pd-1非阻断性清除抗体及其用途
技术领域：
：1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种pd-1非阻断性清除抗体及其用途。更具体的说，本发明涉及一种与pd-1特异性高亲和力结合，但不阻断pd-1与其配体结合的清除性抗体，达到清除自身反应性和同种异体反应性t细胞和b细胞的作用，以用于自身免疫性疾病、器官及细胞移植的排斥反应和炎症的治疗。
背景技术：
：：2.程序性死亡受体-1(programmedcelldeathprotein1,pd-1,又称cd297)是cd28受体家族成员，其主要表达于活化的cd4 t细胞、cd8 t细胞、b细胞等，主要受t细胞受体(tcr)和b细胞受体(bcr)信号的诱导表达。pd-1分子有胞外区、跨膜区和胞内区构成，胞外区含有一个免疫球蛋白可变区igv结构域以与其配体结合，胞内区含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和一个免疫受体酪氨酸转换基序(itsm)以传递抑制性信号。pd-1有两个配体：pd-l1和pd-l2，均属于b7同源物，能与pd-1结合，但无法与其他cd28家族成员结合。pd-l1广泛表达于活化的t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突状细胞及肿瘤细胞上，而pd-l2表达局限，主要在活化的t细胞和b细胞和少数肿瘤细胞。pd-1与其配体结合介导的免疫抑制作用是免疫耐受、肿瘤逃逸、移植耐受的重要机制。pd-1缺陷型动物形成多种自身免疫性疾病、包括自身免疫性心肌病和狼疮样综合征等。而pd-1信号介导的肿瘤中t细胞失能是肿瘤免疫逃逸的主要原因，阻断性pd-1抗体能阻断其与pd-l1和pd-l2结合，逆转t细胞失能，使t细胞的活化程度和杀伤能力显著增强，达到肿瘤的免疫治疗作用。目前已有多种pd-1阻断性抗体药物被批准用于肿瘤治疗：纳武利尤单抗(nivolumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)、信迪利单抗(cindilimab)和卡瑞利珠单抗(camrelizumab)。然而，临床使用发现，pd-1的阻断抗体可能诱发和加重自身免疫病及器官移植后的排斥反应。3.反应性t细胞和b细胞介导的细胞免疫和体液免疫反应是自身免疫病和移植排斥反应的主要发病机制。自身免疫疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，具体指自身免疫细胞主要是t和b细胞对自身免疫耐受异常，出现过度活化而导致的器官特异性(如慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、1型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎)或者系统性损害(多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、银屑病、硬皮病、皮肌炎、溃疡性结肠炎等)。而器官及细胞移植排斥反应是免疫系统对外来异体抗原的一种免疫反应，引发排斥反应的主要抗原为主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex，mhc)，人类的mhc被称为hla(humanleukocyteantigen，hla)，即人白细胞抗原。排斥反应主要包括活化t细胞介导的细胞免疫应答和b细胞介导体液免疫应答，是导致移植物功能衰竭的主要原因。综合上述可知，自身免疫病及移植排斥反应主要是由活化的t细胞和b细胞介导的免疫反应。其具体机制包括：当t细胞的tcr识别到自身抗原或异体抗原后会活化，高表达cd2、icos、pd-1等共刺激及共抑制分子，并分化为效应性t细胞，包括th1、th2、th9、th17、th22、滤泡样t细胞(tfh)、细胞毒性t细胞(tc)等，通过分泌促炎性细胞因子(ifn-γ、tnf-α、il-2、il-4、il-17等)促进免疫细胞活化加重炎症反应、通过辅助b细胞活化和成熟分泌特异性抗体、通过分泌毒性蛋白(穿孔素和颗粒酶等)或者表达配体(fas-fasl)诱导细胞死亡或调亡。免疫抑制剂是目前治疗自身免疫病和抑制排斥反应最重要的药物。4.免疫抑制剂研发主要策略是抑制和清除自身反应性t细胞和b细胞，除了小分子化合物，目前临床常用的抗体药物主要包括：(1)抗胸腺细胞球蛋白(antithymocyteglobulin，atg)和抗淋巴细胞球蛋白(antilymphocyteglobulin，alg)：均是多克隆igg组分，由已对人胸腺细胞或淋巴细胞免疫的各种动物(兔、马、山羊或猪)血清制备并收集而成，为强效免疫抑制剂。作用机制在于抑制经抗原识别后的淋巴细胞激活过程，并在补体协助下，对淋巴细胞产生细胞溶解作用。(2)抗人cd3抗体(muromonab-cd3，商品名orthocloneokt3)：是一种针对t淋巴细胞cd3复合物的抗体，其包括嵌合抗体及人源化抗体，其可以清除t细胞从而发挥较强的免疫抑制作用。