过表达mrgprx2的稳转细胞株及其构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种过表达mrgprx2的稳转细胞株及其构建方法和应用。
背景技术：
2.药品应用过程中产生不良反应，是严重威胁公众健康的重要问题，过敏反应是不良反应中常见的种类，而研究发现一些药物容易引起类似过敏症状不良反应，不依赖特异性免疫机制，不需要二次或多次激发，反应发生迅速，首次用药后约30 min内即可发生，具有明显量效关系，称之为“类过敏反应”或“假过敏反应”。
3.类过敏发生机制目前研究普遍认为是由于药物作用于机体后激活了效应细胞（肥大细胞及嗜碱性细胞）表面的一些膜受体，受体通过与g蛋白偶连，进一步激活下游的信号通路，促进胞内钙离子水平升高，进而细胞脱颗粒释放组胺等介质引发过敏症状。近年来研究发现细胞表面存在的一种mrg家族基因调控的受体mrgprx2，可能是直接导致类过敏发生的作用的直接靶点，因此通过对该受体基因的进一步研究可以揭示类过敏反应的形成机制。
4.目前类过敏体外评价模型以人源或者鼠源的肥大细胞或嗜碱性细胞，如lad2、rbl-2h3、ku815等，但这些细胞只能预测类过敏发生，且类过敏反应检测灵敏度较差。
技术实现要素：
5.为解决现有技术所存在的上述缺陷，本发明提供了一种过表达mrgprx2的稳转细胞株及其构建方法和应用。经本发明构建的稳转细胞株的mrgprx2基因表达量较未转染的出发细胞明显提高，进一步地，在类过敏反应检测中具备更高的检测灵敏度。
6.为实现如上目的，本发明设计了mrprx2与大鼠细胞及小鼠细胞相关的两段基因大鼠mrprx2基因（r-mrprx2）及小鼠mrprx2基因（m-mrprx2），并将其分别插入到慢病毒质粒中，构建过表达质粒。将构建后的装载有目的基因的过表达质粒分别转染至rbl-2h3及p815细胞，使目的基因在细胞中过量表达。而后通过q-pcr对两种稳转细胞株中mrprx2基因表达量进行检测，并与未转染的出发细胞进行对比，确定稳转细胞株的构建效果。应用构建成功的稳转细胞株与出发细胞进行对比检测，采用类过敏检测指标即annexin v阳性细胞率、fluo-4am标记率、β-氨基己糖苷酶及组胺释放量反应细胞脱颗粒情况。
7.本发明第一方面提供了一种过表达mrgprx2的稳转细胞株，所述稳转细胞株为保藏编号为cctcc no:c2023150或cctcc no:c2023151的稳转细胞株。
8.本发明第二方面提供了一种过表达mrgprx2的稳转细胞株，所述mrgprx2来源于小鼠，稳转细胞株的出发细胞为p815细胞；
9.或者，所述mrgprx2来源于大鼠，稳转细胞株的出发细胞为rbl-2h3细胞；
10.所述稳转细胞株中mrgprx2表达量为出发细胞的至少60倍。
11.本发明中，来源于小鼠的mrgprx2的氨基酸序列可为ncbi登录号为np_
001030040.2的氨基酸序列，编码核苷酸序列优选为ncbi登录号为nm_001034868.3的核苷酸序列。
12.本发明中，来源于大鼠的mrgprx2的氨基酸序列可为ncbi登录号为np_001002280.1的氨基酸序列，编码核苷酸序列优选ncbi登录号为nm_001002280.1的核苷酸序列。
13.本发明中，所述稳转细胞株中mrgprx2基因表达量较佳地为出发细胞的至少65倍、至少70倍、至少75倍或至少80倍。
14.本发明第三方面提供了一种如第一方面或第二方面所述的稳转细胞株的构建方法，其包括使用所述mrgprx2的过表达质粒转染出发细胞并筛选的步骤。
15.本发明中，所述过表达质粒的骨架质粒可为plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro。
16.本发明第四方面提供了一种筛选类过敏风险药物的方法，所述方法包括：将待测药物与如第一方面或第二方面所述的稳转细胞株接触，获得检测指标结果。
17.本发明中，所述检测指标可选自细胞内钙离子水平变化，细胞胞吐程度，以及细胞脱颗粒所释放的炎症介质的释放率。
18.本发明中，所述细胞内钙离子水平变化可通过钙离子荧光探针检测，例如通过fluo-4am钙离子荧光探针检测。
19.本发明中，所述细胞胞吐程度可通过annexin v阳性率检测。
20.本发明中，所述细胞脱颗粒所释放的炎症介质的释放率可通过组胺及β-氨基己糖苷酶释放率检测。
21.本发明第四方面提供了如第一方面或第二方面所述的稳转细胞株在筛选类过敏风险药物中的应用。
22.本发明第五方面提供了如第一方面或第二方面所述的稳转细胞株在制备类过敏反应检测试剂中的应用。
23.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
24.本发明所用试剂和原料均市售可得。
25.本发明的积极进步效果在于：
26.本发明将包含大鼠及小鼠mrgprx2基因的过表达慢病毒质粒分别转染至rbl-2h3细胞及p815细胞中，筛选获得过表达mrgprx2的稳转细胞株，所得稳转细胞株可明显提高mrgprx2基因表达量的同时，还可作为新的效应细胞反映药物的类过敏反应程度，灵敏度较未转染前的出发细胞显著提高，在实际应用于类过敏风险药物的筛选时，明确验证了mrgprx2即为该类药物的作用靶点。
27.生物材料保藏信息
