gpbhlh101基因在镉胁迫响应和萜类物质积累中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术领域。更具体地说，本发明涉及gpbhlh101基因在镉胁迫响应和萜类物质积累中的作用。
背景技术：
2.绞股蓝gynostemma pentaphyllum(thunb.)makino是葫芦科绞股蓝属(gynostemma blume)多年生草质藤本植物，其主要的药理活性成分为绞股蓝皂苷，即三萜类皂苷。绞股蓝皂苷中含有与人参皂苷类似骨架的达玛烷型结构，有“南方人参”之称，是一种更为经济的能够合成人参皂苷类物质的植物资源。尽管目前已有绞股蓝萜类物质生物合成关键酶的相关报道，如鲨烯合成酶(squalene synthase,ss)、鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,se)、法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthetase,fps)等，有关绞股蓝萜类物质的转录调控机制仍不清楚。
3.植物为应对重金属的毒害作用已逐渐进化出多种重金属胁迫耐受机制。植物通过吸收、排出、螯合和转运重金属离子等方式，维持体内金属离子的稳态，从而降低重金属离子毒性。研究表明，重金属能使植物次生代谢物积累发生改变。薛晓丽等研究发现重金属胁迫对人参皂苷积累有明显的抑制作用；朱美霖等研究发现高质量分数的镉能抑制三七皂苷合成过程中关键酶基因的表达。生产上绞股蓝重金属超标问题十分突出。李莹等研究发现，镉胁迫可导致绞股蓝植株矮小，生物量下降，并出现叶片枯黄、萎缩现象。然而，有关绞股蓝响应镉胁迫的转录调控机制研究尚未开展。
技术实现要素：
4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明的一个目的是提供一种gpbhlh101基因在镉胁迫响应和萜类物质积累中的应用，其能够提高植物对镉胁迫的耐受度，并在镉胁迫下，提高植物中萜类物质的累积。
6.为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种绞股蓝gpbhlh101基因在增强植物镉胁迫耐受以及在镉胁迫下提高萜类物质累积中的应用。
7.优选的是，绞股蓝gpbhlh101基因在增强植物镉胁迫耐受以及在镉胁迫下提高萜类物质累积中的应用，包括以下步骤：
8.1)克隆gpbhlh101基因；
9.2)构建重组质粒pbi121-gpbhlh101，并将重组质粒转化至根癌农杆菌gv1301，采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化，侵染花序后的拟南芥连续培养后收种，记为t0；
10.3)对t0种子进行消毒和春化，将春化后的种子铺板于含kana的1/2ms固体培养基上，将真叶长出且根系正常伸长的幼苗进行移栽；
11.4)待幼苗长出6～8片叶时，剪取叶片0.15～0.2g，用液氮速冻后置于组织研磨仪中研磨，研磨成粉末后保存于超低温冰箱中；
12.5)对研磨粉末进行rna提取、反转录及qpcr检测，以atactin8作为内参基因，检测
野生型及转基因植株的表达量，筛选高表达量的拟南芥t1代株系，即得。
13.优选的是，克隆gpbhlh101基因所用引物为：
14.gpbhlh101-f1：atgttggcagtatcctctcctttat；
15.gpbhlh101-r1：tcatataaaaccagaagtttcagtaacca。
16.优选的是，克隆gpbhlh101基因的扩增体系为：
[0017]2×
rapid taq master mix 25μl；dna模板2μl；上游引物、下游引物各2μl；超纯水19μl。
[0018]
优选的是，克隆gpbhlh101基因的扩增程序为：94℃30min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，循环35次；72℃5min。
[0019]
优选的是，消毒和春化方法为：t0种子置于75％乙醇中处理30s；25％次氯酸钠中处理10min，离心机中离心，转速6000rpm，时间30s；无菌水中洗4～5次，每次洗后离心转速6000rpm，时间30s；最后加入种子体积1倍以上的无菌水，置于4℃冰箱中72h，进行拟南芥种子的春化。
