arog醛缩酶变体及利用其生产支链氨基酸的方法
【技术领域】
1.本技术涉及arog醛缩酶(磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶)的变体，以及使用该酶生产氨基酸的方法。
背景技术：
2.l-氨基酸是蛋白质的基本组成部分，并用作医药原料、食品添加剂、动物饲料、营养补充剂、杀虫剂、杀菌剂等的重要原料。因此，从经济角度来看，氨基酸的工业生产已成为重要的工业过程。
3.已经进行了各种研究以有效地生产氨基酸；例如，已经努力开发微生物或发酵工艺技术，以高效生产氨基酸。特别是，已经开发了针对目标材料的特定方法，例如增强编码参与棒杆菌属(corynebacterium)菌株中氨基酸生物合成的酶的基因表达或删除氨基酸生物合成所必需的基因(us 9109242 b2)。除了这些方法之外，还使用了去除不参与氨基酸生产的基因的方法和去除其产生氨基酸功能不明确已知的基因的方法。
4.同时，在氨基酸中，支链氨基酸是指缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸三种氨基酸，并且已知它们主要在肌肉组织中代谢并作为运动过程中的能量来源。由于已知支链氨基酸在运动期间的肌肉维持和生长中起重要作用，因此其使用正在增加。然而，由于支链氨基酸的生物合成途径中会产生大量的副产物，因此减少副产物的量以生产高产量和高纯度的支链氨基酸非常重要。
技术实现要素：
5.【技术问题】
6.本发明人已经证实，已引入新开发的arog醛缩酶变体的微生物可以高产和高纯度生产支链氨基酸，从而完成了本技术。
7.【技术方案】
8.本技术的一个目的是提供arog醛缩酶(磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶)变体，其中对应于seq id no：1的氨基酸序列中自n末端起第217、310、403和462位的任一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代。
9.本技术的另一个目的是提供一种编码该变体的多核苷酸及其载体。
10.本技术的另一个目的是提供棒杆菌属(corynebacterium)微生物，其包括一种以上arog醛缩酶变体、多核苷酸和载体。
11.本技术的另一个目的是提供一种生产支链氨基酸的方法，包括在培养基中培养所述微生物。
12.【有利效果】
13.当使用本技术的arog醛缩酶变体时，副产物的产生可以减少，并且与不使用arog醛缩酶变体的情况相比，可以高产率地生产支链氨基酸。
14.【优选实施例详细说明】
15.下面对本技术进行详细说明。同时，本文公开的每个描述和实施例可以分别应用于其它描述和实施例。也就是说，本文公开的各种元件的所有组合都属于本技术的范围。此外，本技术的范围不受下面描述的具体描述的限制。
16.此外，本领域普通技术人员可以仅使用常规实验来识别或确认许多等同于本文描述的本发明的特定方面。此外，还打算在本技术中包括这些等同物。
17.arog醛缩酶变体是指其中对应于seq id no：1的氨基酸序列中自n末端起第217、310、403和462位的任一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代的变体，在具有arog醛缩酶活性的多肽中或在arog醛缩酶中。
18.所述arog醛缩酶变体是指在具有arog醛缩酶活性的多肽中或在arog醛缩酶中中对应于n末端的任意一种以上氨基酸在seq id no：217的氨基酸序列中被另一种氨基酸取代。
19.本文所用的术语“arog醛缩酶”是能够催化以下反应的酶：
20.磷酸烯醇式丙酮酸盐 d-赤藓糖-4-磷酸 h2o3-脱氧-d-阿拉伯-庚-2-酮糖酸-7-磷酸 磷酸
21.本技术的arog醛缩酶可以是对arog醛缩酶进行修饰以制备本文提供的arog醛缩酶变体，或者具有arog醛缩酶活性的多肽。具体地，可以是天然存在的多肽或野生型多肽，可以是其成熟的多肽，并且可以包括其变体或其功能片段而不受限制，只要它可以是本技术的arog醛缩酶变体的母体。
22.如本文所用，arog醛缩酶可以是seq id no：1的多肽，但不限于此。在一个实施方案中，其可以是与seq id no：1的多肽具有约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上序列同一性的多肽，并且具有与由seq id no：1的氨基酸序列组成的多肽相同或对应的活性的任何多肽可以包括在arog醛缩酶的范围内，但不限于此。
23.本技术的arog醛缩酶序列可以从ncbi的genbank获得，这是一个已知的数据库。具体地，它可以是由arog基因编码的多肽，但不限于此。
24.本文所用的“变体”是指在通过保守替换和/或修饰使得多肽的功能和性质得以保留之前具有一个以上氨基酸不同于氨基酸序列的多肽。这种变异通常可以通过修饰多肽的一个或多个上述氨基酸序列并评估修饰的多肽的性质来鉴定。也就是说，在修饰之前，变体相对于多肽的能力可以增强、改变或减弱。此外，一些变体可以包括其中一个或多个部分，例如n末端前导序列或跨膜结构域已被去除的变体。其他变体可能包括已从成熟蛋白的n端和/或c末端去除一部分的变体。术语“变体”可以与诸如修饰、修饰、修饰的多肽、修饰的蛋白质、突变和突变等术语互换使用，只要这些术语用于表示变异。
25.此外，所述变体还可以包括对多肽的性质和二级结构具有最小影响的氨基酸的缺失或添加。例如，参与蛋白质易位的信号(或先导)序列可以在共翻译或翻译后在变体的n末端共翻译或翻译后偶联。此外，这些变体还可以与另一个序列或接头偶联以鉴定、纯化或合成多肽。
