一种银杏myc2转录因子及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种银杏myc2转录因子及其编码基因与应用。
背景技术：
2.干旱是我国作物减产的主要因素，干旱条件下植物组织水分亏缺影响了营养物质的吸收和运输，导致各组织营养物质浓度的下降。植物体内的耐旱基因主要分为两种，其中一种为功能蛋白基因，如编码渗透调节物质相关的基因；另一种为对耐旱基因表达起调控作用的转录因子，如dreb等。转录因子的调控具有明显效果，目前已经报道有多个植物转录因子用于调控抗旱，如专利201010161188.x公开了水稻锌指蛋白转录因子新基因及抗旱耐盐应用；专利202210026086.x公开了一种提高山新杨抗旱性的myb转录因子及其应用；专利201910627653.5公开了一种能提高烟草抗旱的转录因子ntmyb44b及其定点突变方法与应用；专利201811421792.4公开了黄连sdir转录因子在提高植物抗旱中的应用；在多种植物中都发现了抗旱转录因子，但是，在银杏中目前还未发现能抗旱的转录因子。
3.虫灾也是我国作物减产的主要因素，烟粉虱是一种世界性的害虫，烟粉虱属渐变态昆虫，其个体发育分卵、若虫、成虫3个阶段。若虫3龄，通常将第3龄若虫蜕皮后形成的蛹称伪蛹或拟蛹。成虫主要寄生于叶背面，体淡黄白色，翅2对，白色，被蜡粉无斑点，比温室白粉虱小。烟粉虱对不同的植物表现出不同的危害症状，叶菜类如甘蓝、花椰菜受害叶片萎缩、黄化、枯萎；根菜类如萝卜受害表现为颜色白化、无味、重量减轻；果菜类如番茄受害，果实不均匀成熟。烟粉虱有多种生物型。据在棉花、大豆等作物上的调查，烟粉虱在寄主植株上的分布有逐渐由中、下部向上部转移的趋势，成虫主要集中在下部，从下到上，卵及1-2龄若虫的数量逐渐增多，3-4龄若虫及蛹壳的数量逐渐减少。寻找抗烟粉虱的植物基因，利用植物自身抵抗烟粉虱，减少农药使用，对于绿色农业发展意义重大。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种银杏myc2转录因子及其编码基因与应用。
5.一种银杏myc2转录因子，所述myc2转录因子的氨基酸序列如序列表seq id no：1所示。
6.所述myc2转录因子的基因序列如序列表seq id no：2所示。
7.含所述myc2转录因子基因的载体。
8.含所述myc2转录因子基因的载体的宿主菌。
9.扩增所述的myc2转录因子基因中任一片段的引物。
10.银杏myc2转录因子在植物抗逆中的应用。
11.所述抗逆为抗旱。
12.银杏myc2转录因子在植物抗虫中的应用。
13.本发明的有益效果：本发明在银杏叶片中克隆到一个转录因子基因gbmyc2，将其
转入模式植物拟南芥，通过干旱和烟粉虱胁迫实验，发现其具有一定的抗旱和抗虫的功能，为开发抗旱和抗虫植物新品种打下理论基础。
附图说明
14.图1为pbi121-gbmyc2植物表达载体结构示意图。
15.图2为wt、l13、l29、l33基因型拟南芥在干旱胁迫下的表型。
具体实施方式
16.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
17.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
18.实施例1
19.以银杏叶片作为材料，提取其总rna并反转录成cdna。使用trizol法(invitrogen公司)进行银杏叶材料rna提取；使用dnase i试剂盒(promega公司)对rna中dna的消化处理；使用m-mlv reverse transcriptase试剂盒(promega公司)将rna反转录为cdna。rna提取、dna消化处理及rna反转录步骤参考相关公司说明书。
20.根据ncbi https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/wfd53488.1公布的银杏myc2转录因子基因序列，设计带有酶切位点xbai和kpni引物，扩增myc2转录因子基因序列。
21.myc2引物f：tgctctagaatggccgaacaaaccc；
22.myc2引物r：tcgcggtacctcaaatactaggatc。
23.以上述cdna为模板扩增获得全长gbmyc2基因并将其克隆到pmd18-t载体上。用xbai和kpni分别酶切含有全长gbmyc2的pmd18-t载体以及pbi121空载体，并将gbmyc2连入pbi121，最终获得pbi121-gbmyc2植物表达载体(图1)，将pbi121-gbmyc2植物表达载体转入农杆菌，-20℃条件下保存。
