1.本发明属于生物技术领域，具体是使用枯草芽孢杆菌同时表达海藻糖合酶、海藻糖水解酶和普鲁兰酶合成制造海藻糖的方法
背景技术：
2.海藻糖由两个葡萄糖基通过α-1,1糖苷键连接形成，其作为一种安全、稳定的天然二糖，素有“生命之糖”的美誉，被广泛应用于食品、化妆品和医药等行业。
3.海藻糖生物合成法包括磷酸化酶法、单酶法、双酶法。双酶法合成海藻糖的途径中主要需要两种酶，麦芽寡糖基海藻糖合酶(mtsase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)，是以淀粉为底物制备海藻糖的两个关键酶。专利文献cn99123896.6公开了最适温度50℃和最适ph6.0的mtsase和mthase，转化率可达到80％，日本林原生化研究所已利用该技术实现大规模生产。
4.枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的不产内毒素的一种食品安全菌种。专利文献cn103215300 a将海藻糖合成酶整合至枯草芽孢杆菌基因组中合成海藻糖，专利文献cn 111218467 b公开了一种高效同步分泌表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的枯草芽孢杆菌，使用spycatcher和spytag实现了mtsase和mthase在枯草芽孢杆菌基因组上高效分泌表达和两个级联酶的体外组装，使海藻糖的转化效率提高至81.5％。
5.在国际上海藻糖的需求量处于供不应求的状态，截至2015年，国内仅保鲜市场对海藻糖的需求就有10万t/a，2022年全球海藻糖市场销售额达到了14亿美元，预计2029年将达到23亿美元，且随着海藻糖的不断宣传和普及，海藻糖的需求量还会不断攀升，寻求更简单高效的合成海藻糖是国内外企业不断创新的目标。
技术实现要素：
6.基于现有技术的需求，本发明通过研究探索，构建了一种多酶联产催化合成海藻糖的枯草芽孢杆菌及其应用。
7.本发明提供一种多酶联产催化合成海藻糖的重组枯草芽孢杆菌，其通过基因重组使得所述重组枯草芽孢杆菌可同时表达普鲁兰酶与海藻糖合酶和水解酶三种酶。
8.优选地，所述三种酶是分泌表达至胞外。
9.更优选地，所述三种酶整合至枯草芽孢杆菌出发菌株的基因组上。具体地，在nprb位点插入所述海藻糖合成酶的基因和ytxe位点插入所述海藻糖水解酶的基因，或在nprb位点插入所述海藻糖水解酶的基因和ytxe位点插入所述海藻糖合成酶的基因。
10.另外优选地，普鲁兰酶整合至基因组，海藻糖合酶和水解酶通过质粒表达，具体地采用且表达海藻糖合酶所用的启动子弱于表达海藻糖水解酶的启动子，具体采用pht43载体表达的海藻糖合酶，其受p43启动子启动表达，且采用pma0911载体表达的海藻糖水解酶，其受t7启动子表达。其中，t7启动子是强启动子，p43启动子是弱启动子，实现了这三种酶在
同一个菌株中不同强度的表达。
11.更具体地，所述普鲁兰酶的氨基酸序列如cn102120971b中seq id no：2所示(在本发明中也是seq id no：2)；所述海藻糖合成酶的ncbi登录号为ab045141.1中第743bp-3016bp位；所述海藻糖水解酶的ncbi登录号为ab045141.1中第3013bp-4740bp位。
12.质粒表达或基因组表达的海藻糖合酶和水解酶其n端连接有普鲁兰酶的cbm68结合结构域(其编码核苷酸序列1bp-402bp，如seq id no：1所示)。
13.在一个实施方式中，枯草芽孢杆菌出发菌株是枯草芽孢杆菌sck6菌株。
14.本发明提供所述的重组枯草芽孢杆菌在催化合成海藻糖中的应用。
15.具体地，取所述重组枯草芽孢杆菌发酵产生的粗酶液添加至麦芽糊精底物中，ph5-7，于40-55℃水浴反应36-72h，终止反应。优选地，所述ph值为6。
16.任选地，所述终止反应是100℃煮沸10min终止反应。
17.目前，商品化的普鲁兰酶可分为i型和ii型，i型普鲁兰酶水解普鲁兰糖、支链淀粉以及其他小分支低聚糖中的α-1,6糖苷键，产物主要是麦芽三糖和一些线性寡糖；ii型普鲁兰酶，又名淀粉普鲁兰酶，是一种双功能酶，它除了具有i型普鲁兰酶水解α-1,6糖苷键的脱支功能外，还能够随机水解淀粉和相关线性寡糖直链上的α-1,4糖苷键，具有α-淀粉酶功能。本发明人前期发现的普鲁兰酶是中性ⅰ型普鲁兰酶，具有更专一的底物特异性，更利于双酶法生产海藻糖的反应的进行，避免底物浪费。