28.本发明的稳转细胞株mrgprx2-p815，已于2023年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctcc no:c2023150，培养物名称是mrgprx2过表达的小鼠肥大细胞瘤细胞mrgprx2-p815。
29.本发明的稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3，已于2023年5月31日保藏在中国典型培养物保藏中心（cctcc），保藏地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号为cctcc no:
c2023151，培养物名称是mrgprx2过表达的大鼠嗜碱性细胞mrgprx2-rbl-2h3。
附图说明
30.图1为plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro载体图谱。
31.图2为r-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro质粒图谱。
32.图3为r-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro质粒测序结果图。
33.图4为m-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro质粒图谱。
34.图5为m-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro质粒测序结果图。
35.图6为rbl-2h3细胞和mrgprx2-rbl-2h3细胞中r-mrgprx2基因表达量对比图，***为p＜0.001。
36.图7为p815细胞和mrgprx2-p815细胞中m-mrgprx2基因表达量对比图，***为p＜0.001。
37.图8为苯磺酸阿曲库铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞annexin v-fitc阳性率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
38.图9为苯磺酸阿曲库铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞annexin v-fitc阳性率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
39.图10为苯磺酸阿曲库铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞fluo-4am标记率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
40.图11为苯磺酸阿曲库铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞fluo-4am标记率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
41.图12为苯磺酸阿曲库铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞组胺释放量柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
42.图13为苯磺酸阿曲库铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞组胺释放量柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
43.图14为苯磺酸阿曲库铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞β-氨基己糖苷酶释放率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与
未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
44.图15为苯磺酸阿曲库铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞β-氨基己糖苷酶释放率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
45.图16为罗库溴铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞annexin v-fitc阳性率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
46.图17为罗库溴铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞annexin v-fitc阳性率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
47.图18为罗库溴铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞fluo-4am标记率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