24.实施例2
25.将-20℃保存的含有目的基因重组质粒的农杆菌菌液接种于10ml yeb液体培养基(含80mg/l rif、120mg/l str和150mg/l kan)中，28℃，200rpm活化2d；按1：100比例取2.5ml菌液接种于250ml yeb液体培养基(含80mg/lrif、120mg/l str和150mg/l kan)中，28℃200rpm过夜培养至od600为1.2-1.6；5,000rpm离心10min收集菌体，将菌体重悬于500ml 5％蔗糖溶液中，混匀后转入转化杯中作为转化液待用；待转化的拟南芥前2天浇透水，去掉已结荚，将拟南芥倒置于转化杯中，轻轻摇动转化液，浸染30s后将植株移出，抖去多余转化液，用保鲜膜包好，侧置于托盘中，避光1d。
26.取出4℃冰箱中已春化处理好的转基因拟南芥t0代种子和野生型种子，分别均匀地播撒在灭菌的营养土表面，覆膜；待种子萌发后，去掉保鲜膜。再过一周，待真叶长出时，喷洒basta除草剂(10％的basta母液自来水稀释10000倍)，野生型的拟南芥喷洒同样浓度的basta除草剂以及自来水分别作为对照，一天喷洒两次。一周后观察筛选效果：野生型及非阳性苗逐渐黄化、生长停滞，而阳性苗则叶片翠绿，如同喷洒自来水的野生型拟南芥一样
正常生长；将阳性苗转移至新灭菌的营养土中培养，记作t1代，待植株长出较多叶片时，取叶片提取dna进行pcr分子鉴定。
27.将pcr鉴定阳性的转基因拟南芥上收获的种子继续种植进行加代扩繁。对每代拟南芥单株都进行pcr鉴定，并对阳性植株进行自交，在t3代检测到3个转基因拟南芥纯合株系，分别为gbmyc2-13(l13)、gbmyc2-29(l29)、gbmyc2-33(l33)。
28.wt、l13、l29、l33基因型拟南芥在土壤正常生长4周后停止浇水10天，使其自然干旱，在正常的生长状态下4种基因型的生长状态相似、无明显差异。当干旱胁迫降临时，与wt植株相比，l13、l29、l33基因型拟南芥植株均长势良好、叶片繁茂(图2)。
29.测定wt、l13、l29、l33基因型拟南芥在干旱前后含水量的变化，测定结果如表1所示：
30.表1
[0031][0032]
注：*代表与wt组比较p《0.05。
[0033]
将干旱后野生型拟南芥和转基因拟南芥株系l13、l29、l33的100mg叶片分别研磨成细粉。可溶性糖含量测定利用植物可溶性糖含量试剂盒(a145)；总蛋白含量采用总蛋白定量试剂盒(a045-2)；pod活性的测定使用过氧化物酶试剂盒(a084-3)。
[0034]
采用spss 24.0软件进行统计学分析，计量资料结果用(均数士标准差)表示，采用kolmogorov-smirnov检验法进行数据正态性检验，对于符合正态分布数据，两组间均值差异比较采用t检验，以p《0.05为差异具有统计学意义。
[0035]
测定结果见表2：
[0036]
表2
[0037][0038]
[0039]
注：*代表与wt组比较p《0.05。
[0040]
实施例3
[0041]
实验所用烟粉虱为bemisiatabaci meam1(mtcoi，genbank编号为mf579701)为中国科学院微生物研究所赠与，烟粉虱饲养在养虫笼中，以棉花为寄主植物生长繁殖，湿度65％，光照周期为12h光照/12h黑暗。
[0042]
首先将野生型拟南芥、l13、l29、l33拟南芥植株在培养皿上生长21天，然后将其移至土壤中生长14天，采用叶笼法做烟粉虱生测实验：烟粉虱产卵实验中，将3头雌虫和3头雄虫放入叶笼中，10天后统计卵的数量。烟粉虱伪蛹发育的实验中，将16头雌虫放入叶笼中，待雌虫产卵量2天之后，将烟粉虱成虫全部移除，留下卵在叶笼中继续发育；20天后统计伪蛹数。每个株系8株，实验重复3次，结果取平均值。
[0043]
采用spss 24.0软件进行统计学分析，计量资料结果用(均数士标准差)表示，采用kolmogorov-smirnov检验法进行数据正态性检验，对于符合正态分布数据，两组间均值差异比较采用t检验，以p《0.05为差异具有统计学意义。
[0044]
测定结果如表3所示：
[0045]
表3
[0046][0047][0048]
注：*代表与wt组比较p《0.05。
[0049]
由表3可以看出，与野生型拟南芥相比，l13、l29、l33拟南芥植株上烟粉虱的产卵量和伪蛹数显著减少。这说明转gbmyc2拟南芥植株的抗虫能力得到显著提高，表明gbmyc2基因表达提高植物抗虫性。
[0050]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。