18.工业生产中使用的麦芽寡糖基海藻糖合酶(mtsase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(mthase)：选择来自于分枝节杆菌(athrobacter ramosus)的海藻糖合酶和水解酶，其最适温度为50℃，最适ph为6。目前市场上的普鲁兰酶多为酸性，最适反应ph 4.5-ph 5.0，本发明使用的普鲁兰酶最适反应温度为60℃，最适反应ph为ph6.0，温度和ph与现有技术中酶活较高的海藻糖合酶和海藻糖水解酶具有最相似的反应温度和反应ph。其次，本发明通过将普鲁兰酶整合至枯草芽孢杆菌基因组中，实现了普鲁兰酶与海藻糖合酶和水解酶三种酶在同一个菌株中同时表达，因海藻糖水解酶是合成海藻糖的关键酶，其与海藻糖合酶之间的配合是一个复杂的过程，本发明通过使用不同表达强度的启动子来调节海藻糖合酶与水解酶的表达强度，从而得到两者配合海藻糖最佳的转化效率。
19.且该重组枯草芽孢杆菌表达的酶均分泌至胞外，节省了发酵成本和发酵时间。
20.本发明进一步的将海藻糖合成过程中的三个酶整合至枯草芽孢杆菌基因组不同位点，克服了在长期发酵生产过程中的质粒传代稳定性的问题，更有利于长期的传代培养和发酵生产。
附图说明
21.图1、枯草芽孢杆菌sck6同时表达mtsase、mthase和普鲁兰酶sds-page电泳图。
22.其中，1：sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh、2：amye::pula sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh、3：sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、4：amye::pula sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh。
23.图2、海藻糖合成转化率对比图。其中，
24.1:sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh、2：amye::pula sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh、3：sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、4：amye::pula sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh。
25.图3、整合型枯草芽孢杆菌合成海藻糖转化率对比图。
具体实施方式
26.实施例1海藻糖合成菌株的构建
27.1、amye::pula sck6普鲁兰酶表达菌株构建
28.根据genebank注释的枯草芽孢杆菌基因组amye位点的序列信息，在amye位点上游和下游分别设计引物：
29.up-f：gccctttcgtcttcaagaacggagatgtctgaatggctgtatatc，
30.up-r：gactgttgttttgggggcatcgcggcattatgtttgaatttc，
31.down-f：gggtattaattcaatgttgattaataatggcagcgcccaag，
32.down-r：cagggctgcaggaattcgattttctcaacgagttcactgaccg，
33.pcr扩增枯草芽孢杆菌sck6基因组amye位点的上游和下游片断，分别命名为up_seq、down_seq。
34.以本实验室筛选保藏的(cn102120971b中公开)普鲁兰酶(genebank号seq_id:hq844266.1)序列为模板，设计引物pul_f:atgcccccaaaacaacagtc；pula_r:tcaacattgaattaatacccacgcac。
35.pcr扩增普鲁兰酶序列并命名为：pula_seq；
36.以商品质粒pdg1730为模板，设计如下引物：
37.1730-f：gggtattaattcaatgttgaatcgaattcctgcagccctg，
38.1730-r：ttcttgaagacgaaagggcctc
39.pcr扩增pdg1730骨架序列并命名为1730_seq。
40.使用genebuilder(ab clone)无缝克隆酶将以上四个片断混合后50℃条件下连接2h后转化入大肠杆菌dh5α中，涂布含氨苄的lb平板37℃培养12-16h。
41.将测序正确的pdg1730-pula整合质粒转化至sck6中，涂布含壮观霉素(200ug/ml)的lb平板，挑选基因组插入正确的单克隆，命名为amye::pula sck6。
42.2、mtsase和mthase表达载体构建
