞中的pstat5诱导水平通过msd测量，该细胞在处理后的不同时间点被添加到从ncg小鼠获得的血清中。血清p22339水平通过elisa和msd检查，如前所述。mk137/mh7、mk138/mh7和p22339的肿瘤pd在治疗后的不同时间点通过测量ht29 hh肿瘤裂解液中hh细胞的pstat5信号传导来评估。
[0119]
使用上述实施例3中使用irc小鼠确定的最大耐受剂量(mtd)，测试p22339和mk138/mh7在ht29 hh异种移植模型中的pk/pd关联性。如图30所示，mk138/mh7的pk/pd优于p22339分子，显示出更大的信号传导和更大的治疗窗口。
[0120]
可以计算出mk137/mh7和p22339构建体之间摩尔il15的等量，从而允许在此基础上对这些分子进行给药。当等量的mk137/mh7(5mpk)和p22339(2.5mpk)剂量被施用于ht29 hh异种移植模型时，如通过elisa测量，在肿瘤微环境中获得类似的pd(图31)。然而，当测量小鼠血清中il15的量时，mk137/mh7向血液中释放的il15非常少，与p22339相反。这表明mk137/mh7比p22339具有更好的安全性，因为其活性更局限于肿瘤，而不是全身性。作为对照，不可切割的mk138/mh7在该模型中没有活性。根据ht29 hh模型，2.5mpk p22339与5mpk mk137/mh7显示出类似的pd。如实例3的icr小鼠毒性研究所示，p22339和mk137/mh7的mtd分别为1mpk和30mpk。这些数据综合起来表明mk137/mh7比p22339有更宽的治疗窗口。实例6：il15构建体组合
[0121]
本文披露了许多不同的具有可裂解的接头的il15构建体。有可能产生il15构建体的组合，其中如披露的一个il15与至少一个其他il15构建体组合。这将导致肿瘤微环境中蛋白酶表达的量不同。例如，表达大量特异性蛋白酶的肿瘤将非常快速地裂解一个il15构建体中的蛋白酶可激活的部分，其中没有那样高表达的第二蛋白酶将较缓慢地裂解第二蛋白酶可激活部分，导致较慢的il15激活。如果期望，此il15构建体的组合可以使得更多的构建体递送的il15在肿瘤微环境中停留更长时间。这可以解决与il15递送相关的一个问题，即与il15全身施用相关的非常短的半衰期的问题。