疮痂病链霉菌y185及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物学、生物技术和生物防治领域，具体地说，涉及一株疮痂病链霉菌y185及其应用。
背景技术：
2.小麦茎基腐病和黄瓜根腐病均是由镰刀菌属(fusarium sp.)引起的严重土传病害，镰刀菌以菌丝和孢子的方式越冬，常分布于植株病残体、带病的种子和条件适宜的土壤中，具有寄主种类多、致病能力强和危害严重等特点，不仅会使作物萎蔫、腐烂和坏死，产生的毒素被人畜食用后也会引发中毒(rocha et al.2011)。因此，针对该属的防治研究一直受到人们的关注和重视，相较于农业防治和化学防治，生物防治具备绿色环保、不形成抗药性、效果显著、无残留等技术优势，是目前防治小麦茎基腐病和黄瓜根腐病的研究热点，有研究表明放线菌也对小麦茎基腐病和黄瓜根腐病的致病菌镰刀菌有很强的抑菌能力。
3.放线菌是能够形成分枝菌丝和分生孢子的原核生物，种类丰富，已报道的放线菌有180个属和20000多个种，它代表了自然界中物种多样性最高的微生物类群之一，同时也是极具开发价值的类群，受到人们的长期关注(van bergeijk et al.2020)。放线菌对环境的适应性很强，广泛分布于土壤、海洋、植物体内等，是人类研究最早并应用到生产中的生防微生物，放线菌能够产生多种次级代谢物抑制病原微生物的生长，是一类非常具有生防潜力的微生物资源(hatamy et al.2014)。因此，许多放线菌被广泛应用于植物病害的生物防治，其中链霉菌属(streptomycetes sp.)作为最具代表性的放线菌之一，是研究人员长期关注的重要功能类群。
4.不同种类的链霉菌在不同植物病害生防中有重要作用。链霉菌(streptomyces polychromogenes uae1)在温室条件下显著抑制由茄腐镰刀菌引起的病害，使病情指数降低了53.0％(alblooshi et al.2021)；链霉菌(streptomyces puniceus l75)发酵液粗提取物存在抗真菌代谢物，使番茄早疫病害减少了98.0％(hao et al.2019)；链霉菌(streptomyces sichuanensis sca4-4)显著抑制香蕉幼苗根和鳞茎中尖孢镰刀菌的侵染，使病情指数降低51.0％(qi et al.2022)；链霉菌(streptomyces vinaceusdrappus s5mw2)使由立枯丝核菌引起的番茄根腐病减少71.0％(yandigeri et al.2015)，这些研究表明链霉菌是极具开发价值的类群。
5.目前未见疮痂病链霉菌对镰刀菌引起的小麦茎基腐病和黄瓜根腐病等病害防治的相关研究。
技术实现要素：
6.本发明的目的是提供一株具有广谱抗菌活性的疮痂病链霉菌y185及其应用，特别涉及该菌在小麦茎基腐病和黄瓜根腐病等植物病害生物防治方面的应用。
7.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一株具有生防作用的疮痂病链霉菌streptomyces scabiei y185，该菌株于2021年从新疆维吾尔自治区阿克苏地区分离，现已
保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，地址：中国北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.27486，保藏日期2023年5月30日。
8.第二方面，本发明提供含有疮痂病链霉菌y185的菌剂。
9.第三方面，本发明提供由疮痂病链霉菌y185或其菌剂制备的生物农药或生物肥料。
10.第四方面，本发明提供由疮痂病链霉菌y185制备的生防药剂或抗菌剂。
11.第五方面，本发明提供疮痂病链霉菌y185或其菌剂的以下任一应用：
12.1)用于拮抗植物病原真菌；
13.2)用于防治小麦茎基腐病；
14.3)用于防治黄瓜根腐病；
15.4)用于制备生物农药。
16.本发明所述植物包括但不限于小麦、黄瓜。
17.本发明所述植物病原真菌包括但不限于假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、串珠镰刀菌(fusariummoniliforme)、灰霉病菌(botrytis cinerea)、小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)、小长喙霉病菌(ceratocystis fimbriata)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)，番茄早疫病菌(alternaria solani)、百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lilii)、西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)、棉花枯萎病菌(verticillium dahliae kleb)、拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)、炭疽病菌(colletotrichum destructivum)。