(3)抗人cd25(高亲和力il-2受体α链)抗体：包括人源化cd25单克隆抗体(daclizumab,xnapaxr)和人-鼠嵌合型cd25单克隆抗体(basiliximab,simulect巴利昔单抗)，能特异性的作用于活化的t细胞il-2受体α链,通过竞争性的与il-2受体结合,拮抗il-2与其受体结合而达到抑制t细胞增殖作用。然而atg/alg或okt3因为作用的靶细胞缺乏特异性，副作用较大，已经很少被用于临床，而cd25抗体只能抑制t细胞增殖，缺乏对特异性t细胞的清除作用，且存在影响抑制性t细胞——调节性t细胞(treg)作用。5.pd-1是t细胞和b细胞活化后表达的分子，目前上市的pd-1抗体均为阻断性抗体，且缺乏细胞毒作用，其竞争性结合pd-1，阻断其与pd-l1和pd-l2的结合以阻断t细胞负调控信号，增强t细胞的免疫功能及抗肿瘤作用，但同时会诱导和加重自身免疫病和移植排斥反应。而清除pd-1阳性的细胞则可能减轻自身免疫病及移植排斥反应，因此，本领域急需开发pd-1清除性抗体。技术实现要素：6.为了解决上述问题，本发明提供一种pd-1非阻断性清除抗体及其用途。该新型的pd-1抗体——抗人pd-1非阻断性的高亲和力清除性抗体，其能高亲和力结合人pd-1，且对pd-1与pd-l1和pd-l2的结合无明显阻断效果，其清除性抗体在人源化pd-1小鼠的自身免疫病模型和心脏移植移植模型中均具有较好的保护效果，该抗体人源化的fc段为具有adcc和cdc作用的人igg1，具有对表达pd-1细胞的清除作用。7.特异性结合程序性死亡受体-1(pd-1)的抗体或其抗原结合片段8.在一个方面，本发明提供了一种特异性结合pd-1的非阻断性清除抗体或其抗原结合片段，包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包含分别如seqidno：1、2和3所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3，所述重链可变区包含分别如seqidno：4、5和6所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。9.更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段可以为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体中的任一种。10.更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体，其包含如seqidno：7所示的轻链和如seqidno：9所示的重链，此抗体在本文中命名为鼠源性抗体3d6-migg2a。更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为鼠源抗体，其包含由seqidno：8编码的轻链和由seqidno：10编码的重链。11.更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，并且其fc段为具有adcc和cdc作用的人igg1的fc段。12.更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其包含如seqidno：11所示的轻链可变区和如seqidno：13所示的重链可变区。更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其包含由seqidno：12编码的轻链可变区和由seqidno：14编码的重链可变区。13.更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其包含如seqidno：15所示的轻链和如seqidno：17所示的重链，此抗体在本文中命名为人源化抗体3d6-higg1。更具体地，所述特异性结合pd-1的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，其包含由seqidno：16编码的轻链和由seqidno：18编码的重链。14.如本文中所使用的，术语"抗体"涵盖全长抗体(例如，igg1或igg4抗体)、其各种功能性片段(例如可仅包含抗原结合部分，如fab、f(ab')2或scfv片段)以及经过修饰的抗体(例如人源化、糖基化等)。15.如本文中所使用的，术语"单克隆抗体或mab"，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如cdr移植)，或其它现有技术进行重组得到。16.如本文中所使用的，"抗体片段"和"抗原结合片段"可互换使用并意即抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parentalantibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗体片段实例包括但不限于：fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双抗体；线性抗体(linearantibody)；单链抗体分子，例如scfv、单抗体(技术来自genmab)；纳米抗体(技术来自domantis)；结构域抗体(技术来自ablynx)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于holliger等,2005；natbiotechnol,23:1126-1136中。