48.图19为罗库溴铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞fluo-4am标记率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
49.图20为罗库溴铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞组胺释放量柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
50.图21为罗库溴铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞组胺释放量柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
51.图22为罗库溴铵给药后rbl-3h3及mrgprx2-rbl-2h3细胞β-氨基己糖苷酶释放率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表rbl-2h3细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
52.图23为罗库溴铵给药后p815及mrgprx2-p815细胞β-氨基己糖苷酶释放率柱状图，为单因素方差分析，与空白对照组相比，*代表p815细胞，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未标记细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01。
具体实施方式
53.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
54.类过敏反应检测指标
55.以c48/80为阳性药，设计以下三项细胞脱颗粒检测指标建立体外类过敏检测方法。
56.1、annexin v阳性细胞率
57.（1）annexin v阳性细胞率的检测目的
58.细胞膜磷脂酰丝氨酸与蛋白annexin v有很强的亲和力，annexin v蛋白能参与细胞脱颗粒胞吐转运颗粒，在fitc通道应用流式细胞仪检测annexin v阳性率，检测药物作用后胞吐脱颗粒情况。
59.（2）annexin v荧光探针来源
60.annexin v-fitc荧光探针binding buffer均来自biolegend公司。
61.（3）annexin v阳性率的检测方法
62.收集细胞后1000 r
·
min-1
离心5 min（20℃），离心后弃去废液，细胞计数后用改良台式液按照1
×
106·
ml-1
的密度制成细胞悬液，准备1.5 ml离心管若干，向每只1.5 ml离心管中加入500 μl细胞悬液后放入培养箱（37℃，5%co2）培养1-3 h。培养结束后，向离心管中加入500 μl不同浓度药物，每个给药浓度组设置3个重复组，药物作用时间为30 min。药物作用30 min后，将离心管放入碎冰中冰浴10 min终止反应，后取出离心管3000 r
·
min-1
离心5 min（4℃），离心后弃去上清液，用冷pbs（碎冰冷冻20 min）清洗细胞，去除残留的药物。再次3000 r
·
min-1
离心5 min（4℃），弃去上清液，向离心管中加入100 μl annexin v溶液（每100 μl annexin v binding buffer含5 μl fitc annexin v标记物），避光反应15 min。反应结束后将离心管放入高速冷冻离心机中3000 r
·
min-1
离心5 min（4℃），弃去上清液，再向每支离心管中加入500 μl annexin v binding buffer混悬细胞，将所得细胞悬液用流式细胞仪在fitc通道检测阳性率。
63.2、细胞钙离子浓度变化
64.（1）钙离子浓度变化的检测目的
65.钙离子浓度变化是促进胞吐作用导致细胞脱颗粒原因之一，fluo-4am是最常用的钙离子探针之一，本实验应用流式细胞仪检测fluo-4am标记率，检测细胞钙离子浓度变化情况。
66.（2）fluo-4am荧光探针来源
67.fluo-4am荧光探针来自beyotime公司。
68.（3）fluo-4am标记率检测方法
69.前期细胞处理过程及分组同annexin v阳性率的检测方法，各组分别加样后，继续在培养箱（37℃，5% co2）孵育30 min，3000 r
·
min-1
（4℃）离心5 min，去上清。用无钙的d-hanks缓冲液洗2遍，加入100 μl的fluo-4am（终浓度为5 μmol
·
l-1
）避光孵育 30 min后，3000 r
·
min-1
（4℃）离心5 min去上清，用无钙的d-hanks缓冲液洗2遍，去除残留的fluo-4am，加入500 μl无钙的d-hanks缓冲液继续孵育30 min，确保fluo-4am在细胞内完全酯化
后，在流式细胞仪fitc通道检测fluo-4am标记率。
70.3、细胞上清炎性介质释放程度
71.（1）检测目的
72.检测细胞收药物刺激后脱颗粒释放的炎性介质，肥大细胞与嗜碱性细胞脱颗粒释放介质中有些相同，例如组胺、氨基己糖苷酶、前列腺素d2（pgd2）、tnf-α等，从中选取代表性的介质组胺及氨基己糖苷酶，采用elisa方法检测加药后细胞上清物质含量的变化，可以反映颗粒释放程度。