18.第六方面，本发明提供疮痂病链霉菌y185和/或其产生的抑菌活性物质的以下任一应用：
19.a)用于抗病原菌以及由病原菌所导致的相关疾病或植物病害；
20.b)用于诱导植物增强对病原菌导致的相关疾病或植物病害的抗性；
21.c)用于制备生防药剂、抗菌剂或植物免疫诱抗剂。
22.进一步地，所述病原菌为植物病原真菌。
23.进一步地，所述植物病害包括但不限于小麦茎基腐病、黄瓜根腐病。
24.本发明的疮痂病链霉菌y185具有很广的抑菌谱，对13种病原真菌都有较强的抑制作用，不仅可以在植物生长过程中起到生防作用，还可以显著降低由假禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病和尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌引起的黄瓜根腐病的发病率和病情指数。菌株y185在植物病害的生物防治等方面具有很好的应用价值。
25.菌株y185对尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌的抑制率分别为55.3％和62.1％；对灰霉病菌、番茄早疫病菌、小长喙霉病菌、百合根腐病菌、小麦纹枯病菌、水稻纹枯病菌、棉花黄萎病菌、芹菜斑枯病菌、百合根腐病菌和炭疽病菌的抑菌率达38.7％-76.5％。通过温室实验证明，y185发酵液对由假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)引起的小麦茎基腐病防治效果达60.0％；对由尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)和串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)引起的黄瓜根腐病防效分别达45.2％和26.4％。疮痂病链霉菌y185在生物农药和抗菌剂方面具有非常好的应用前景。
附图说明
26.图1a为本发明较佳实施例中13株放线菌对尖孢镰刀菌的平板抑制效果。
27.图1b为本发明较佳实施例中13株放线菌对串珠镰刀菌的平板抑制效果。
28.图2a为本发明较佳实施例中5株高抗尖孢镰刀菌抗菌物质的扩展能力。
29.图2b为本发明较佳实施例中4株高抗串珠镰刀菌抗菌物质的扩展能力。
30.图3为本发明较佳实施例中菌株y185在不同培养基上的形态特征。
31.图4为本发明较佳实施例中菌株y185的菌丝形态。
32.图5为本发明较佳实施例中菌株y185的生理生化鉴定。
33.图6为本发明较佳实施例中菌株y185的16s rrna基因系统进化树。
34.图7为本发明实例中菌株y185看家基因串联系统发育树。
35.图8为本发明较佳实施例中菌株y185对11种植物病原真菌的生长抑制作用。
36.图9为本发明较佳实施例中菌株y185对小麦茎基腐病的防治效果。ck：小麦种植于无病菌土壤中(清水)；fp：小麦种植于含有假禾谷镰刀菌的病土中；y185 fp，小麦用y185发酵菌液浸种后种植于含有假禾谷镰刀菌的病土中；多菌灵 fp：小麦用多菌灵浸种后种植于含有假禾谷镰刀菌的病土中。
37.图10为本发明较佳实施例中菌株y185对由尖孢镰刀菌引起的黄瓜根腐病的防治效果。ck：黄瓜种植于无病菌土壤中(清水)；fo：黄瓜种植于含有尖孢镰刀菌的病土中；y185 fo，黄瓜用y185发酵菌液浸种后种植于含有尖孢镰刀菌的病土中；多菌灵 fo：黄瓜用多菌灵浸种后种植于含有尖孢镰刀菌的病土中。
38.图11为本发明较佳实施例中菌株y185对由串珠镰刀菌引起的黄瓜根腐病的防治效果。ck：黄瓜种植于无病菌土壤中(清水)；fm：黄瓜种植于含有串珠镰刀菌的病土中；y185 fm，黄瓜用y185发酵菌液浸种后种植于含有串珠镰刀菌的病土中；多菌灵 fm：黄瓜用多菌灵浸种后种植于含有串珠镰刀菌的病土中。
具体实施方式
39.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
40.以下实施例中涉及的测试菌如下，均来源于中国农业大学：