[0020]
优选的是，构建重组质粒pbi121-gpbhlh101所用引物为：
[0021]
gpbhlh101-f3：catttacgaacgatactcgagatgttggcagtatcctctcctttat；
[0022]
gpbhlh101-r3：caccatcactagtacgtcgactataaaaccagaagtttcagtaaccaaa。
[0023]
本发明至少包括以下有益效果：
[0024]
第一、本发明首次明确了转gpbhlh101基因拟南芥植株在镉胁迫条件下表现出较低的根伸长能力及较高的生物量积累能力，并且其叶片枯萎及死亡率显著小于野生型(wt)，表明转基因植株地下部分对镉胁迫较为敏感，而地上部分对镉胁迫的耐受能力较高，其机制可能与过表达gpbhlh101基因导致镉向地上部分的转运减少有关。
[0025]
第二、本发明首先明确了镉胁迫显著提高转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量。但镉处理24h时转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量显著低于wt，推测较低表达量的atpcr1引起转基因植株地下部分对镉更为敏感，从而导致镉对转基因植株根生长的抑制作用显著高于wt。
[0026]
第三、本发明首次明确了镉胁迫168h后转gpbhlh101基因植株中atmtp1和athma3的表达量显著高于wt，推测过表达gpbhlh101基因有利于增强液泡对镉的区室化阻隔，从而提高植株对镉的耐性。
[0027]
第四、本发明首次明确了过表达gpbhlh101基因能够提高拟南芥atsqe1、atsqs1、atfps1及atβ-as的表达量，镉处理168h后转基因植株中atβ-as的表达量显著高于wt植株，推测过表达gpbhlh101基因可能有利于萜类物质生物合成，通过刺激次生代谢物积累响应镉胁迫。
[0028]
第五、本发明探究了gpbhlh101基因的部分功能，为绞股蓝中bhlh类转录因子萜类物质的转录调控机制研究及绞股蓝种质资源的改善提供了一定的理论基础。
[0029]
第六、本发明对绞股蓝bhlh类转录因子进行克隆，分析其组织表达特异性及非生物胁迫响应规律，并将gpbhlh101在拟南芥中过表达，研究其在镉胁迫响应及次生代谢产物积累中的作用。发明成果可为后续利用基因工程手段进行高产及抗逆种质筛选提供科学依据。
[0030]
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本
发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0031]
图1为本发明gpbhlh101基因的pcr扩增凝胶电泳检测图；
[0032]
图2为本发明对pcr扩增产物进行dna纯化回收的凝胶电泳检测图；
[0033]
图3为本发明菌液pcr产物经凝胶电泳检测图；
[0034]
图4为本发明对绞股蓝gpbhlh101基因的表达规律进行分析结果图；
[0035]
图5为本发明pcr检测转gpbhlh101拟南芥的凝胶电泳图；
[0036]
图6为本发明转基因拟南芥不同株系的表达量检测结果图；
[0037]
图7为本发明水培条件下wt及转基因拟南芥的生长情况；
[0038]
图8为镉胁迫处理前后wt及转基因拟南芥的生长情况；
[0039]
图9包括9-1和9-2，为wt及转基因植株中镉响应基因、萜类物质合成关键基因的表达量分析。
具体实施方式
[0040]
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0041]
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0042]
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0043]
《试验方法》
[0044]
一、基因克隆
[0045]
依据已有的绞股蓝三代全长转录组数据，采用rt-pcr的方法对绞股蓝中的bhlh类转录因子gpbhlh101基因进行克隆。实验步骤如下：
[0046]
①
使用特异性引物进行pcr扩增。
[0047]
②
对pcr产物进行凝胶电泳检测，对目的片段进行切胶。
[0048]
③
切胶产物的纯化回收。
[0049]
④