73.（2）elisa试剂盒来源
74.his elisa kit组胺检测试剂盒来elabscience公司；rat β-hex elisa kit大鼠氨基己糖苷酶检测试剂盒及mouse β-hex elisa kit小鼠氨基己糖苷酶检测试剂盒均来自江莱生物。
75.（3）细胞上清中介质的检测方法
76.取生长状态处在对数期的细胞，细胞计数后用培养基按照1.5
×
105·
ml-1
的密度制成细胞悬液，准备若干96孔板，以每孔100 μl悬液接种，接种后板放置培养箱（37℃，5%co2）培养24-72 h。孔板中细胞密度合适时弃去。
77.加药后30 min每孔取50 μl细胞上清液，每浓度设置3-5个复孔，使用分别使用组胺及β-氨基己糖苷酶elisa试剂盒并按其说明书使用方法测定上清介质含量。进一步计算介质相对释放率：定义裂解液组为“总酶组”（细胞裂解后释放量总数），释放比率=（药物组相对浓度/总酶组相对浓度）
×
100％。
78.实施例1 稳转细胞株的构建
79.1、构建过表达质粒
80.1.1 r-mrgprx2过表达质粒的构建
81.本部分实验将r-mrgprx2基因插入到plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro载体上，载体质粒由丰晖生物提供。
82.r-mrgprx2基因序列的ncbi登录号为：nm_001002280.1。
83.（1）载体图谱
84.线性化的plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro载体图谱如图1。用bamhi-ecori完全酶切载体，1% agarose凝胶电泳回收大片段，即为线性化载体。
85.（2）酶切plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro载体
86.小提质粒plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro，用bamhi-ecori进行双酶切，酶切体系如表1所示：
87.表1
88.89.注：7℃反应5 h后1%琼脂糖凝胶回收大片段。
90.（3）获取r-mrgprx2基因片段
91.选择r-mrgprx2基因序列设计引物（r-mrgprx2-f/r为重组引物），用于构建基因亚克隆载体，序列如表2所示：
92.表2
[0093][0094]
将合成的引物稀释成终浓度为10
ꢀµ
mol/l的工作液，利用稀释的引物及模板进行pcr扩增。体系如表3所示：
[0095]
表3
[0096][0097]
将上述材料加入薄壁管内混匀并点离后放入pcr仪内，调整后最终反应程序如表4所示：
[0098]
表4
[0099][0100]
pcr结束后进行琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因。
[0101]
（4）基因片段与载体连接
[0102]
将回收纯化的目的片段与回收纯化的载体plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro连接，连接产物命名为r-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro，如图2所示。因引物包含与载体同源臂序列，使用同源重组酶将回收片段与线性化载体进行重组，完成回收目的基因与载体的重组过程。
[0103]
（5）连接产物转化感受态细胞
[0104]
取10 μl连接产物转化100 μl dh5a感受态细胞：将产物与感受态细胞混匀后冰浴
30 min，42℃热激90 s，立即置冰上放置2 min，加入预热至室温的500 μl lb培养基，180 rpm，37℃恒温摇床培养1 h，5000 rpm离心3 min，弃去500 μl培养上清，剩余100 μl用移液器混匀后均匀涂布于含50 μg/ml氨苄抗性的lb平板上，倒置，37℃恒温培养箱培养过夜。
[0105]
（5）pcr鉴定及测序
[0106]
挑取4个单菌落接种于含5 ml，50 μg/ml氨苄抗性的lb培养液中，220 rpm，37℃恒温摇床培养5 h。用培养好的菌液做pcr鉴定，鉴定挑取的菌落均正确，送r-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro测序，测序结果如图3所示。
[0107]
1.2 m-mrgprx2过表达质粒的构建
[0108]
整体步骤参考1.1，本部分实验将m-mrgprx2基因插入在plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro载体上，以下为不重复的内容。
[0109]
m-mrgprx2基因序列的ncbi登录号为：nm_001034868.3。
[0110]
（1）获取m-mrgprx2基因片段
[0111]
如表5所示，选择m-mrgprx2基因序列设计引物（m-mrgprx2-f/r为重组引物），用于构建基因亚克隆载体。
[0112]
表5
[0113][0114]
（2）基因片段与载体连接
[0115]
将回收纯化的目的片段与回收纯化的载体plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro连接，连接产物命名为m-mrgprx2-plv-cmv-mcs-ef1-zsgreen1-t2a-puro，如图4所示。质粒测序方法同实施例1，测序结果如图5所示。