43.以商用的pma0911质粒为模板，设计引物：
44.pma-f：gactgttgttttgggggcatatgtaaatcgctcctttttaggtg
45.pma-r：gctagcttggtacgtacca
46.pcr扩增pma0911载体骨架，命名为pma
47.以genebank注释的普鲁兰酶seq_id:hq844266.1为模板，引物c68-f：atgcccccaaaacaacag,c68-r：aataagctttaatagtacgtctgtcg。pcr扩增cbm68结构域序列，命名为c68。
48.以genebank注释的海藻糖合成酶ab045141.1为模板，设计引物
49.ars-f：gacgtactattaaagcttattgttccggcaagcacatatagacg
50.ars-r：tctggtacgtaccaagctagcttagtgatgatgatgatgatgtgtttcgac
51.pcr扩增其中743bp-3016bp序列，命名为ars。
52.以genebank注释的海藻糖水解酶ab045141.1为模板，设计引物
53.arh-f：acgtactattaaagcttattatgaatcgcagatttccagtttg
54.arh-r：tggtacgtaccaagctagcttagtgatggtgatgatgatgttcc
55.pcr扩增其中3013bp-4740bp序列，命名为arh。
56.使用genebuilder无缝克隆酶将以上pcr获得的片断pma、c68与ars混合，50℃条件下连接2h后转化入大肠杆菌dh5α中，涂布含氨苄的lb平板；将片断pma、c68与arh混合同样的处理方法转化入大肠杆菌dh5α中，涂布含氨苄的lb平板。将测序正确的质粒分别命名为pmc68-ars、pmc68-arh。
57.以商用质粒pht43为模板，引物pht43-f：agcccgcctaatgagc,pht43-r：tgatccttcctcctttaattgggaat。pcr扩增pht43。
58.以pmc68-ars为模板，以下述引物
59.c68-ars-f：ttcccaattaaaggaggaaggatcaatgcccccaaaacaacagt
60.c68-ars-r：cgctcattaggcgggctgccccgggttagtgatgatgatgatgatgtgtttcgac。
61.pcr扩增c68-ars。
62.以pmc68-arh为模板，以下述引物
63.c68-arh-f：ttcccaattaaaggaggaaggatcaatgcccccaaaacaacagt
64.c68-arh-r：cgctcattaggcgggctgccccgggttagtgatggtgatgatgatgttccag。
65.pcr扩增c68-arh。
66.使用genebuilder将pht43分别与c68-ars和c68-arh混合后50℃条件下连接2h后转化入大肠杆菌dh5α中，涂布含氨苄的lb平板。将测序正确的质粒命名为pht43-c68-arh、pht43-c68-ars。
67.3、海藻糖合成重组菌株的构建
68.上述步骤中构建完成的四个质粒pmc68-ars、pmc68-arh、pht43-c68-arh、pht43-c68-ars分别转化至sck6，涂布于含有卡纳抗性的lb平板，挑选转化正确的单克隆，分别命名为sck6/pmc68-ars、sck6/pmc68-arh、sck6/pht43-c68-ars、sck6/pht43-c68-arh。
69.构建同时含有海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的枯草芽孢杆菌sck6菌株，具体方法如下：将sck6/pht43-c68-ars做成感受态，质粒pmc68-arh和质粒pht43-c68-arh分别转入上述感受态中，获得sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh和sck6/pht43-c68-ars/pht43-c68-arh；将sck6/pmc68-ars做成感受态，质粒pmc68-arh和质粒pht43-c68-arh分别转入上述感受态中，获得sck6/pmc68-ars/pmc68-arh和sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh。
70.实施例2海藻糖合成重组菌株的发酵培养及酶活测定
71.2.1海藻糖合成重组菌株的发酵培养