胶回收产物与pmd19-t载体连接。
[0050]
⑤
用热激法将连接产物转入dh5α感受态细胞。
[0051]
⑥
在已加入抗生素的lb固体培养基上(100ml lb加入100μl amp和200μl x-gal)涂布培养单菌落，在37℃，220rpm下摇菌12～16h。
[0052]
⑦
挑取单菌落，转入含lb液体培养基的1.5ml离心管中，在37℃，220rpm下摇菌6h。
[0053]
⑧
进行菌液pcr扩增。
[0054]
⑨
凝胶电泳检测是否为阳性菌，取阳性菌液送测，获取基因核苷酸序列。
[0055]
基因克隆引物序列见表1，基因克隆pcr扩增体系见表2，基因克隆pcr扩增程序见表3；菌液pcr扩增体系见表4，菌液pcr扩增程序见表5。
[0056]
表1基因克隆所用引物序列
[0057][0058]
表2基因克隆pcr扩增体系
[0059][0060]
表3基因克隆pcr扩增程序
[0061][0062]
表4菌液pcr扩增体系
[0063][0064]
表5菌液pcr扩增程序
[0065][0066][0067]
二、基因表达规律分析
[0068]
(一)实验材料准备
[0069]
将绞股蓝种子在铺有湿润滤纸的培养盒中进行催芽，萌发幼苗高为3～4cm时，移栽至珍珠岩中。当幼苗长出3～5片叶时进行镉胁迫处理。试验所用氯化镉浓度为100μmol/l，共8种处理方式，分别为处理0h、3h、6h、12h、24h、72h、120h和168h。取无镉处理组的根、茎、叶、叶柄共4个样品；100μmol/l氯化镉处理3h、6h、12h、24h、72h、120h和168h的叶片，共7个样品。每份样品重量为0.2～0.3g，液氮速冻后置于组织研磨仪中，60hz、2min条件下研磨。研磨后迅速取出，保存于超低温冰箱中用于下一步实验。
[0070]
(二)荧光定量pcr检测
[0071]
参照诺唯赞eastep super总rna提取试剂盒(ls1040)说明书、hiscript iii rt supermix for qpcr( gdna wiper)说明书的步骤，对上述样品进行rna提取、反转录。反转录后的cdna稀释至原体积的三倍。参照诺唯赞chamq universal sybr qpcr master mix(q711)说明书，使用sybr greenⅰ嵌合荧光法进行qpcr反应。所用引物序列见表6，qpcr反应体系见表7，qpcr反应程序见表8。反应结果后记录cq值，以gpubc-e2作为内参，采用2
‑△△
ct
法计算基因相对表达量。
[0072]
表6荧光定量pcr检测所用引物序列
[0073][0074]
表7荧光定量pcr反应体系
[0075][0076]
表8荧光定量pcr反应程序
[0077][0078][0079]
三、gpbhlh101基因功能分析
[0080]
(一)载体构建、遗传转化及转基因拟南芥t1代获取
[0081]
采用同源重组的方法，将gpbhlh101基因连接至植物双元表达载体pbi121-egfp载体(所用引物见表9)。将重组质粒pbi121-gpbhlh101转化至根癌农杆菌gv1301，采用花序侵染法进行拟南芥遗传转化。侵染花序后的拟南芥连续培养2个月后收种，记为t0。
[0082]
对t0种子进行消毒和春化，具体方法为：75％乙醇中处理30s；25％次氯酸钠中处理10min，离心机中离心6000rpm、30s；无菌水中洗4～5次，每次洗后离心6000rpm、30s；最后加入种子体积1倍或稍大于1倍的无菌水，置于4℃冰箱中72h，进行拟南芥种子的春化。将春化后的种子铺板于含50mg/l kana的1/2ms固体培养基上，于第12d将真叶长出且根系正常伸长的幼苗进行移栽。待幼苗长出6～8片叶时，剪取叶片0.15～0.2g，用液氮速冻后置于组织研磨仪中，60hz、2min条件下研磨，研磨成粉末后保存于超低温冰箱中。按照前述方法进行rna提取、反转录及qpcr检测。以atactin8作为内参基因，检测野生型(wt)及转基因植株的表达量，筛选高表达量的拟南芥t1代株系，连续培养2个月后收种，用于后续实验。
[0083]
表9载体构建所用引物序列
[0084][0085]
(二)水培及镉胁迫处理
[0086]