[0116]
2、质粒转染细胞株流程
[0117]
本部分实验拟构建mrgprx2基因过表达稳转细胞株，使载有r-mrgprx2和m-mrgprx2基因的过表达质粒分别转染至rbl-2h3细胞和p815细胞中并稳定表达。
[0118]
rbl-2h3细胞及p815细胞均购自中国科学院细胞库（上海）。
[0119]
（1）预实验准备细胞及确定moi（感染复数）
[0120]
确定rbl-2h3细胞系和p815细胞系的相关信息，包括细胞的培养条件，细胞的增殖速度，支原体污染情况。查阅文献确定慢病毒在rbl-2h3细胞系和p815细胞系中的moi值并根据查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适moi。
[0121]
（2）筛选确定puro（puromycin，嘌呤霉素）用量
[0122]
查阅puro在rbl-2h3细胞系和p815细胞系中稳转细胞株筛选的致死用量信息，参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则将药物浓度梯度范围增大数量增多至6个）。
[0123]
第1天：将rbl-2h3细胞系和p815细胞系细胞铺于6孔板中，使细胞到第二天的密度约90%；
[0124]
第2天：将puro按设置的浓度加入细胞中；
[0125]
第4天：换液，重新加入设置浓度的puro；
[0126]
第7天：观察，找到细胞致死率100%时药物浓度最低的孔，该孔使用的药物浓度为puro筛选浓度；
[0127]
（3）稳转细胞株的筛选及构建步骤
[0128]
细胞铺板：将rbl-2h3细胞分别接种于6孔板中，使细胞在第二天的密度达到约70%左右；
[0129]
病毒感染：根据预实验确定的moi值，计算需要加入的慢病毒体积；
[0130]
换液：根据实际情况进行换液，对于一些耐受弱的细胞，就要及时进行换液；一些耐受强的细胞，则可以感染48~72 h再进行换液；
[0131]
观察感染效率：感染后72 h，观察感染效率，效率最低不应低于40%；
[0132]
puro筛选：最佳的作用时间是3-10天之间，puro常用浓度范围在1~10 μg/ml，通过预实验确定了最佳筛选浓度后，可以进行病毒感染；
[0133]
感染：感染培养72 h（感染时间根据细胞的具体情况及感染效率而定）后在6孔板中加入之前预实验确定的药物浓度；
[0134]
加puro：在6孔板中加入之前预实验确定的puro药物浓度；
[0135]
换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基，当有大量细胞死亡时，可以把puro浓度减半维持筛选；
[0136]
观察：每天观察细胞的状态，生长情况以及基因表达的水平及所占比例，直至显微镜下观察荧光细胞比例为90%以上。
[0137]
实施例2 q-pcr检验转染效果
[0138]
1、方法
[0139]
使用q-pcr技术，在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。根据荧光信号的变化能够实时检测pcr扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过ct值和标准曲线的分析就能对起始模板进行定量分析。
[0140]
（1）引物设计
[0141]
如表6所示，为基因1 r-mrgprx2的引物对信息：
[0142]
表6
[0143][0144]
如表7所示，为内参引物1的引物对信息：
[0145]
表7
[0146][0147]
如表8所示，为基因2 m-mrgprx2的引物对信息：
[0148]
表8
[0149][0150]
如表9所示，为内参引物2的引物对信息：
[0151]
表9
[0152][0153]
（2）rna提取
[0154]
向有细胞株的1.5 ml离心管中加入1000 μl trizol，充分混匀后，然后加入200 μl氯仿，震荡混匀后，静置5 min，在12000 rpm，4℃离心10 min。从离心机中取出1.5 ml离心管，再将上层无色透明的水相层吸入到另一干净的1.5 ml离心管中（样品会分为三层：下层有机相层，中间层和上层的水相层，rna位于上层水相中）。加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀之后，静置10 min，再12000 rpm，4℃离心10 min。离心之后可在离心管壁或管底看到胶状沉淀出现，沉淀就是要提取的rna。小心弃去上清，用1ml 75％乙醇对rna沉淀进行洗涤。然后于4℃ 7000 rpm离心5 min，将上清尽量去除干净。
[0155]
室温静置干燥，大约干燥5~10 min。所有离心管中加入25 μl的depc h2o，用枪头吹打几次，使rna充分溶解，-80℃保存。
[0156]
rna浓度检测：使用核酸蛋白检测仪检测rna浓度。
[0157]
（3）rna浓度及纯度测定：
[0158]
如表10所示，为不同细胞株中所提取的rna浓度：
[0159]
表10
[0160][0161]
（4）逆转录pcr
[0162]
按表11中的组份分别配制逆转录反应液：
[0163]
表11
[0164][0165]