17.如本文中所使用的，术语“互补决定区”或“cdr”是指抗体可变区中负责抗原结合的氨基酸残基。在抗体中含有三个cdr，命名为cdr1、cdr2和cdr3。这些cdr的精确边界可根据本领域已知的各种编号系统进行定义，例如可按照kabat编号系统、chothia编号系统或imgt编号系统中的定义。对于给定的抗体，本领域技术人员将容易地鉴别各编号系统所定义的cdr。并且，不同编号系统之间的对应关系是本领域技术人员熟知的。18.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以由该相互作用的平衡解离常数(kd)表示。在本发明中，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入gcg软件包(可在www.gcg.com上获得)的gap程序中的needleman和wunsch(jmoibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum62矩阵或pam250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。25.如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和pcr介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，brummell等人，biochem.32:1180-1187(1993)；kobayashi等人proteineng.12(10):879-884(1999)；和burks等人proc.natlacad.setusa94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。26.多核苷酸27.在另一个方面，本发明还涉及一种多核苷酸，其编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段。28.本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。29.术语“编码多肽/蛋白/抗体的多核苷酸”可以是包括编码此多肽/蛋白/抗体的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。30.本发明还涉及与如本文所述的多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，最优选至少90％同一性的多核苷酸，并且它们编码的多肽/蛋白/抗体具有基本上相同的功能和活性。本发明特别涉及可在严格条件下与本发明所述多核苷酸杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×ssc,0.1％sds,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同一性至少在90％以上,更优选95％以上时才发生杂交。31.本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。32.载体33.在另一个方面，本发明还涉及一种载体，其包含如本文所述的多核苷酸。34.如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。35.宿主细胞36.在另一个方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其包含如本文所述的载体。37.如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或其他人细胞等的动物细胞。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。38.将载体导入宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。39.缀合物40.在另一个方面，本发明还涉及一种缀合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段以及偶联部分。41.所述偶联部分选自可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。42.在某些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段任选地通过接头与所述偶联部分缀合。43.