26.本文提供的变体可以是arog醛缩酶变体，其中对应于seq id no：1的氨基酸序列中自n末端起第217、310、403和462位的任一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代。例如，在上述位置，4个氨基酸中的2个或更多、3个或更多或全部可以被取代，但不限于此。
27.对应于seq id no：1的氨基酸序列中从n末端起第217位的氨基酸可以是精氨酸；
european molecular biology open software suite,rice et alia,2000,trends genet.16:276-277)等进行，但不限于此，以及序列比对程序，可以适当地使用本领域已知的诸如成对序列比较算法等。
38.在一个实施方案中，本技术的变体可以是这样的变体，其中对应于seq id no：1的氨基酸序列中的第217、310、403和462位的任一个或多个氨基酸被另一种氨基酸取代，同时与seq id no：1的多肽具有约60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％以上的序列同一性。
39.在一个实施方案中，本技术的变体可以包括与由seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：23或seq id no：25表示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％同源性或同一性的氨基酸序列。
40.具体地，本技术的变体可以具有下列序列、包括下列序列、由下列序列组成或基本上由下列序列组成：由seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：23或seq id no：25表示的氨基酸序列。
41.在一个实施方案中，本技术的变体可以包括氨基酸序列，其中对应于seq id no：1的氨基酸序列的第217、310、403和462位的任一个或多个氨基酸是丙氨酸，并且与由seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：23或seq id no：25表示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.7％或99.9％的同源性或同一性。此外，显而易见的是，具有氨基酸序列的变体，其中氨基酸序列的一部分被删除、修饰、取代、保守取代或添加，可以落入本技术的范围内，只要该氨基酸序列具有这样的同源性或同一性，并且显示出与本技术的变体的功效相对应的功效。
42.例如，可以包括序列添加或删除、自然发生的突变、沉默突变或保守替换，其不会改变本技术的变体在n末端、c末端和/或氨基酸序列内的功能。
43.本文所用的术语“保守取代”是指用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一种氨基酸。这种氨基酸取代通常可以基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性而发生。通常，保守替代可能对蛋白质或多肽的活性几乎没有影响。
44.本文所用的术语“同源性”或“同一性”是指两个给定氨基酸序列或核苷酸序列之间的近似程度，并且可以表示为百分比。术语同源性和同一性通常可以互换使用。
45.保守多肽或多核苷酸序列的序列同源性或同一性可以通过标准比对算法来确定，并且可以与由所使用的程序建立的默认空位罚分一起使用。基本上，在中等或高度严格的条件下，通常预计同源或相同的序列将与全部或部分序列的整个长度杂交。很明显，在杂交多核苷酸中，还考虑了含有简并密码子而不是密码子的多核苷酸。
46.任何两个多核苷酸序列是否具有同源性、相似性或同一性，例如可以通过已知的计算机算法例如“fasta”程序使用默认参数来确定(pearson et alia,(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:2444)。或者，也可以通过needleman-wunsch算法(needleman and wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)来确定，该算法使用emboss包的needleman程序执行(emboss:the european molecular biology open software suite,rice et alia,2000,trends genet.16:276-277)(版本5.0.0或更高版本)(gcg程序包(devereux,
j.,et alia,nucleic acids research 12:387(1984))，blastp，blastn，fasta(atschul,s.f.,et alia,j molec biol 215:403(1990)；guide to huge computers,martin j.bishop,ed.,academic press,san diego,1994,and carillo et alia(1988)siam j applied math 48:1073)。例如，可以使用美国国立生物技术信息中心(ncbi)的blast或clustalw来确定同源性，相似性或同一性。