在pcr仪上进行以下反应：72℃，5 min，然后置于冰上急冷。
[0166]
在上述pcr管中加入如表12所示的逆转录反应液（总计20 μl）：
[0167]
表12
[0168][0169]
在pcr仪上按以下条件进行反转录反应：42℃ 60min，72℃ 10min。
[0170]
cdna立刻进行实验或者置于4℃保存。
[0171]
（5）实时荧光定量pcr反应
[0172]
反应体系的配置如表13所示：
[0173]
表13
[0174][0175]
反应条件设置如表14所示：
[0176]
表14
[0177][0178]
扩增程序如表15所示：
[0179]
表15
[0180][0181]
熔解程序如表16所示：
[0182]
表16
[0183][0184]
2、结果
[0185]
（1）mrgprx2-rbl-2h3细胞对比rbl-2h3细胞q-pcr检测结果
[0186]
q-pcr检测出的r-mrgprx2基因表达量的检测结果对比见图6，可知转染后的细胞株中目标基因的表达量相比原细胞有显著性差异（p＜0.001），证明r-mrgprx2过表达稳转细胞株基本建立成功，简称为mrgprx2-rbl-2h3，于2023年5月31日提交中国典型培养物保藏中心（cctcc）保藏，保藏编号为cctcc no:c2023151。
[0187]
（2）mrgprx2-p815细胞对比p815细胞q-pcr检测结果
[0188]
q-pcr检测出的m-mrgprx2基因表达量的检测结果对比见图7，可知转染后的细胞
株中目标基因的表达量相比原细胞有显著性差异（p＜0.001），证明m-mrgprx2过表达稳转细胞株基本建立成功，简称为mrgprx2-p815，于2023年5月31日提交中国典型培养物保藏中心（cctcc）保藏，保藏编号为cctcc no:c2023150。
[0189]
效果实施例1 苯磺酸阿曲库铵类过敏反应检测
[0190]
1、药物作用浓度
[0191]
选择的药物作用浓度如表17所示：
[0192]
表17 用于细胞脱颗粒对比检测的细胞及药物
[0193][0194]
2、苯磺酸阿曲库铵给药后细胞annexin v阳性率对比检测结果
[0195]
由表18数据可见mrgprx2-rbl-2h3细胞给药后annexin v阳性率的变化趋势同rbl-2h3细胞，即相比空白细胞组，阳性药c48/80、阿曲库铵mrgprx2-rbl-2h3细胞在同等药物作用浓度下给药后annexin v阳性率变化程度均有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01），推测给药后胞吐作用增强，细胞脱颗粒现象增强。由图8可知mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-2h3细胞给药后annexin v阳性率的对比结果，在空白细胞组、阳性药c48/80、阿曲库铵药物组mrgprx2-rbl-2h3细胞的annexin v阳性率均高于rbl-2h3细胞，且变化程度有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01）。
[0196]
药物作用后p815及mrgprx2-p815细胞的annexin v阳性率变化如表18及图9，结果规律类似于mrgprx2-rbl-2h3细胞。
[0197]
结果证明，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测annexin
·
v阳性率即细胞胞吐情况反映类过敏风险，阿曲库铵给药后过表达稳转细胞株胞吐作用较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是阿曲库铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0198]
表18 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的annexin v阳性率
[0199][0200]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未转染细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0201]
3、苯磺酸阿曲库铵给药后细胞钙离子水平变化对比检测结果
[0202]
由表19数据可见mrgprx2-rbl-2h3细胞给药后fluo-4am标记率的变化趋势同rbl-2h3细胞，即相比空白细胞组，阿曲库铵给药后mrgprx2-rbl-2h3细胞在同等药物作用浓度下fluo-4am标记率变化程度均有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01），推测给药后钙离子水平升高，促使细胞脱颗粒现象增强。由图10可知mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-2h3细胞给药后
fluo-4am标记率的对比结果，在空白细胞组、阳性药c48/80、阿曲库铵药物组mrgprx2-rbl-2h3细胞的fluo-4am标记率均高于rbl-2h3细胞，且变化程度有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01）。