41.植物病原真菌：假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum)，尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)，串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)，灰霉病菌(botrytis cinerea)，小长喙霉病菌(ceratocystis fimbriata)，小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)，水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)，番茄早疫病菌(alternaria solani)，百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lilii)，西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)，棉花枯萎病菌(verticillium dahliae kleb)，拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)，芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)，炭疽病菌(colletotrichum destructivum)。
42.植物病原细菌：发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)、葡萄土壤杆菌(agrobacterium vitis)，根癌土壤杆菌(agrobacterium tumefaciens)，黄瓜角斑病菌(pseudomonas syringae pv.lachrymans)，柑橘溃疡病菌(xanthomonas citri)，大白菜黑
腐病菌(xanthomonas campestris pv.campestris)，辣椒疮痂病菌(xanthomonas campestris pv.vesicatoria)，胡萝卜软腐病果胶杆菌(pectobacterium carotovorum)，茄子青枯病菌(ralstonia solanacearum)。
43.实施例1菌株y185的分离筛选及鉴定
44.1、菌株y185的分离筛选
45.2021年从新疆维吾尔自治区阿克苏地区采集土壤，取10g土样加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，静置20min后，28℃，150rpm摇床震荡30min，取1ml加入9ml无菌生理盐水中，再依次稀释101，102，103，104倍，分别取以上土壤悬浮液100μl在含有0.01％的重铬酸钾的高氏一号培养基(可溶性淀粉20g，kno
3 1g，k2hpo
4 0.5g，nacl 0.5g、mgso4·
7h2o 0.5g、feso4·
7h2o 0.01g、蒸馏水1000ml，ph7.2～7.4)平板上均匀涂板，28℃培养箱内培养5天，用无菌牙签挑取形态不一的细菌单菌落划线纯化后，保存备用，分离出共计13株放线菌。
46.采用对峙法检测放线菌的生防效果，首先将分离出的13株菌在pda平板上活化，挑取单菌落分别接种至两侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，将尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)和串珠镰刀菌(fusarium moniliforme)用5mm打孔器制作病原菌菌饼，接种于pda平皿中央，22℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照公式i)计算抑制率：
[0047][0048]
在13个菌株中初筛选出分别5株对尖孢镰刀菌(图1a)和4株对串珠镰刀菌(图1b)抑菌活性较强的放线菌进行复筛，将其单菌落分别接种至一侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，在平板中央接种一个直径5mm的尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌菌饼，22℃培养4-7天，测量病原真菌形成的扇形角度，检测放线菌的抗菌物质在平板上的扩展能力。
[0049]
经过筛选，最终选出抑菌率高(》40.0％)和抑菌物质扩散性强的菌株y185进行后续试验，菌株对尖孢镰刀菌和串珠镰刀菌的平板抑制效果如图1a、图1b和表1、表2所示，抗菌物质的扩展能力如图2a、图2b和表3、表4所示。
[0050]
表1 13株放线菌对尖孢镰刀菌的生长抑制率
[0051][0052]
表2 13株放线菌对串珠镰刀菌的生长抑制率
[0053][0054]
表3高抗尖孢镰刀菌抗菌物质的扩展能力
[0055][0056]
表4高抗串珠镰刀菌抗菌物质的扩展能力
[0057][0058]
2、菌株鉴定
[0059]
综合菌株y185的生理生化特性、分子生物学检测和看家基因串联构建系统发育树等结果，将其鉴定为疮痂病链霉菌(streptomyces scabiei)。具体如下：