在某些实施方案中，所述偶联部分选自可检测标记物，例如酶(例如辣根过氧化物酶)、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。本发明所述的可检测标记物可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、125i、35s、14c或32p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。在某些实施方案中，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。在某些实施方案中，可通过不同长度的接头(linker)将如上所述的可检测的标记连接至本发明的抗体或其抗原结合片段，以降低潜在的位阻。44.在某些实施方案中，所述偶联部分选自药物，例如抗炎药物或免疫抑制剂。45.在某些实施方案中，所述偶联部分选自另外的生物活性多肽。46.药物组合物47.在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。48.在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含第二治疗剂。所述第二治疗剂是有利地与pd-1抗体组合的任意试剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是其他抗炎药物或免疫抑制剂。49.在某些实施方案中，在所述药物组合物中，如本文所述的抗体或其抗原结合片段与所述第二治疗剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。因此，如本文所述的抗体或其抗原结合片段与所述第二治疗剂可以同时、分开或相继施用。50.在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂可以包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(wfi)、抑菌性注射用水(bwfi)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)nacl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、ph缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、ringer氏溶液及其任意组合。51.本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的如本文所述的抗体或其抗原结合片段与所述第二治疗剂。“预防有效量”是指足以预防、阻止或延迟疾病的发生的量。“治疗有效量”是指足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。52.治疗用途53.在另一个方面，本发明还涉及如本文所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物在制备用于清除自身反应性和同种异体反应性t细胞和b细胞的药物中的用途。54.在另一个方面，本发明还涉及如本文所述的抗体或其抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞、缀合物或药物组合物在制备用于治疗自身免疫性疾病、器官或细胞移植的排斥反应和/或炎症的药物中的用途。55.自身反应性t细胞56.如本文所用，自身反应性t细胞意指攻击自身组织、细胞及器官的t细胞。有时机体免疫系统不能将自身一个或多个组分识别为“自我”，并产生自身抗体及自身反应性t细胞，这些抗体及t细胞攻击自身细胞、组织和/或器官(误将自身正常组织细胞当做外源性抗原)。从而导致炎症和损伤，引起自身免疫性疾病。57.同种异体反应性t细胞58.如本文所用，同种异体反应性t细胞是介导移植排斥反应的重要细胞，同种异体的供、受者间mhc分子存在差异，供、受者的淋巴细胞通过直接识别对方淋巴细胞表面的异型mhc分子，从而发生增殖和活化。区别于对一般抗原的应答，由直接识别导致的排斥反应有两个特点：①速度快，因为无需经历抗原摄取、处理和加工；②强度大，因为每一个体中，具有同种抗原反应性的t细胞克隆占t细胞库总数的1％-l0％，而针对一般异源性抗原的t细胞克隆仅占总数的1/100000-1/10000。59.器官移植排斥反应60.本发明抗体或抗体片段可用于治疗器官移植排斥反应，其是在受者进行同种异体组织或器官移植后，外来的组织或器官等移植物作为一种“异己成分”被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除的免疫学反应。本发明抗体或其缀合物可单独使用，或者与其他免疫抑制剂联合使用，以治疗器官移植排斥反应，例如但不限于这些的一些实例，包括：心脏移植、肾移植、肺移植、肝移植、胰腺与胰岛移植、甲状旁腺移植、心肺联合移植、骨髓移植、角膜移植、小肠移植，手移植等，以及各类组织包括皮肤、脂肪、筋膜、肌腱、硬膜、血管、淋巴管、软骨和骨移植。61.细胞移植排斥反应62.