将wt和转gpbhlh101基因拟南芥t1种子进行消毒及春化，方法同上。用移液枪将春化后的种子铺在含或不含50mg/l kana的1/2ms固体培养基平板上。约1～2周种子萌发且长出绿色真叶时，参照赵淑清等的方法(赵淑清，郭剑波.一种简单快速的拟南芥水培方法的研究[j].生物学杂志，2000(06):22-23)，将幼苗移栽至1/4霍格兰营养液中(ph值为5.8)进行水培。培养条件为：光照度120μmol/m2/s，温度22
±
1℃，光周期12h/12h，相对湿度50％左右。培养期间2～3天更换一次营养液。
[0087]
水培30d后，对wt和转gpbhlh101基因拟南芥进行镉胁迫处理。具体方法为：在1/4霍格兰营养液中加入50μmol/l氯化镉，调整ph为5.8。将wt和转gpbhlh101基因拟南芥幼苗转移至含或不含氯化镉的1/4霍格兰营养液中进行培养，培养期间2～3天更换一次营养液。
[0088]
(三)镉胁迫对野生型及转基因植株生长的影响
[0089]
在镉胁迫处理期间，比较转gpbhlh101基因拟南芥和wt植株在表型、生物量、根生长方面的变化情况。具体方法为：
[0090]
①
记录镉胁迫处理第96h和第168h的植株形态特征。
[0091]
②
测定镉胁迫处理0h、168h的植株生物量及根长变化。根相对伸长率按以下公式计算：
[0092]
根相对伸长率＝[(处理后根的长度-处理前根的长度)/处理前根的长度]
×
100％
ꢀꢀ
(1)
[0093]
(四)qpcr检测镉胁迫下镉响应基因表达量的变化
[0094]
分别对镉处理0h、24h、168h的wt和转gpbhlh101基因拟南芥叶片进行采样，每管叶片重0.15～0.2g，液氮速冻后置于组织研磨仪中，60hz、2min条件下研磨成粉末，保存于超低温冰箱中备用。
[0095]
按照上述方法进行rna提取、反转录成及qpcr检测。以atactin8作为内参基因，检测镉处理0h、24h、168h的wt和转gpbhlh101拟南芥叶片中atnas4、atpcr1、atnramp3、atmtp1、atmtp3、athma3的相对表达量。相对表达量的计算采用2-δδct
法，引物序列见表10。
[0096]
表10镉胁迫响应基因qpcr检测所用引物序列
[0097]
[0098][0099]
(五)qpcr检测镉胁迫下萜类物质合成关键基因的表达量变化
[0100]
以atactin8作为内参基因，检测镉处理0h、24h、168h的wt和转gpbhlh101基因拟南芥叶片中atsqe1、atsqs1、atfps1、atβ-as的相对表达量。相对表达量的计算采用2-δδct
法，引物序列见表11。
[0101]
表11萜类物质合成关键基因qpcr检测所用引物序列
[0102][0103]
《试验结果》
[0104]
一、绞股蓝基因克隆与序列分析
[0105]
1、pcr扩增产物的凝胶电泳检测
[0106]
采用特异性引物对gpbhlh101基因进行pcr扩增，对扩增后得到的产物进行凝胶电泳检测，获得与预期条带一致的条带(见图1)。
[0107]
2、dna纯化回收及凝胶电泳检测
[0108]
对pcr产物进行dna纯化回收，对回收产物进行凝胶电泳检测，结果如图2所示。由图2可知，dna纯化后gpbhlh101基因均在对应长度显示出条带，表明dna纯化回收成功。
[0109]
3、菌液pcr产物的凝胶电泳检测
[0110]
菌液pcr产物经凝胶电泳检测，结果见图3。从图中可以看出，菌液均检测出阳性克隆。将阳性克隆进行送测，用于获取相应基因的核苷酸序列。
[0111]
4、核苷酸序列及编码氨基酸数量
[0112]
对测序结果进行ncbi比对，获得gpbhlh101基因的核苷酸序列seq id no.31，其中，atg为起始密码子，tga为终止密码子，推导的氨基酸序列为seq id no.32。绞股蓝gpbhlh101基因包含完整的开放阅读框，长度为624bp，编码208个氨基酸。综合以上结果，目的基因克隆成功。
[0113]
二、组织表达特异性及镉胁迫响应分析
[0114]
对绞股蓝gpbhlh101基因的表达规律进行分析，样本包括不同的组织部位、不同镉胁迫时间。从qpcr结果上看，gpbhlh101基因在绞股蓝中均存在组织特异性表达。gpbhlh101基因在绞股蓝根中有高表达，在茎、叶、叶柄处表达量相对较低(图4-a)。gpbhlh101基因的组织特异性表达较为明显且各有不同，推测gpbhlh101基因在绞股蓝不同组织部位中发挥的作用不同。
[0115]