[0060]
(1)菌落及菌体细胞形态特征
[0061]
菌株y185在isp 1、isp 2、isp 3、isp 4、isp 5、isp 6、isp 7、na、pda和察氏固体培养基上28℃培养10天后，在大多数培养基上形成米色或灰白色菌落，基质菌丝体呈灰白色或黄色(图3)。将无菌盖玻片斜插入平板内，接种少量y185的孢子至盖玻片一侧的基部，将插片平板倒置于28℃培养5天后取出，擦净盖玻片背面的培养基和生长较差的菌丝，放于载玻片上，显微镜下观察菌丝形态。菌丝体高度分枝且呈波浪形，菌丝的不同位点会产生小的椭圆形的分生孢子(图4)。
[0062]
(2)生理生化特性鉴定
[0063]
通过nacl、温度和ph耐受范围实验，牛奶凝固与胨化实验，bcl生化鉴定卡对碳源利用实验以及酶类活性生化实验对y185的生理生化特性进行了测定，结果如图5和表5所示，将其鉴定为链霉菌属(streptomyces)。菌株y185牛奶凝固与胨化、淀粉水解、硝酸盐还原、果胶水解、明胶液化、氧化酶、脲酶、脂酶tween 20、脂酶tween40、脂酶tween 80、七叶灵水解和h2s产生测定结果呈阳性，酪蛋白水解、木聚糖水解、纤维素水解、过氧化氢酶测定结果呈阴性，可以利用阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、木糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油、肌醇、甘露醇、山梨糖醇，不能利用棉子糖、柠檬酸、核糖醇、赤藓糖醇。在28-37℃、ph值为7条件下可以生长，nacl含量大于3.0％不能生长。
[0064]
菌株y185耐盐性、ph范围、纤维素水解特征，以及棉子糖等碳源利用特征与streptomyces scabiei标准菌株相似，但生长温度、淀粉水解、果胶水解等测定结果与标准菌株存在差异。
[0065]
表5菌株y185的生理生化检测结果
[0066][0067][0068]
注：“ ”阳性，
“–”
阴性，“nd”表示无数据。
[0069]
(3)y185多基因序列分析
[0070]
从采用细菌基因组快速提取试剂盒提取放线菌的基因组dna，用琼脂糖胶电泳检测条带后，pcr扩增16s rrna、atpd、gyrb、reca、rpob和trpb的基因序列(seq id no:1-6)。序列测序完成后用dnaman软件拼接，使用ncbi(national center for biotechnology information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库的在线blast程序进行比对分析。将5个看家基因的序列从头到尾按顺序atpd-gyrb-reca-rpob-trpb进行串联，用mega-x软件采用neighbor-joining法构建y185菌株的多基因序列系统发育树。
[0071]
结果如图6-图7所示，菌y185的16s rrna基因序列streptomyces scabiei b-16523归为统一簇群，同源性99.9％；且看家基因atpd、gyrb、reca、rpob、trpb与其标准菌株的相似性达到100％。看家基因的pcr引物见表6。
[0072]
表6看家基因的pcr引物
[0073][0074][0075]
实施例2菌株y185对植物病原真菌的抑制效果
[0076]
采用对峙培养法检测y185对11种常见植物病原真菌的抑菌谱，分别测定其对灰霉病菌(botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(alternaria solani)、小长喙霉病菌(ceratocystis fimbriata)、百合根腐病菌(fusarium oxysporum f.sp.lili)、西瓜枯萎病菌(fusarium oxysporum f.sp.niveum)、小麦纹枯病菌(rhizoctonia cerealis)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)、棉花黄萎病菌(verticillium dahliae kleb)、芹菜斑枯病菌(septoria apiicola speg)、拟轮枝样镰刀菌(fusarium rotundiformis)、炭疽病菌(colletotrichum destructivum)的抑制效果。首先将y185在pda平板上活化，挑取单菌落分别接种至两侧距平板中央2.5cm处，28℃培养5天后，将11种植物病原真菌的菌饼接种于pda平皿中央，22℃培养4-7天，分别测量对照直径和抑制直径，按照公式i)计算抑制率。
[0077]