72.将菌种sck6/pmc68-ars、sck6/pmc68-arh、sck6/pht43-c68-ars、sck6/pht43-c68-arh接种至lb培养基中,37℃过夜培养12-15h，1％接种量转接至20ml发酵培养基(蛋白胨：10g/l酵母粉：15g/l k2hpo
4 2g/l：)37℃、220rpm培养48h，12000rpm离心10min取上清，即为mtsase和mthase粗酶液。
73.2.2 mtsase酶活测定方法
74.将50μl mtsase已稀释的粗酶液添加至50℃预热的450μl的浓度为1g/l的麦芽糊精溶液中(以10mm ph6的pbs缓冲液溶解)，50℃反应10min，加入500μl dns溶液，100℃煮沸10min，待反应液冷却后，测定a540值。mtsase的酶活单位定义为：在50℃时，其它条件恒定，单位时间内每消耗1μm麦芽寡糖所需的酶量。(麦芽寡糖的还原性按葡萄糖计算)
[0075][0076]
2.3 mthase酶活测定方法
[0077]
将1mlmtsase未稀释的粗酶液添加至50℃预热的8ml的浓度为1g/l的麦芽糊精溶液中(以10mm ph6的pbs缓冲液溶解)，50℃反应2h使其完全反应，煮沸10min灭活作为麦芽寡糖基海藻糖备用。
[0078]
将50μl mthase已稀释的粗酶液添加至50℃预热的450μl海藻糖合酶中，50℃反应10min，加入500μl dns溶液，100℃煮沸10min，待反应液冷却后，测定a540值。mtsase的酶活单位定义为：在50℃时，其它条件恒定，单位时间内每水解1μm麦芽寡糖基海藻糖所需的酶量。(麦芽寡糖的还原性按葡萄糖计算)
[0079][0080]
将发酵培养的sck6/pmc68-ars、sck6/pmc68-arh、sck6/pht43-c68-ars、sck6/pht43-c68-arh四株菌的粗酶液按照上述方法测定海藻糖合成酶和海藻糖水解酶的酶活，测定结果如表1所示，结果表明pma0911载体表达的mtsase和mthase的酶活均比pht43高。
[0081]
表1不同质粒表达海藻糖合成酶和海藻糖水解酶的酶活
[0082]
酶名称pmc68-arspht43-c68-arspmc68-arhpht43-c68-arh酶活u/ml21.62.814.13.4
[0083]
发酵培养实施例1中构建的以下同时可表达海藻糖合成酶和海藻糖水解酶的四株：sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、sck6/pht43-c68-ars/pht43-c68-arh、sck6/pmc68-ars/pmc68-arh和sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh，发酵培养过程中发现具有同一个复制子的两个质粒不兼容，因此选定培养sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh并测定海藻糖合成效率，海藻糖合成具体步骤及转化率计算方法如下所示，测定结果如图2所示。
[0084]
结果表明sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh粗酶液在反应48h和72h的海藻糖转化率均比sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh粗酶液高，其中sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh粗酶液在反应48h时海藻糖转化率可达40％。
[0085]
海藻糖合成反应体系：
[0086]
粗酶液前处理：发酵液离心10min，分离得到上清，通过0.22μm的水系滤膜除菌，备用。
[0087]
底物：配置100g/l的麦芽糊精溶液。
[0088]
反应：900μl粗酶液与100μl底物溶液混匀，50℃水浴反应48h或72h，100℃煮沸10min终止反应。
[0089]
海藻糖转化率计算方法
[0090]
转化产物检测方法：高效液相色谱法
[0091]
色谱柱：氨基柱(hypersil nh
2-s色谱柱)
[0092]
流动相为乙腈：水＝75：25
[0093]
标准品：海藻糖(纯度＝98％)标准品20mg，加入200μl超纯水溶解，摇匀。使用时用
超纯水稀释10倍，并用0.22μm水系滤膜过滤，收集滤液供测定用。
[0094]
样品制备：将反应结束后的溶液离心10min，取用0.22μ水系滤膜过滤，收集滤液供测定用。
[0095]