细胞治疗是指将正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。细胞治疗按照细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。本发明抗体或其缀合物可单独使用，或者与其他免疫抑制剂联合使用，以治疗细胞移植排斥反应。63.自身免疫性疾病64.本发明抗体或抗体片段可用于治疗自身免疫性疾病(autoimmunedisease，aid)，其是在一定条件下，免自身疫耐受被打破，免疫系统将对自身抗原产生病理性免疫应答，造成自身组织细胞损伤或功能异常。本发明抗体或其缀合物可单独使用，或者与其他免疫抑制剂联合使用，以治疗自身免疫性疾病，例如但不限于这些的一些实例，包括：免疫介导的血小板减少症,如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、狼疮肾炎、风湿热、多内分泌腺综合征、过敏性紫癜、链球菌感染后性肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(takayasu'sarteritis)、阿狄森病(addison'sdisease)、多形红斑(erythemamultiforme)、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘综合征(goodpasture'ssyndrome)、血栓闭塞性脉管炎、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、甲状腺中毒症、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常型天疱疮、韦格纳氏肉牙肿病(wegener'sgranulomatosis)、膜性肾病、肌肉萎缩性侧索硬化、脊髓痨、多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎和纤维性肺泡炎；炎症性皮肤病,包括牛皮癣和皮肤炎(例如异位性皮肤炎)；全身性硬皮病和硬化；发炎性肠病(如克罗恩病(crohn'sdisease)和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合征包括成人呼吸窘迫症候群；ards)；皮肤炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏性病状,如湿疹和哮喘以及涉及t细胞浸润和慢性发炎性反应的其它病状；动脉粥样硬化；白细胞粘附不足；类风湿性关节炎；全身性红斑性狼疮症(systemiclupuserythematosus,sle)；糖尿病(例如1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病)；多发性硬化:雷诺综合征(reynaud'ssyndrome)；自体免疫甲状腺炎；过敏性脑脊髓炎；斯耶格伦氏综合症(sjorgen'ssyndrome)；青少年型糖尿病:以及与由通常发现于肺结核结节病、多发性肌炎、肉芽肿病和血管炎中的细胞介素和t淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏感性相关的免疫反应:恶性经闭(阿狄森病,addison'sdisease)；涉及白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(cns)发炎性病症；多重器官损伤综合征；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症或库姆斯阳性贫血(coombspositiveanemia))；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导疾病:抗肾小球基底膜疾病:抗磷脂综合征；过敏性神经炎；格雷夫斯氏病(graves'disease)；朗伯一伊顿肌无力综合征(lambert-eaton肌无力综合征)；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫多内分泌腺病；莱特尔氏病(reiter'sdisease)；全身肌强直综合征:贝切特氏病(behcedisease)；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；iga肾病；1gm多发性神经病:免疫血小板减少性紫癜(immunethrombocytopenicpurpura,itp)或自身免疫血小板减少等。65.缩写66.hpd-1ꢀꢀ人pd-1蛋白67.cdrꢀꢀꢀꢀ用kabat编号系统界定的免疫球蛋白可变区中的互补决定区68.ec50ꢀꢀꢀ产生50％功效和结合的浓度69.elisaꢀꢀ酶联免疫吸附测定70.il-2ꢀꢀꢀ白细胞介素-271.ic50ꢀꢀꢀ产生50％抑制的浓度72.iggꢀꢀꢀꢀ免疫球蛋白g73.kabatꢀꢀ由elvinakabat倡导的免疫球蛋白比对及编号系统74.frꢀꢀꢀꢀꢀ抗体构架区：将cdr区排除在外的免疫球蛋白可变区75.hrpꢀꢀꢀꢀ辣根过氧化物酶76.ifn-γ干扰素γ77.mabꢀꢀꢀꢀ单克隆抗体78.pcrꢀꢀꢀꢀ聚合酶链式反应79.v区ꢀꢀꢀꢀ在不同抗体之间序列可变的igg链区段。