47.多肽或多核苷酸的同源性、相似性或同一性可以通过比较序列信息来确定，例如，使用例如gap计算机程序，如needleman et alia(1970),j mol biol.48:443，如smith and waterman,adv.appl.math(1981)2:482中公开的。总之，gap程序将同源性，相似性或同一性定义为通过将相似排列的符号(即核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列中较短的符号总数而获得的值。gap程序的默认参数可能包括(1)一元比较矩阵(包含1表示身份的值和0表示非身份的值)和gribskov et alia(1986),nucl.acids res.14:6745，如schwartz and dayhoff,eds.,atlas of protein sequence and structure,national biomedical research foundation,pp.353-358(1979)披露(或ednafull替换矩阵(ncbi nuc4.4的emboss版本))；(2)每个空位罚分3.0，每个空位中每个符号额外罚分0.10(或空位开放罚分10，缺口扩大处罚0.5)；(3)对末端空位不进行处罚。
48.在一个实施方案中，本技术的变体可具有arog醛缩酶活性。在一个实施方案中，与野生型或非修饰的arog醛缩酶相比，本技术的变体可能具有能够增加支链氨基酸的生产能力的活性。在一个实施方案中，与野生型或非修饰的arog醛缩酶相比，本技术的变体可以具有能够降低支链氨基酸生产途径中副产物的生产水平的活性。在一个实施方案中，与野生型或未修饰的arog醛缩酶相比，本技术的变体可具有减弱的活性，但不限于此。
49.本技术的另一方面提供了编码本技术的多核苷酸变体。
50.本文所用的“多核苷酸”，其是由核苷酸单体组成的聚合物，通过共价键连接在长链中，是具有至少一定长度的dna或rna链。更具体地说，它可以指编码变体的多核苷酸片段。
51.编码本技术的变体的多核苷酸序列可以包括编码由seq id no：3、seq id no：5、seq id no：7、seq id no：9、seq id no：23或seq id no：25表示的氨基酸序列的核苷酸序列。作为本技术的一个示例，本技术的多核苷酸可以具有或包括seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：24或seq id no：26的序列。此外，本技术的多核苷酸可以由seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：24或seq id no：26的序列组成或主要由上述序列组成。
52.本技术的多核苷酸可以在编码区域内经历各种修饰，其范围内不会改变本技术变体的氨基酸序列，由于密码子简并性或考虑到本技术的变体要表达的生物体中优选的密码子。具体地，本技术的多核苷酸可以具有或包括与seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id：24或seq id no：26的序列具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上和100％以下同源性或同一性的核苷酸序列，或可由或基本上由与seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：24或seq id no：26的序列具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上和100％以下同源性或同一性的核苷酸序列组成，但不限于此。
53.特别地，在具有同源性或同一性的序列中，编码对应于seq id no：4、seq id no：6、seq id no：8、seq id no：10、seq id no：24或seq id no：26的第217、310、403和462位的氨基酸的密码子可以是编码丙氨酸的密码子之一。
54.此外，本技术的多核苷酸可以包括探针，其可以从已知的基因序列制备，例如，任何序列可以与与本技术的全部或部分多核苷酸序列互补的序列杂交，严格无限制。“严格条件”是指允许多核苷酸之间进行特定杂交的条件。这些条件在文献中有具体描述(j.sambrook et alia,molecular cloning,a laboratory manual,2nd edition,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,new york,1989；f.m.ausubel et alia,current protocols in molecular biology,john wiley&sons,inc.,new york,9.50-9.51,11.7-11.8)。例如，严格条件可以包括具有70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同源性或同一性的高同源性或同一性的基因彼此杂交，并且具有低于上述同源性或同一性的同源性或同源性的基因彼此不杂交，或southern杂交的洗涤条件，即在对应于60℃，1
×
ssc，0.1％sds，具体地60℃，0.1
×
ssc，0.1％sds，更具体地说是68℃，0.1
×
ssc，0.1％sds的盐浓度和温度下洗涤一次，具体地，洗涤两次或三次。
55.杂交要求两个核酸含有互补序列，尽管碱基之间的错配取决于杂交的严格程度。术语“互补”用于描述可以相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，关于dna，腺苷与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本技术的多核苷酸可以包括与整个序列互补的分离核苷酸片段以及与其基本相似的核酸序列。
56.具体地，与本技术的多核苷酸具有同源性或同一性的多核苷酸可以使用杂交条件(包括在上述条件下在tm值为55℃的杂交步骤)进行检测。此外，tm值可以是60℃、63℃或65℃，但不限于此，并且可以由本领域技术人员根据其目的适当地进行调整。
57.杂交多核苷酸的适当严格性取决于多核苷酸的长度和互补程度，并且这些变量是本领域公知的(例如，sambrook等人)。