试样的测定：首先用流动相以1.0ml/min的流速冲洗管路30分钟，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相清洗参比池40分钟，走基线，待基线走稳后,将标准溶液和制备好的试样分别进样10ul。根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以外标法计算糖组分的浓度。
[0096]
结果计算：
[0097][0098]
式中：cm—海藻糖浓度，单位为(g/l)；
[0099]
am—样品峰面积；
[0100]
as—标准品峰面积；
[0101]
cs—标准品质量，g；
[0102]
海藻糖转化率的计算：
[0103][0104]
式中：x1—海藻糖转化率，单位为(％)；
[0105]cm
—海藻糖浓度，单位为(g/l)；
[0106]
c0—麦芽糊精浓度，单位为(g/l)。
[0107]
实施例3提高海藻糖转化率的方法
[0108]
为进一步提高海藻糖合成转化效率，在枯草芽孢杆菌基因组上插入普鲁兰酶基因，如实施例1中所述，将实施例2中的组合pht43-c68-ars/pmc68-arh，pmc68-ars/pht43-c68-arh将该两个组合的质粒分别转化入实施例1中构建完成的amye::pula sck6菌株中，构建同时含有普鲁兰酶、海藻糖合成酶、海藻糖水解酶的菌株，挑取转化成功的单克隆，并命名amye::pula sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、amye::pula sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh。
[0109]
根据实施例2中描述的培养方法，培养上述两株菌amye::pula sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、amye::pula sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh和sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh、sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh。发酵48h进行海藻糖合成反应并测定海藻糖转化率，测定方法同实施例2，其表达的蛋白sds-page电泳图如图1所示，测定转化率结果表明：其在基因组上插入普鲁兰酶后，海藻糖转化率提高20％以上。如图2所示，48hamye::pula sck6/pht43-c68-ars/pmc68-arh转化率最高为88％，比对照组的sck6/pht 43-c68-ars/pmc68-arh转化率提高22％；48h amye::pula sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh转化率最高可达63％，比对照组sck6/pmc68-ars/pht43-c68-arh转化率提高23％。
[0110]
实施例4整合型枯草芽孢杆菌合成海藻糖
[0111]
根据实施例3中的结果,在枯草芽孢杆菌sck6中以整合型表达的普鲁兰酶与质粒表达的海藻糖合酶、海藻糖水解酶实现了同一菌中生产海藻糖。
[0112]
为实现三个酶更稳定的在同一枯草芽孢杆菌菌株中的表达，发明人将海藻糖合酶
与海藻糖水解酶整合至枯草芽孢杆菌基因组中进行表达。具体步骤如下：
[0113]
以质粒pdg1730为载体，构建pdg1730-nprb-ars、pdg1730-ytxe
–
ars、pdg1730-nprb-arh、pdg1730-ytxe
–
arh的质粒，在nprb、ytxe位点分别组合插入海藻糖合酶(ars)和海藻糖水解酶(arh)。
[0114]
设计引物1730f：gggcaaggctagacgggac，1730-r：tcttgacactccttatttgattttttg，pcr扩增pdg1730载体获得1730片段；nprb基因的上游同源臂引物nprb-up-f：caaaaaatcaaataaggagtgtcaagagttttcccttaaaacaaatatttgaacacgattttggc，nprb-up-r：gcaaacaaaaacagtcaggacac，以sck6为模板pcr扩增获得nprb-up片段；下游同源臂引物nprb-down-f：atgaaaacgaatcaagttaatgaccg，nprb-down-r：gtcccgtctagccttgcccaacaccacatccttcctattttggaatctacc，以sck6为模板pcr扩增获得nprb-down片段；