其延伸到轻链的109位kabat残基和重链的第113位残基80.vhꢀꢀꢀꢀꢀ免疫球蛋白重链可变区81.vkꢀꢀꢀꢀꢀ免疫球蛋白κ轻链可变区82.kdꢀꢀꢀꢀꢀ平衡解离常数83.kaꢀꢀꢀꢀꢀ结合速率常数84.kdꢀꢀꢀꢀꢀ解离速率常数附图说明85.图1示出了制备hpd-1抗体的流程图。86.图2示出了鼠源性抗体3d6-migg2a的sds-page鉴定结果。87.图3示出了鼠源性抗体3d6-migg2a的elisa结合检测结果。88.图4示出了鼠源性抗体3d6-migg2a的fcm检测结果。89.图5示出了鼠源性抗体3d6-migg2a的竞争elisa检测结果。90.图6示出了鼠源性抗体3d6-migg2a延长pd-1人源化小鼠心脏移植物生存期。91.图7示出了鼠源性抗体3d6-migg2a的elispot结果。92.图8示出了人源化抗体质粒图。93.图9示出了人源化抗体3d6-higg1的sds-page检测结果。94.图10示出了人源化抗体3d6-higg1的bli亲和力检测结果。95.图11示出了人源化抗体3d6-higg1对混合淋巴细胞反应的作用。96.图12示出了人源化抗体3d6-higg1的adcc活性检测结果。具体实施方式97.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
：常规试剂、方法和设备。98.实施例1：产生小鼠抗hpd-1抗体99.为了产生针对人pd-1的小鼠抗体，用人pd-1免疫接种6-8周大的雌性balb/c小鼠，通过如图1所示的方法收集抗hpd-1抗体。100.小鼠的免疫接种101.免疫原为重组人pd-1蛋白(abclonal，rp00067)，第一次免疫：100ug稀释的免疫原用等量的完全弗氏佐剂(cfa)乳化后皮下注射，随后第2-3次免疫用50ug稀释的免疫原用等量的不完全弗氏佐剂(ifa)乳化后皮下注射，100ug免疫原静脉注射冲击免疫3天后用elisa法测定小鼠血清抗体效价，选取效价最高的小鼠脾细胞进行细胞融合。102.细胞融合103.采用处于对数生长期的balb/c来源的骨髓瘤细胞sp2/0，用cd19的磁珠富集效价最高的已免疫小鼠脾脏中的b细胞，b细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入hat培养基悬浮混匀，置于37℃、5％co2恒温培养箱中进行培养。104.结合elisa初步筛选和亚克隆105.融合7-10天内挑选杂交瘤细胞克隆，取培养上清进行elisa结合检测：包被pd-1蛋白0.1ug/ml，1ug/ml及5ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜；板内液体甩净拍干，2％bsa300ul每孔，密封后室温孵育1h；300ul每孔洗涤液，洗板2次，最后一次拍干；将培养上清稀释后加入对应孔板中，100ul每孔，室温2小时；重复洗板过程；稀释二抗至使用浓度，100ul每孔，室温1小时；重复洗板过程；将显色液a液和b液1:1混匀后，每孔加入200ul，室温避光孵育20min；每孔加入50ul终止液，立即在450nm波长处测量od值。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定elisa值，挑取elisa检测od450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至elisa测定96孔板全板结果为阳性。106.fcm结合筛选107.使用处于对数生长期的molt-4细胞系，分至10万个细胞每管，加入10ul前述elisa测定全板结果为阳性的单克隆细胞的培养上清，室温孵育30分钟，pbs洗一遍，离心，加入抗小鼠igg的荧光二抗0.5ul每管，室温孵育30分钟，pbs后洗一遍后上机检测，选取平均荧光强度较高的几个克隆进行进一步筛选。108.竞争elisa筛选109.包被pdcd1-fc,100ul/孔，4℃包被过夜；板内液体甩净拍干，2％bsa,300μl/孔，密封后室温孵育1h；300μl/孔洗涤液，洗板2次，最后一次拍干；竞争物pd-l2-his稀释至0.2ug/ml及竞争物b7-h1-his稀释至3ug/ml，取稀释后样品(前述平均荧光强度较高的克隆)及竞争物各100ul加入至对应孔板中，混合均匀，室温反应2h；300μl/孔洗涤液，洗板3次，最后一次拍干；稀释hrp标记的抗his检测二抗至使用浓度，100μl/孔，混合均匀，室温孵育1h；洗板，将a液和b液按1:1混匀后，每孔加入200μl，室温避光孵育10min；每孔加入50μl终止液，立即在450nm波长处测量od值。筛选出阻断pd-1与pd-l1/2结合效率较低的克隆3d6进行测序(其包含如seqidno：7所示的轻链和如seqidno：9所示的重链)及3d6-migg2a抗体的生产。110.杂交瘤细胞基因提取及测序111.