58.本技术的又一方面提供了含有本技术的多核苷酸的载体。所述载体可以是用于在宿主细胞中表达多核苷酸的表达载体，但不限于此。
59.本文所用的术语“载体”是指含有编码目标多肽的核苷酸序列的dna构建体可操作地连接到合适的表达调控区(表达调控序列)，以便能够在合适的宿主细胞中表达目标多肽。所述表达调控序列可以包括能够启动转录的启动子、用于调节转录的任何操作员序列、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及用于调节转录终止和翻译的序列。一旦转化为合适的宿主细胞，载体可以独立于宿主基因组进行复制或功能，或者可以整合到宿主基因组中。
60.本技术中使用的载体没有特别限制，可以使用本领域已知的任何载体。通常使用的载体的例子可以包括天然或重组质粒、cosmid、病毒和噬菌体。例如，作为噬菌体载体或cosmid载体，可以使用pwe15，m13，mbl3，mbl4，ixii，ashii，apii，t10，t11，charon4a和charon21a等；作为质粒载体，可以使用基于pdc，pbr，puc，pbluescriptii，pgem，ptz，pcl，pet等的质粒载体。具体地，可以使用pdc，pdcm2，pacyc177，pacyc184，pcl，peccg117，puc19，pbr322，pmw118和pcc1bac载体。
61.在一示例中，编码目标多肽的多核苷酸可以通过载体插入染色体中，用于细胞内
染色体插入。将多核苷酸插入染色体可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过同源重组，但不限于此。载体还可以包括选择标记以确认插入到染色体中。选择标记用于选择用载体转化的细胞，即用于确认靶核酸分子是否已插入，并且可以使用提供可选表型的标记，例如耐药性、营养性、对细胞毒性药物的抵抗力或表面蛋白的表达。只有表达选择标记的细胞才能在用选择性试剂处理的环境中存活或显示不同的表型，因此可以选择转化的细胞。
62.本文所用的术语“转化”是指将含有编码目标多肽的多核苷酸的载体引入宿主细胞或微生物中，使得由该多核苷酸编码的多肽能够在宿主细胞中表达。只要转化的多核苷酸能在宿主细胞中表达，转化后的多核苷酸是整合到宿主细胞的染色体中并位于其中还是位于染色体外并不重要，两种情况都可以包括在内。此外，所述多核苷酸可包括编码所述目标多肽的dna和rna。多核苷酸可以以任何形式引入，只要它可以引入宿主细胞并在其中表达。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式引入宿主细胞，表达盒是一种基因构建体，包括其自主表达所需的所有元件。表达盒通常可以包括可操作地与多核苷酸连接的启动子、转录终止子、核糖体结合位点或翻译终止子。所述表达盒可以是可自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以按原样引入宿主细胞中，并且可以操作地与在宿主细胞中表达所需的序列连接，但不限于此。
63.此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指多核苷酸序列在功能上与启动子序列相连，启动子序列启动和介导编码本技术的目标变体的多核苷酸的转录。
64.本技术的又一方面提供了棒杆菌属(corynebacterium)微生物，包括本技术的一个或多个变体、本技术的多核苷酸和本技术的载体。
65.微生物可以包括本技术的多肽变体、编码多肽的多核苷酸、或含有本技术的多核苷酸的载体。
66.本文所用的术语“微生物”或“菌株”包括所有野生型微生物，或天然或人工转基因微生物，并且可以是其中特定机制由于插入外源基因而减弱或增强的微生物，或者增强或失活的内源性基因的活性，并且可以是包括基因修饰以产生所需多肽的微生物，蛋白质或产品。
67.本技术的菌株可以是包括本技术的一个或多个变体、本技术的多核苷酸和含有本技术的多核苷酸的载体的菌株；为表达本技术的变体或本技术的多核苷酸而修饰的菌株；表达本技术变体或本技术多核苷酸的菌株(例如重组菌株)；或具有本技术的变体活性的菌株(例如，重组菌株)，但不限于此。
68.本技术的菌株可以是具有支链氨基酸生产能力的菌株。
69.本技术的菌株是具有自然产生arog醛缩酶或支链氨基酸能力的微生物，或将本技术的变体或编码相同的多核苷酸(或含有多核苷酸的载体)引入到arog醛缩酶或亲本菌株中具有产生支链氨基酸的能力和/或产生支链氨基酸的能力的微生物生产力已经传授，但不限于此。
70.在一示例中，本技术的菌株菌株是用含有本技术的多核苷酸或编码本技术变体的多核苷酸的载体转化以表达本技术的变体的细胞或微生物，并且为了本技术的目的，菌株可以包括所有能够产生支链氨基酸的微生物，包括本技术的变体。例如，本技术的菌株可以是重组菌株，其中支链氨基酸的生产能力在表达arog醛缩酶变体时得到提高，方法是将编码本技术变体的多核苷酸引入天然野生型微生物或用于生产支链氨基酸的微生物中。支链
氨基酸生产能力增加的重组菌株可以是与天然野生型微生物或arog醛缩酶非修饰微生物(即表达野生型arog醛缩酶的微生物)相比支链氨基酸生产能力增强的微生物，但不限于此。
71.在一示例中，所述arog醛缩酶为非修饰微生物，要比较目标菌株以确定支链氨基酸生产能力的增加，可以是谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032菌株。在另一实例中，所述arog醛缩酶为非修饰微生物，要比较的目标菌株以确定支链氨基酸生产能力的增加，可以是cj l-8109、kccm12739p(ca10-3101)或kccm11201p，但不限于此。