gpbhlh101基因的表达量在镉处理3h时最高，镉处理72h时该基因的表达量显著高于无镉处理组，但随着处理时间增加，该基因的表达量与无镉处理组相比无显著差异(图4-b)。表明gpbhlh101基因的表达受镉诱导。
[0116]
三、转gpbhlh101基因拟南芥植株的获取
[0117]
1、拟南芥转基因植株的pcr鉴定
[0118]
对kana筛选得到的11株拟南芥t1代幼苗进行pcr检测。从凝胶电泳检测图上看，扩增产物大小均为600bp左右(图5)，且所有样本均出现对应条带，表明成功将gpbhlh101基因在拟南芥中过表达。获取的转gpbhlh101基因拟南芥植株编号分别为oe-1、oe-3、oe-4、oe-5、oe-6、oe-7、oe-8、oe-9、oe-10、oe-16、oe-21。
[0119]
2、转基因拟南芥高表达量株系筛选
[0120]
采用qpcr法，对11个转gpbhlh101基因拟南芥株系进行表达量检测，结果发现oe-16、oe-6和oe-7的表达量较高，最终选取这三个株系用于后续基因功能研究(图6)。
[0121]
四、转gpbhlh101基因拟南芥在镉处理下的生长情况观察
[0122]
由图7可知，野生型及转基因拟南芥植株在水培条件下生长情况良好，可用于后续实验研究。对野生型及转基因拟南芥植株进行镉胁迫处理，168h后观察到所有植株均出现明显的胁迫受害症状，主要表现为叶片发黄、枯死、生长受到抑制(图8)。在镉处理第96h和第168h分别记录各植株的受胁迫程度情况。由表12可知，在镉胁迫处理第96h和第168h，拟南芥野生型植株(wt)和转gpbhlh101基因植株均出现嫩叶发黄、成熟叶卷曲的现象。镉处理第96h时wt植株即出现叶片枯死现象，第168h时枯死率达30％，而转gpbhlh101基因植株仅在镉处理第168h时出现叶片枯萎或变色现象，表明镉对转gpbhlh101基因植株地上部分的影响小于野生型植株。
[0123]
表12镉胁迫条件下wt及转基因拟南芥的生长情况观察
[0124][0125]
对镉胁迫处理前后拟南芥的生物量和根长进行测定，结果发现镉处理168h后野生型植株及转gpbhlh101基因植株的鲜重增加量、根相对伸长率与无镉对照组相比明显下降，表明镉胁迫显著抑制拟南芥的生长(表13)，与图8中的表型特征一致。
[0126]
根相对伸长率是衡量植物耐镉性强弱的重要指标。镉处理168h后转gpbhlh101基因植株的根相对伸长率与wt相比明显减少，表明过表达gpbhlh101基因增强植株对镉胁迫的敏感性(表13)。转gpbhlh101基因植株的鲜重增加量与野生型相比有一定增加，表明镉胁迫对转基因植株的影响表现为地下部分＞地上部分。推测gpbhlh101基因可能通过减少镉从拟南芥地下部分向地上部分转移来降低镉的毒害作用。
[0127]
表13镉胁迫前后wt及转基因植株生长情况统计
[0128][0129]
五、wt及转基因植株中镉响应基因表达量分析
[0130]
由图9a可知，与无镉对照组相比，wt植株中atnas4的表达在镉处理24h时没有显著变化，但镉处理168h时atnas4的表达明显下降；而转gpbhlh101基因植株中atnas4的表达在镉处理24h时显著高于对照，在在镉处理168h时表达量有所下降，表明短时间的镉处理能够提高转基因植株atnas4的表达量。由图9b可知，与无镉对照组相比，镉处理均引起wt及转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量显著提高，但镉处理24h时转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量显著低于wt植株，镉处理168h时两个植株类型的差异不显著，表明短时间的镉处理更有利于wt植株中atpcr1基因的诱导表达。镉处理能提高wt及转gpbhlh101基因植株中atnramp3、atnramp4的表达量，但在相同镉处理时间中两个植株类型的差异不显著(图9，c和d)。镉处理也显著提高wt及转gpbhlh101基因植株中atmtp1、atmtp3、athma3的表达量，镉处理168h后转gpbhlh101基因植株中atmtp1及athma3的表达量均显著高于wt(图9，e、f和g)。以上结果表明，过表达gpbhlh101基因有利于提高镉胁迫条件下atmtp1、athma3的表达。
[0131]
六、wt及转基因植株中萜类物质合成关键基因表达量分析
[0132]