将上述克隆3d6的杂交瘤细胞裂解后提取rna，以提取的rna为模板，采用义翘科技反转录试剂盒，分两步获得cdna，以反转录获得的cdna为模板，通过多条引物进行pcr扩增，将扩增的片段插入到表达载体上，测序得到含有正确序列的质粒。112.细胞培养与抗体纯化113.将1ml杂交瘤细胞转入100ml培养瓶中，定期加入一定量的1640培养基进行细胞扩增，培养10-12天。proteina亲和层析柱用超纯水冲洗，然后用平衡缓冲液平衡；将培养后的杂交瘤细胞的上清上样至亲和层析柱，上样完毕后，用平衡缓冲液淋洗。洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，用tris缓冲液中和。脱盐至pbs7.4。制样，凝胶电泳鉴定，判断胶图条带大小是否正确，sds-page鉴定其纯度。结果显示：抗体获得成功表达，纯度大于90％(图2)。114.实施例2：对生产出的鼠源性抗体3d6-migg2a再次进行结合能力及阻断活性的检测结合elisa检测115.包被pd-1蛋白0.1ug/ml，1ug/ml及5ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜；板内液体甩净拍干，2％bsa300ul每孔，密封后室温孵育1h；300ul每孔洗涤液，洗板2次，最后一次拍干；抗体稀释至1ug/ml加入对应孔板中，100ul每孔，室温2小时；重复洗板过程；稀释二抗至使用浓度，100ul每孔，室温1小时；重复洗板过程；将显色液a液和b液1:1混匀后，每孔加入200ul，室温避光孵育20min；每孔加入50ul终止液，立即在450nm波长处测量od值(图3)，结果显示该抗体3d6-migg2a(即图3中的3d6表示)与pd-1蛋白结合良好。116.fcm检测117.使用处于对数生长期的molt-4细胞系，分至10万个细胞每管，加入抗体稀释至1ug/ml，室温孵育30分钟，pbs洗一遍，离心，加入抗小鼠igg的荧光二抗0.5ul每管，室温孵育30分钟，pbs后洗一遍后上机检测(图4)，结果显示该抗体3d6-migg2a(即图4中的3d6表示)与表达人pd-1的细胞结合良好。118.竞争elisa检测119.包被pdcd1-fc,100ul/孔，4℃包被过夜；板内液体甩净拍干，2％bsa,300μl/孔，密封后室温孵育1h；300μl/孔洗涤液，洗板2次，最后一次拍干；竞争物pd-l2-his稀释至0.2ug/ml及竞争物b7-h1-his稀释至3ug/ml，加入0.1ug/ml和5ug/ml抗体及竞争物各100ul加入至对应孔板中，混合均匀，室温反应2h；300μl/孔洗涤液，洗板3次，最后一次拍干；稀释hrp标记的抗his检测二抗至使用浓度，100μl/孔，混合均匀，室温孵育1h；洗板，将a液和b液按1:1混匀后，每孔加入200μl，室温避光孵育10min；每孔加入50μl终止液，立即在450nm波长处测量od值(图5)，结果显示该抗体3d6-migg2a(即图5中的3d6表示)几乎不阻断pd-1与pd-l1/2结合。120.实施例3：pd-1人源化小鼠心脏移植模型检测3d6-migg2a抗体的体内效果121.麻醉小鼠，将balb/c小鼠的心脏移植到b6hpd-1(集萃药康，t003095)受体小鼠的腹部。打开供体小鼠腹部，经下腔静脉注入1ml肝素盐水，1分钟后打开胸廓，立即用冰肝素盐水滴在心脏表面至心脏停止跳动，用6-0的丝线结扎上下腔静脉，摘除胸腺，暴露主动脉和肺动脉，用维纳斯剪剪开主动脉及肺动脉，用2ml冰肝素盐水经主动脉冲洗心脏至无血色，将肺静脉统一结扎之后将心脏整体取下，放入冰肝素盐水中备用。打开受体小鼠腹腔，分离暴露腹腔动静脉，结扎分支血管，分别在近端和远端阻断腹腔动静脉，用维纳斯剪在动静脉正面分别开一个小口，用10-0的丝线将供心的主动脉端侧连续缝合至腹腔动脉，将肺动脉端侧连续缝合至腹腔静脉，开放循环，待心脏复跳后，关腹，补液。将抗体(500μg)在移植后第0、3、6天腹腔注射到受体小鼠体内，随后250μg每5天一次，每天通过触摸心脏跳动来判断排斥情况，当心脏完全停止跳动时认为发生了完全的排斥，并通过剖腹手术证实。3天以内的心脏停跳则判断为技术失误(小于5％)，从后续分析中剔除(图6)，结果显示，该抗体显著延长心脏移植物生存期。122.实施例4：elispot检测同种异体反应性t细胞数量123.构建balb/c小鼠的心脏移植到b6hpd-1受体小鼠的心脏移植模型，并予以抗体(腹腔注射500ug，第0、3、6天注射)治疗，在移植后第6天，取受体脾脏研磨成单细胞悬液，使用t细胞阴选试剂盒(美天旎，130-095-130)将其中的t细胞分选出来并与刺激细胞balb/capcs1:1混合，以2x105个/孔接种在小鼠ifn-γ预包被elispot板子上,37℃孵育16小时。在4℃下用冷ddh2o裂解10分钟后，用洗涤缓冲液洗涤6次，然后在37℃下与生物素化的抗ifn-γ孵育1小时。洗涤之后，与链霉亲和素-hrp在37℃下孵育1小时。重复洗涤过程后，在37℃下用aec溶液孵育10分钟，然后用冷ddh2o终止。利用rawspot技术在单细胞水平上进行计数，使用mabtechirisfluorospot/elispot阅读器对结果进行分析(图7)，结果显示该抗体显著减少了受体脾脏中的同种异体反应性t细胞数量。