72.在一示例中，重组菌株可具有与修饰前的亲本菌株或非修饰微生物相比，支链氨基酸的生产能力增加约1％以上，具体而言，约3％或约5％，但不限于此，只要其具有与修饰前的亲本菌株或非修饰微生物的生产能力相比增加 值。
73.在另一实例中，重组菌株的产生支链氨基酸的产生可减少约50％以下，具体而言，与修饰前的亲本菌株或非修饰微生物相比，可减少约30％以下或约10％以下，但不限于此。
74.本文所用的术语“约”是指包括所有
±
0.5、
±
0.4、
±
0.3、
±
0.2、
±
0.1等的范围，并且它包括紧跟在术语“以上”之后的所有值或那些在类似范围内，但不限于此。
75.本文所用的术语“支链氨基酸”是指在侧链中具有支链烷基的氨基酸，并且包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。具体地，在本技术中，支链氨基酸可以是l-支链氨基酸，并且l-支链氨基酸可以是选自l-缬氨酸、l-亮氨酸和l-异亮氨酸中的一种以上，但仅限于此。
76.在本技术中，支链氨基酸生产过程中产生的副产物是指支链氨基酸以外的物质，具体地说，芳族氨基酸，更具体地说，选自l-酪氨酸和l-苯丙氨酸中的一种以上，但不限于此。
77.如本文所用，术语“非修饰微生物”并不排除含有可能在微生物中自然发生的突变的菌株，并且可以指野生型菌株或天然型菌株本身，或者由于自然或人为因素引起的遗传修饰而改变性状之前的菌株。例如，非改性微生物可以指在本技术的arog醛缩酶变体中尚未引入的菌株或引入前的菌株。“非修饰微生物”可与“修饰前菌株”、“修饰前微生物”、“非突变菌株”、“非修饰菌株”、“非突变微生物”或“参考微生物”互换使用。
78.在一个实施方案中，本技术的微生物可以是静止棒杆菌(corynebacterium stationis)、粗乳棒杆菌(corynebacterium crudilactis)、沙漠棒杆菌(corynebacterium deserti)、高效棒杆菌(corynebacterium efficiens)、美棒杆菌(corynebacterium cal lunae)、谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)、奇异棒杆菌(corynebacterium singulare)、耐盐棒杆菌(corynebacterium halotolerans)、纹带棒杆菌(corynebacterium striatum)、产氨棒杆菌(corynebacterium ammoniagenes)、污染棒杆菌(corynebacterium pol lutisoli)、模仿棒杆菌(corynebacterium imitans)、睾丸棒杆菌(corynebacterium testudinoris)或微黄棒杆菌(corynebacterium flavescens)。
79.本技术的微生物还可以包括修饰以增加支链氨基酸的生产能力。
80.在一个实施方案中，本技术的微生物可以包括一种以上活性变更的异丙基苹果酸合酶、高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱水酶、支链氨基酸氨基转移酶和柠檬酸合酶。
81.在一个实施方案中，本技术的微生物可以是其中一种以上异丙基苹果酸合酶、支链氨基酸氨基转移酶、高丝氨酸脱氢酶和苏氨酸脱水酶的活性进一步增强的微生物。
82.在一个实施方案中，本技术的微生物可以是其中柠檬酸合酶活性进一步减弱的微
生物。
83.然而，本技术不限于上述描述，并且本领域技术人员可以根据要生产的支链氨基酸适当地选择包含在微生物中的附加修饰。
84.如本文所用，多肽活性的“增强”意味着多肽的活性与其内源性活性相比增加。增强可以与激活、上调、过表达、增加等术语互换使用。特别是，术语激活、增强、上调、过表达和增加可以包括两种情况，其中表现出最初不具有的活动，或者与内源性活性或修饰前的活动相比活性增强。“内源性活性”是指亲本菌株或非修饰微生物在转化前原本具有的特定多肽的活性，当微生物的性状因自然或人为因素而通过基因改造而改变时，可以与“修饰前活性”互换使用。与其内源性活性相比，多肽活性的“增强”、“上调”、“过表达”或“增加”意味着与转化前最初由亲本菌株或未修饰微生物具有的特定多肽相比，活性和/或浓度(表达水平)得到改善。
85.增强可以通过引入外来多肽，或者通过增强内源性多肽的活性和/或浓度(表达水平)来实现。多肽活性的增强可以通过多肽活性水平，表达水平或从多肽排泄的产物量的增加来确认。
86.多肽活性的增强可以通过本领域公知的各种方法应用，并且不受限制，只要它能够增强目标多肽的活性与修饰前的微生物相比。具体地，可以使用本领域技术人员熟知的基因工程和/或蛋白质工程，这是分子生物学的常用方法，但该方法不限于此(例如，sitnicka et alia functional analysis of genes.advances in cell biology.2010,vol.2.1-16,sambrook et alia molecular cloning 2012等等)。
87.具体地，本技术的多肽的增强可以通过以下途径实现：
88.(1)增加编码多肽的多核苷酸的细胞内拷贝数；
89.(2)用具有强活性的序列替换染色体上编码多肽的基因的表达调控区；
90.(3)修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或编码5'-utr的核苷酸序列；
91.(4)修饰多肽的氨基酸序列，使其增强多肽的活性；
92.(5)修改编码多肽的多核苷酸序列，使得多肽的活性得到增强(例如，修改多肽基因的多核苷酸序列以编码已以增强多肽的活性的方式修饰的多肽)；
93.(6)引入具有所述多肽活性的外源多肽或编码所述多肽的外源多核苷酸；
94.(7)编码多肽的多核苷酸的密码子优化；