[0115]
设计引物ars-f:tcctgactgtttttgtttgccgggtgcccgccagtacctac、ars-r:ttaacttgattcgttttcattcatgtctccaccagcaggpcr扩增获得ars片段；
[0116]
设计引物arh-f:cctgactgtttttgtttgccggatgaaccgacgattcccgg、arh-r:attaacttgattcgttttcattcactcgaggcgcacgatpcr扩增获得arh片段
[0117]
将以上扩增获得的片段nprb-up、nprb-down、ars、1730使用genebuilder(abclonal：2
×
multif seamless assembly mix)50℃连接30min后转化至大肠杆菌dh5α中，筛选正确的单克隆命名为pdg1730-nprb-ars；将以上扩增获得的片段nprb-up、nprb-down、arh、1730使用genebuilder连接，筛选正确的单克隆命名为pdg1730-nprb-arh。
[0118]
构建ytxe位点插入载体的引物如下：ytxe基因的上游同源臂引物ytxe-up-f：tcaaataaggagtgtcaagactgacctctttcttcatcgtaacagg，ytxe-up-r：tgcagatcgatttgggacatcg，以sck6为模板pcr扩增获得ytxe-up片段；下游同源臂引物ytxe-down-f：ggataacaagacaaatgaacacatg，ytxe-down-r：gtaagtcccgtctagccttggagagcatcaggattctgcatatacaac，以sck6为模板pcr扩增获得ytxe-down片段；
[0119]
设计引物ars-f:gtcccaaatcgatctgcacgggtgcccgccagtaccta；ars-r:gttcatttgtcttgttatcctcatgtctccaccagc。
[0120]
pcr扩增获得ars片段；
[0121]
设计引物arh-f:atgtcccaaatcgatctgcacggatgaaccgacgattcccggt、arh-r:gttcatttgtcttgttatcctcactcgaggcgcacgatcgcg
[0122]
pcr扩增获得arh片段。
[0123]
将以上扩增获得的片段ytxe-up、ytxe-down、ars、1730使用genebuilder(abclonal：2
×
multif seamless assembly mix)50℃连接30min后转化至大肠杆菌dh5α中，筛选正确的单克隆命名为pdg1730-ytxe-ars；将以上扩增获得的片段ytxe-up、ytxe-down、arh、1730使用genebuilder连接，筛选正确的单克隆命名为pdg1730-ytxe-arh。
[0124]
在实施例1中构建完成的amye::pula sck6菌株感受态中转入上述构建完成的基因组nprb和ytxe位点插入载体pdg1730-nprb-ars、pdg1730-ytxe-arh，筛选在nprb位点插入ars和ytxe位点插入arh正确的单克隆，命名为amye::pula-nprb::ars-ytxe::arh sck6；amye::pula sck6菌株感受态中转入插入载体pdg1730-nprb-arh、pdg1730-ytxe-ars筛选在nprb位点插入arh和ytxe位点插入ars正确的单克隆，命名为amye::pula-nprb::ar h-ytxe::ars sck6。
[0125]
实施例5整合型枯草芽孢杆菌合成海藻糖转化率的测定
[0126]
将实施例4中构建完成的合成海藻的整合型枯草芽孢杆菌菌株amye::pula-nprb::ars-ytxe::arh sck6、amye::pula-nprb::arh-ytxe::ars sck6按照实施例2的培养方法培养48h后，离心取上清进行反应：900μl粗酶液与100μl麦芽糊精底物溶液混匀，60℃水浴反应48h或72h，100℃煮沸10min终止反应。按照实施例3中的计算转化率的方法hplc检测海藻糖转化率。
[0127]
结果如图3所示，amye::pula-nprb::ars-ytxe::arh sck6的插入组合海藻糖转化效率可达25％，而amye::pula-nprb::arh-ytxe::ars sck6的插入组合海藻糖转化率仅为5％。