[0203]
药物作用后p815及mrgprx2-p815细胞的fluo-4am标记率变化如表19及图11，结果规律类似于mrgprx2-rbl-2h3细胞。
[0204]
结果证明，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测fluo-4am标记率即细胞钙离子水平情况显示细胞脱颗粒的程度，进而反映类过敏风险，阿曲库铵给药后过表达稳转细胞株钙离子水平较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是阿曲库铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0205]
表19 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的fluo-4am标记率
[0206]
[0207]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未转染细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0208]
4、苯磺酸阿曲库铵给药后细胞上清炎性介质释放程度
[0209]
由表20及表22数据可见mrgprx2-rbl-2h3细胞给药后组胺及β-氨基己糖苷酶的变化趋势同rbl-2h3细胞，即相比空白细胞组，阿曲库铵给药后mrgprx2-rbl-2h3细胞在同等药物作用浓度下细胞上清中炎性介质变化程度均有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01），推测给药后细胞释放的介质增多，细胞脱颗粒水平升高。由图12及图14可知mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-2h3细胞给药后炎性介质水平变化的对比结果，在空白细胞组、阳性药c48/80、阿曲库铵药物组mrgprx2-rbl-2h3细胞的炎性介质变化相比原细胞有显著性差异（p＜0.05或p＜0.01）。
[0210]
药物作用后p815及mrgprx2-p815细胞的组胺及β-氨基己糖苷酶释放率变化如表21、表23、图13及图15，结果规律类似于mrgprx2-rbl-2h3细胞。
[0211]
结果证明，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测组胺及β-氨基己糖苷酶释放率即细胞上清中炎性介质释放水平显示细胞脱颗粒的程度，进而反映类过敏风险，阿曲库铵给药后过表达稳转细胞株介质释放程度较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是阿曲库铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0212]
表20 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的组胺释放量
[0213][0214]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜
0.01；结果以表示，n=3。
[0215]
表21 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的组胺释放量
[0216][0217]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表p815细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与p815细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0218]
表22 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的β-氨基己糖苷酶释放率
[0219]
[0220]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-2h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0221]
表23 苯磺酸阿曲库铵给药后细胞的β-氨基己糖苷酶释放率
[0222][0223]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表p815细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与p815细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0224]
效果实施例3 罗库溴铵类过敏反应检测
[0225]
1、药物作用浓度
[0226]
选择的药物作用浓度如下表24。
[0227]
表24 用于细胞脱颗粒对比检测的细胞及药物
[0228][0229]
2、罗库溴铵给药后细胞annexin v阳性率对比检测结果
[0230]
由表25数据及图16-17可见，罗库溴铵给药后的变化类似于示例一苯磺酸阿曲库