95.(8)分析多肽的三级结构并由此选择和修饰暴露位点，或对其进行化学修饰；或
96.(9)选自上述(1)至(8)中的两个或多个的组合，但不限于此。
97.更具体地，
98.(1)增加编码多肽的基因的细胞内拷贝数的方法可以通过引入载体来实现，该载体可操作地与编码多肽的多核苷酸连接并且能够复制和发挥作用，而不管宿主细胞如何，进入宿主细胞。或者，该方法可以通过将编码多肽的多核苷酸的一个拷贝或两个拷贝引入宿主细胞的染色体来实现。引入染色体可以通过引入载体来实现，载体能够将多核苷酸插入宿主细胞的染色体中，进入宿主细胞，但不限于此。载体与上述相同。
99.(2)将编码多肽的基因的表达调控区(或表达调控序列)替换为具有强活性的序列的方法可以通过诱导对序列的修饰来实现，通过删除、插入、非保守或保守替换，或其组合来进一步增强表达调控区的活性，或者用具有更强活性的序列替换序列。所述表达调控区
可包括，但不特别限于，启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及调节转录和翻译终止的序列。在一示例中，该方法可包括用强启动子替换原始启动子，但不限于此。
100.强启动子的实例可以包括cj1至cj7启动子(us 7662943 b2)、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体pr启动子、pl启动子、tet启动子、gapa启动子、spl7启动子、spl13(sm3)启动子(us 10584338 b2)、o2启动子(us 10273491 b2)、tkt启动子、ycca启动子等，但不限于此。
101.(3)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录本的5'-utr的方法可以实现，例如，通过用编码另一个起始密码子的核苷酸序列代替核苷酸序列，与内源性起始密码子相比，该多肽具有更高的表达率，但不限于此。
102.所述(4)和(5)修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的方法可以通过诱导对序列的修饰来实现，通过删除、插入、非保守或保守地取代所述多肽的氨基酸序列或编码所述多肽的多核苷酸序列，或其组合来进一步增强所述多肽的活性，或者通过用修饰的氨基酸序列或多核苷酸序列替换序列以具有更强的活性，或者用氨基酸序列或多核苷酸序列修饰以增强活性。替换可以通过同源重组将多核苷酸插入染色体来具体地进行，但不限于此。本文中使用的载体还可以包括选择标记以确认插入到染色体中。选择标记与上述相同。
103.(6)引入具有多肽活性的外来多核苷酸的方法可以通过向宿主细胞中引入编码多肽的外源多核苷酸来实现，该多肽表现出与多肽相同或相似的活性。无论其来源或序列如何，只要外源多核苷酸表现出与多肽相同或相似的活性，都可以不受限制地使用。所述引入可以通过选择本领域已知的转化方法由本领域普通技术人员之一进行，并且引入的多核苷酸在宿主细胞中的表达能够产生多肽，从而增加其活性。
104.(7)编码多肽的密码子优化方法可以通过对内源性多核苷酸进行密码子优化以增加宿主细胞内的转录或翻译来实现，或者通过优化其密码子使得外来多核苷酸的优化转录和翻译可以在宿主细胞内实现。
105.(8)分析多肽的三级结构并由此选择和修饰暴露位点的方法，或者对该方法进行化学修饰可以实现，例如，通过将要分析的多肽的序列信息与数据库进行比较，其中存储了已知蛋白质的序列信息，根据序列相似程度确定候选蛋白模板，从而基于信息确认结构，从而选择和改造或修改要修改或化学修饰的暴露部位。
106.这种多肽活性的增强可能意味着多肽的活性或浓度(表达水平)相对于在改性前在野生型或微生物菌株中表达的多肽的活性或浓度增加，或者说由多肽产生的产物的量增加，但不限于此。
107.本技术的微生物中部分或全部多核苷酸的修饰可以通过(a)使用用于染色体插入微生物的载体或使用工程核酸酶(例如crispr-cas9)进行基因组编辑和/或(b)可以由光诱导，例如紫外线和辐射，等，和/或化学处理来实现，但不限于此。修饰部分或全部基因的方法可以包括使用dna重组技术的方法。例如，可以通过将核苷酸序列或含有与靶基因同源的核苷酸序列的载体注射到微生物中来删除部分或全部基因以诱导同源重组。注射的核苷酸序列或载体可以包括显性选择标记，但不限于此。
108.如本文所用，术语“减弱”多肽活性是一个综合概念，包括与其内源性活性相比活性降低或无活性。减弱可以与失活、缺乏、下调、减少、减少、衰减等术语互换使用。
109.弱化还可以包括由于编码多肽的多核苷酸的突变而导致多肽本身的活性与微生
物最初具有的多肽的活性相比降低或去除的情况；与天然菌株相比，由于编码多肽的多核苷酸基因表达受到抑制或多肽翻译受到抑制等，细胞内多肽活性和/或浓度(表达水平)的总体水平降低；多核苷酸根本不表达的情况；和/或即使多核苷酸表达也没有观察到多肽活性的情况。如本文所用，术语“内源性活性”是指当性状由于自然或人为因素引起的遗传修饰而改变时，最初由亲本菌株、野生型或非修饰的微生物在转化前具有的特定多肽的活性，并且可以与“修饰前的活性”互换使用。表达“与其内源性活性相比，多肽活性”失活、缺乏、降低、下调、降低或减弱“意味着多肽活性与转化前最初由亲本菌株或未修饰的微生物具有的特定多肽的活性相比降低。
110.多肽活性的减弱可以通过本领域已知的任何方法进行，但该方法不限于此，并且可以通过应用本领域公知的各种方法(例如，nakashima n et alia,bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing.int j mol sci.2014；15(2):2773-2793,sambrook et alia molecular cloning 2012等)。