124.实施例5：鼠源抗体的人源化及人源化抗体的亲和力检测125.通过对3d6进行抗体序列分析，3d结构建模及cdr结构分析，人源化设计，随后进行基因合成、载体构建(图8)、hek293瞬转表达纯化，获得了人源化抗体3d6-higg1(其包含如seqidno：15所示的轻链和如seqidno：17所示的重链),并通过sds-page检测了目的蛋白纯度(图9)，结果显示：条带大小位置正确，纯度为98.7％。具体的人源化抗体构建方法可根据本领域许多文献公示的方法进行。126.利用bli测定人源化抗体与抗原蛋白亲和力127.首先将fortebiooctetred384系统的生物传感器浸入缓冲液中进行平衡，浸入5ug/ml的人源化抗体3d6-higg1溶液中，再浸入含有梯度稀释的hpd-1蛋白溶液(0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)中，将已结合待测抗体的传感器浸入缓冲液中进行解离，待测抗体从生物传感器表面脱落导致膜层厚度的减少。通过对实验过程中生物传感器生物膜层厚度的实时监控，可以得到待测样品的动力学常数，结果表明，人源化抗体3d6-higg1的亲和力为5.29e-10，仍然保持着较高的亲和力(图10)。128.实施例6：人源化抗体3d6-higg1不增强混合淋巴细胞反应129.取健康人外周血，用淋巴细胞分离液(天津市灏阳生物科技有限限公司)分离外周血单个核细胞，进一步采用单核细胞分离试剂盒(美天旎公司)分离单核细胞，加入25ng/mlgm-csf及50ng/mlil-4接种至96孔板，37℃培养7天诱导树突状细胞。实验第7天，取另外一份健康人外周血用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，进一步采用cd4细胞分离试剂盒(美天旎公司)分离cd4阳性t细胞，调整细胞浓度并接种至前述诱导树突状细胞的培养板中，各加入1ug/mlhigg1同种型阴性对照抗体(higg1isotype)、纳武利尤单抗阳性对照抗体(nivolumab)及3d6-higg1，常规培养5天后收集上清，使用人ifn-gammaelisa试剂盒(abclonalrk00015)检测各上清中的ifn-γ浓度，结果显示，pd-1阻断性抗体纳武利尤单抗相比higg1同种型阴性对照抗体显著增加混合淋巴细胞反应中ifn-γ分泌量，而3d6-higg1则并不增加ifn-γ分泌量(图11)。130.实施例7：人源化抗体3d6-higg1的体外adcc活性检测131.取健康人外周血用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，进一步采用nk细胞分离试剂盒(美天旎公司)分离nk细胞，并在体外用il-2刺激培养，将体外活化的cd4阳性t细胞用pkh26细胞连接试剂盒(sigma)标记，随后与nk细胞以1:5的比例种板，加入10倍稀释梯度(0.001ug/ml、0.01ug/ml、0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)的3d6-higg1和higg1同种型抗体(higg1isotype)并在37℃孵育4小时，通过流式细胞仪分析活的cd4阳性t细胞比例，计算裂解比例。结果显示，随着3d6-higg1抗体浓度的增加，cd4阳性t细胞的裂解比例逐渐增加，当3d6-higg1浓度为0.074ug/ml时，有约50％的cd4阳性t细胞发生了裂解(图12)。132.在说明书的描述中，参考术语“一个实施方案”、“具体实施方案”、“实例”等的描述意指结合该实施方案或实例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方案或实例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方案或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施实施方案或实例中以合适的方式结合。133.以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本
技术领域：
：的技术人员对所描述的具体实施方案做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。134.需要说明的是，本发明的说明书及其附图中给出了本发明的较佳的实施例，但是，本发明可以通过许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例，这些实施例不作为对本
发明内容的额外限制，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。并且，上述各技术特征继续相互组合，形成未在上面列举的各种实施例，均视为本发明说明书记载的范围；进一步地，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12