结果表明，菌株y185具有很广的抑菌谱，对很多病原真菌都具有抑制效果，表明y185在真菌性病害的防治中具有很大的应用潜力。菌株y185对11种植物病原真菌均有一定的抑菌效果，其对小长喙霉病菌、炭疽病菌、番茄早疫病菌、水稻纹枯病菌、灰霉病菌、棉花黄萎病菌、拟轮枝样镰孢菌、百合根腐病菌、芹菜斑枯病菌和小麦纹枯病病菌共10种病原真菌表现高抑菌率(》40.0％)，抑菌率分别为76.5％、73.2％、70.3％、65.8％、63.1％、61.3％、60.4％、57.1％、55.7％和51.8％，但其对西瓜枯萎病菌表现中抑菌率(20.0％～40.0％)，抑菌率为38.7％(表7和图8)。
[0078]
表7菌株y185对植物病原真菌生长抑制
[0079][0080]
实施例3菌株y185对小麦茎基腐病温室防效
[0081]
将假禾谷镰刀菌(fusarium pseudograminearum，简写fp)菌液接入玉米面培养基中，置于28℃培养箱培养待菌丝长满(10天左右)后取出，将长满病菌的玉米面培养基与栽培基质(营养土：蛭石＝1：1，体积比)按照1：30的质量比混合均匀制成菌土；然后将y185菌株接种到pda液体培养基中，28℃、150rpm摇培5天制备y185菌液；期间，将小麦种子用纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿后，置于28℃培养箱中催芽，隔天用清水浸湿一次，培养48h左右待种子露白；挑选大小均匀且饱满露白一致的种子，将y185发酵液原液浸泡小麦种子3h后播种于装菌土的花盆中，以无菌生理盐水浸泡种子接种菌土作阴性对照，以50％多菌灵可湿性粉剂稀释500倍浸泡种子接种菌土作阳性对照，每盆播种10颗种子，每个处理6个重复，出苗后21天调查发病情况，调查病情指数和发病率并计算防治效果。
[0082]
小麦茎基腐病病情分级标准按照下面进行统计：
[0083]
0级：植株未发病；
[0084]
1级：地中茎变褐或小麦第一叶鞘表现轻微症状；
[0085]
3级：第一叶鞘变褐，但第一叶鞘未变黑；
[0086]
5级：第一叶鞘变黑或第二叶鞘变褐；
[0087]
7级：第三叶鞘变褐或小麦因发病而生长缓慢或接近死亡；
[0088]
9级：小麦植株因病死亡。
[0089][0090][0091]
小麦幼苗感染假禾谷镰刀菌出现了明显的茎基腐病发病症状，植株茎基部变褐，根部明显变短，发病率达到了100％，病情指数达到25.93。结果如图9显示，y185表现出良好的防治效果，与对照相比，y185处理组的小麦幼苗发病率显著降低了43.3％，病情指数下降为10.4，同时y185对小麦茎基腐病的防效达到了60.0％。
[0092]
实施例4菌株y185黄瓜根腐病的温室防效
[0093]
将尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum，简写fo)和串珠镰刀菌(fusariummoniliforme，
简写fm)菌液接入玉米面培养基中，置于28℃培养箱培养待菌丝长满(10天左右)后取出，将长满病菌的玉米面培养基与栽培基质(营养土：蛭石＝1：1，体积比)按照1：30的质量比混合均匀，制成菌土；将y185菌株接种到pda液体培养基中，28℃、150rpm摇培5天制备y185菌液；期间，将小麦种子用纱布包好放入大培养皿中，清水浸湿，置于28℃培养箱中催芽，隔天用清水浸湿一次，培养48h左右待种子露白；挑选大小均匀且饱满露白一致的种子，将y185发酵液原液浸泡小麦种子30min后播种于装菌土的花盆中，以无菌生理盐水浸泡种子接种菌土作阴性对照，以50％多菌灵可湿性粉剂稀释500倍浸泡种子接种菌土作阳性对照，每盆播种10颗种子，每个处理6个重复，出苗后21天调查发病情况，调查病情指数和发病率并计算防治效果。
[0094]
黄瓜根腐病病情分级标准按照下面进行统计：
[0095]
0级：无症状；
[0096]
1级：主根轻微变褐色，有侧根或茎基部或有黄色病斑，植株长势正常；
[0097]
3级：主根出现腐烂，很少侧根或茎基部有病班，植株轻微矮化，不萎蔫；
[0098]
5级：主根腐烂，无侧根或茎基部出现腐烂；植株萎蔫长势弱，植株明显矮化；
[0099]
7级：根系、茎基部完全腐烂，植株死亡。
[0100][0101][0102]
黄瓜幼苗感染尖孢镰刀菌(fo)出现了明显的根腐病发病症状，根部腐烂，植株明显矮化，发病率达到100.0％，病情指数达到72.4。结果如图10显示，菌株y185表现出良好的防治效果，与对照相比，菌株y185处理组黄瓜幼苗的病情指数下降为39.7，温室防效达到45.2％，与多菌灵处理组无显著差异。同时，感染串珠镰刀菌(fm)的黄瓜幼苗也出现了明显的根腐病发病症状，植株明显矮化且萎蔫，发病率达到100.0％，病情指数达到69.5。如图11所示，y185表现出良好的防治效果，与对照相比，菌株y185处理组黄瓜幼苗的病情指数下降为51.2，温室防效达到了26.4％，与多菌灵处理组无显著差异。
[0103]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。