铵的检测结果，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测annexin v阳性率即细胞胞吐情况反映类过敏风险，罗库溴铵给药后过表达稳转细胞株胞吐作用较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是罗库溴铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0231]
表25 罗库溴铵给药后细胞的annexin v阳性率
[0232][0233]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未转染细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0234]
3、罗库溴铵给药后细胞钙离子水平变化对比检测结果
[0235]
由表26数据及图18-19可见，罗库溴铵给药后的变化类似于示例一苯磺酸阿曲库铵的检测结果，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测fluo-4am标记率即细胞钙离子水平情况显示细胞脱颗粒的程度，进而反映类过敏风险，阿曲库铵给药后过表达稳转细胞株钙离子水平较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是阿曲库铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0236]
表26 罗库溴铵给药后细胞的fluo-4am标记率
[0237][0238]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2细胞与未转染细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0239]
4、罗库溴铵给药后细胞上清炎性介质释放程度
[0240]
由表27-30数据及图20-23可见，罗库溴铵给药后的变化类似于示例一苯磺酸阿曲库铵的检测结果，结果规律类似于mrgprx2-rbl-2h3细胞。结果证明，本发明构建的基于两个过表达稳转细胞株mrgprx2-rbl-2h3及mrgprx2-p815均可以通过检测组胺及β-氨基己糖苷酶释放率即细胞上清中炎性介质释放水平显示细胞脱颗粒的程度，进而反映类过敏风险，阿曲库铵给药后过表达稳转细胞株介质释放程度较原细胞株增加，此指标证明mrgprx2稳转细胞株更适合作为此类药物类过体外检测，并且mrgprx2可能是阿曲库铵类过敏反应产生的药物靶点。
[0241]
表27 罗库溴铵给药后细胞的组胺释放量
[0242][0243]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表rbl-2h3细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-rbl-2h3细胞与rbl-3h3细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0244]
表28 罗库溴铵给药后细胞的组胺释放量
[0245][0246]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表p815细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与p815细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0247]
表29 罗库溴铵给药后细胞的β-氨基己糖苷酶释放率
[0248][0249]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表p815细胞与空白对照组相比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与p815细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0250]
表30 罗库溴铵给药后细胞的β-氨基己糖苷酶释放率
[0251][0252]
注：统计方法：单因素方差分析/独立样本t检验，*代表p815细胞与空白对照组相
比，*为p＜0.05，**为p＜0.01；a代表mrgprx2-p815细胞与空白对照组相比，a为p＜0.05，aa为p＜0.01；#代表mrgprx2-p815细胞与p815细胞相比，#为p＜0.05，##为p＜0.01；结果以表示，n=3。
[0253]
综上所述，本发明实施例1的稳转细胞株所获得的技术效果如下：
[0254]
（1）通过q-pcr检测，本发明稳转细胞株中mrgprx2基因表达量较转染前的出发细胞提高至少60倍；
[0255]
（2）以fluo-4am标记率、annexin v阳性率、组胺及β-氨基己糖苷酶释放率作为检测指标，这些指标可以涵盖药物刺激膜受体后类过敏反应的全过程；结果显示，在相同药物的刺激作用下，本发明的稳转细胞株如上指标较未转染前的出发细胞更为显著；
[0256]
（3）以药物c48/80作为代表阳性药物，并选用两种肌松药类的麻醉剂，顺苯磺酸阿曲库铵和罗库溴铵作为示例，结合如上指标的检测结果，本发明的稳转细胞株可实际应用于类过敏风险药物的筛选，尤其是肌松药类药物的筛选。