与无镉处理组相比，镉胁迫能提高转gpbhlh101基因植株中atsqe1、atsqs1、atfps1及atβ-as的表达量，但wt植株中atsqe1、atsqs1、atfps1及atβ-as的表达量在镉胁迫后呈现下降趋势(图9，h、i、j和k)。镉处理168h后，转gpbhlh101基因植株中atβ-as的表达量显著高于wt植株。总体上看，过表达gpbhlh101基因有利于提高镉胁迫下拟南芥萜类物质合成关键基因的表达。
[0133]
综上，本发明根据已有的三代全长转录组数据克隆得到bhlh类转录因子gpbhlh101基因，通过qpcr检测发现它具有明显的组织表达特异性，推测它在不同组织部位中的作用不同。经镉处理后绞股蓝幼苗中gpbhlh101基因的表达量上调，表明gpbhlh101基因为镉胁迫响应基因。与野生型相比，转gpbhlh101基因拟南芥植株在镉胁迫条件下表现出较低的根伸长能力及较高的生物量积累能力，并且其叶片枯萎及死亡率显著小于wt，表明转基因植株地下部分对镉胁迫较为敏感，而地上部分对镉胁迫的耐受能力较高，其机制可能与过表达gpbhlh101基因导致镉向地上部分的转运减少有关。
[0134]
为了避免重金属毒害，植物通常会上调与重金属螯合、转运等相关的基因的表达。尼古丁(nicotianamine，na)是一种金属螯合剂，通过螯合重金属离子来降低重金属对植株的毒害作用。nas(nicotianamine synthase)是催化na生物合成的关键酶，过表达nas基因已被证实能够增加na含量。与无镉处理组相比，短时间的镉处理24h能够提高转基因植株中atnas4的表达量，推测过表达gpbhlh101基因可能有利于提高植株中na含量，从而降低镉的毒害作用。植物镉抗性蛋白pcr(plant cadmium resistance)与重金属的转运有关。过表达atpcr1的拟南芥植株对cd的抗性增强，而反义植株表现为对cd更为敏感，表明atpcr1在拟南芥对镉的抗性中发挥重要作用。本发明发现镉胁迫显著提高wt及转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量。但镉处理24h时转gpbhlh101基因植株中atpcr1的表达量显著低于wt，推测较低表达量的atpcr1引起转基因植株地下部分对镉更为敏感，从而导致镉对转基因植株根生长的抑制作用显著高于wt。
[0135]
研究表明，atnramp3和atnramp4是拟南芥镉转运的关键基因。镉处理后wt和转gpbhlh101基因植株中atnramp3和atnramp4的表达量均明显增加，但wt和转gpbhlh101基因植株之间表达量差异不大，表明过表达gpbhlh101基因不影响atnramp3和atnramp4的表达。mtp(metal tolerant protein)具有液泡区隔化解毒、金属耐受的作用。hma(heavy metal atpase)是镉解毒、耐镉性的重要基因之一。镉胁迫7d后转gpbhlh101基因植株中atmtp1和athma3的表达量显著高于wt，推测过表达gpbhlh101基因有利于增强液泡对镉的区室化阻隔，从而提高植株对镉的耐性。
[0136]
植物萜类物质生物合成的关键酶已被解析。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,sqe)参与甲羟戊酸(mva)途径，是萜类物质生物合成的关键酶；鲨烯合成酶(squalene synthase,sqs)催化甾醇生物合成途径的第一步；法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophaophate synthase,fps)催化法尼基焦磷酸的合成，其中fps1活性起主导作用；β-香树脂醇合酶基因(β-amyrin synthase，β-as)在植物三萜皂苷合成过程中起关键调节作用，促进β-香树脂醇(齐墩果烷型三萜皂苷前体)的合成积累。本发明发现，过表达gpbhlh101基因能够提高拟南芥atsqe1、atsqs1、atfps1及atβ-as的表达量，镉处理168h后转基因植株中atβ-as的表达量显著高于wt植株，推测过表达gpbhlh101基因可能有利于萜类物质生物合
成，通过刺激次生代谢物积累响应镉胁迫。
[0137]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。