111.具体地，本技术的多肽的弱化可以通过以下方法实现：
112.(1)删除编码多肽的部分或全部基因；
113.(2)修饰表达调控区(表达调控序列)，使得编码多肽的基因的表达降低；
114.(3)修饰构成多肽的氨基酸序列，使得多肽活性被去除或削弱(例如，在氨基酸序列上删除/取代/添加一个或多个氨基酸)。
115.(4)修改编码多肽的基因序列，使得多肽的活性被移除或削弱(例如，在多肽基因的核苷酸序列上删除/取代/添加一个或多个核苷酸以编码已被修饰以去除或削弱多肽的活性；
116.(5)修饰编码多肽的基因转录本的起始密码子或编码5'-utr的核苷酸序列；
117.(6)引入反义寡核苷酸(例如反义rna)，其与编码多肽的基因的转录本互补结合；
118.(7)在编码多肽的sd序列的前端加入与shine-dalgarno(sd)序列互补的序列，形成二级结构，从而抑制核糖体附着；
119.(8)逆转录工程(rte)，其在编码多肽的基因序列的开放阅读框(orf)的3'末端添加启动子，其被反向转录；或
120.(9)选自上述方法(1)至(8)中的两种或两种以上的组合，但不限于此。
121.例如，
122.(1)删除编码多肽的部分或全部基因的方法可以通过删除染色体内编码内源性靶多肽的所有多核苷酸来实现，或者通过用具有部分删除的核酸序列的多核苷酸或标记基因替换多核苷酸。
123.此外，(2)修饰表达调控区(表达调控序列)的方法可以通过诱导对表达调控区(表达调控序列)的修饰来实现，通过删除、插入、非保守取代或保守取代，或其组合；或者用活性较弱的序列替换序列。所述表达调控区可以包括启动子、操纵子序列、编码核糖体结合位点的序列、以及用于调节转录和翻译的序列，但不限于此。
124.此外，(5)修饰编码起始密码子的核苷酸序列或编码多肽的基因转录本的5'-utr的方法可以实现，例如，通过用编码另一个起始密码子的核苷酸序列替换核苷酸序列，其多肽表达率低于内源性起始密码子，但不限于此。
125.此外，修饰氨基酸序列或多核苷酸序列的(3)和(4)方法可以通过对多肽的氨基酸
序列或编码多肽的多核苷酸序列进行缺失、插入、非保守或保守取代来诱导对序列的修饰来实现，或其组合以进一步削弱多肽的活性，或通过用被修饰为具有较弱活性的氨基酸序列或多核苷酸序列、或被修饰为不具有活性的氨基酸顺序或多核苷酸顺序取代该序列。例如，可以通过将突变引入多核苷酸序列以形成终止密码子来抑制或削弱基因的表达，但不限于此。
126.(6)引入反义寡核苷酸(例如反义rna)的方法，其与编码多肽的基因的转录本互补结合可以在文献中找到[weintraub,h.et alia,antisense-rna as amolecular tool for genetic analysis,reviews-trends in genetics,vol.1(1)1986]。
[0127]
(7)在编码多肽的sd序列的前端添加与shine-dalgarno(sd)序列互补的序列以形成二级结构的方法，从而抑制核糖体的附着可以通过抑制mrna翻译或降低其翻译速度来实现。
[0128]
(8)逆转录工程(rte)，其添加启动子，其被反向转录，在编码多肽的基因序列的开放阅读框(orf)的3'末端，可以通过形成与编码多肽的基因转录本互补的反义核苷酸来实现削弱活性。
[0129]
在本技术的微生物中，变异体、多核苷酸、载体和支链氨基酸与其它方面描述的相同。
[0130]
甚至本技术的另一方面提供了生产支链氨基酸的方法，包括在培养基中培养棒杆菌属(corynebacterium)微生物。
[0131]
本文所用的术语“培养”是指本技术的棒杆菌属(corynebacterium)微生物在适当控制的环境条件下生长。本技术的培养过程可以在合适的培养基和本领域已知的培养条件下进行。这样的培养方法可以容易地根据所选择的菌株调整供本领域技术人员使用。具体而言，培养可以是分批培养、连续培养和/或补料分批培养，但不限于此。
[0132]
本文所用的术语“培养基”是指其含有培养本技术的棒杆菌属(corynebacterium)微生物所需的营养物质作为主要成分的物质的混合物，并且它提供营养物质和生长因子，以及对于生存和生长至关重要的水。具体地，本技术中用于培养棒杆菌属(corynebacterium)微生物的培养基和其它培养条件可以是用于常规培养微生物的任何培养基，而没有任何特别限制。然而，本技术的棒杆菌属(corynebacterium)微生物可以在含有适当碳源、氮源、磷源、无机化合物、氨基酸和/或维生素的常规培养基中在有氧条件下培养，同时调节温度、ph等。
[0133]
具体地，用于棒杆菌属(corynebacterium)微生物的培养基可以在文献中找到[“manual of methods for general bacteriology”by the american society for bacteriology(washington d.c.,usa,1981)]。
[0134]
在本技术中，碳源可以包括碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等；糖醇，如甘露醇、山梨糖醇等；有机酸，如丙酮酸、乳酸、柠檬酸等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸等。此外，碳源可包括天然有机营养物质，例如淀粉水解物、糖蜜、黑糖蜜、米糠、木薯、甘蔗糖蜜、玉米浸泡液等。具体地，可以使用碳水化合物如葡萄糖和灭菌的预处理糖蜜(即糖蜜转化为还原糖)，此外，可以不受限制地使用适量的各种其它碳源。这些碳源可以单独使用，也可以以两种以上的组合使用，但不限于此。
[0135]
所述氮源可包括无机氮源，如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵
等；氨基酸，如谷氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺等；和有机氮源，如蛋白胨、nz-胺、肉类提取物、酵母提取物、麦芽提取物、玉米浸泡液、酪蛋白水解物、鱼或其分解产物、脱脂豆饼或其分解产物等。这些氮源可以单独使用，也可以以两种以上的组合使用，但不限于此。
[0136]
磷源可以包括磷酸一钾、磷酸二钾或相应的含钠盐等。无机化合物的实例可包括氯化钠、氯化钙、氯化铁、硫酸镁、硫酸铁、硫酸锰、碳酸钙等。此外，可能包括氨基酸、维生素和/或适当的前体。这些构成成分或前体可以分批或连续的方式添加到培养基中，但这些磷源不限于此。
[0137]
培养基的ph值可以通过以适当的方式向培养基中加入诸如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸、硫酸等的棒杆菌属(corynebacterium)微生物来调节。此外，在培养过程中，可以添加消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯以防止泡沫产生。此外，可以将氧气或含氧气体注入介质中以维持介质的有氧状态；可以注入氮气、氢气或二氧化碳气体而不注入气体以维持介质的厌氧或微好氧状态，但气体不限于此。
[0138]
本技术中的培养基温度可以在20℃至45℃的范围内，具体地说，在25℃至40℃的范围内，并且培养可以进行约10至160小时，但不限于此。
[0139]
本技术培养产生的支链氨基酸可以释放到培养基中或保留在细胞中。
[0140]
本技术的支链氨基酸的制备方法还可以包括制备本技术的棒杆菌属(corynebacterium)微生物的步骤、制备用于培养菌株的培养基的步骤，或其组合(无论顺序如何，以任何顺序)，例如在培养步骤之前。
[0141]
本技术的支链氨基酸的制备方法还可以包括从本技术的棒杆菌属(corynebacterium)的培养基(培养基)或微生物中回收支链氨基酸的步骤。回收步骤可以进一步包括在培养步骤之后。
[0142]
在回收步骤中，可以使用本技术的微生物培养方法收集所需的支链氨基酸，例如，使用本领域已知的分批培养、连续培养或补料分批培养方法的合适方法。例如，可以使用离心、过滤、用蛋白质结晶沉淀剂处理(盐析法)、萃取、超声破碎、超滤、透析等方法，可以使用各种色谱法，例如分子筛色谱(凝胶过滤)、吸附色谱、离子交换色谱、亲和色谱等，可以使用hplc或其组合，并且所需的支链氨基酸可以从培养基或微生物采用本领域已知的合适方法。
[0143]
此外，本技术的支链氨基酸的制备方法还可以包括纯化过程，其可以使用本领域已知的适当方法进行。在一示例中，当本技术的支链氨基酸的制备方法包括回收步骤和纯化步骤两者时，该回收步骤和纯化步骤可以间歇地(或连续地)进行，而不管顺序如何或同时进行，或者可以整合到一个步骤中，但该方法不限于此。
[0144]
在本技术的方法中，变体、多核苷酸、载体和微生物与其它方面描述相同。
[0145]
本技术的又一方面提供了用于生产支链氨基酸的组合物，包括本技术的变体、编码该变体的多核苷酸、含有多核苷酸的载体或棒杆菌属(corynebacterium)微生物，包括本技术的多核苷酸；含有相同物质的介质；或其中两种或两种以上的组合。
[0146]
本技术的组合物还可以包括组合物中常用于生产支链氨基酸的任何合适的赋形剂，并且这种赋形剂可以是例如防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂，但不限于此。
[0147]
在本技术的组合物中，变体、多核苷酸、载体、菌株、培养基和支链氨基酸与其它方
面描述的相同。
[0148]
本技术的又一方面提供了利用本技术的arog醛缩酶变体生产支链氨基酸的用途。
[0149]
本技术的又一方面提供了利用包括本技术的一个或多个arog醛缩酶变体；编码arog醛缩酶变体的多核苷酸；和含有多核苷酸的载体中的一种以上的微生物生产支链氨基酸的用途。
[0150]
在本技术的使用中，变体、多核苷酸、载体、微生物等与其它方面描述的相同。
[0151]
【实施本发明的方式】
[0152]
下面通过实施例对本技术进行详细描述。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，给出这些实施例仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
[0153]
【实施例1：arog醛缩酶突变的发现】
[0154]
【实施例1-1：含arog醛缩酶的载体的制备】
[0155]
为了制备具有磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酸醛缩酶活性的arog醛缩酶突变体文库，首先制备了含有arog醛缩酶的重组载体。为了扩增编码源自野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)的arog醛缩酶(seq id no：1，kegg id：ncgl2098)的arog基因(seq id no：2)，使用seq id no：11和12的引物基于野生型谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032的染色体作为模板进行pcr，在以下条件下：在94℃下变性1分钟，在58℃下退火30秒，以及使用pfu dna聚合酶在72℃下聚合1分钟的25个循环。所用引物的具体序列如表1所示。使用topo克隆试剂盒(invitrogen)将扩增产物克隆到大肠杆菌(e.coli)载体pcr2.1中以获得“pcr-arog”。
[0156]
【表1】
[0157]
seq id no：序列(5'
→
3')seq id no：11tgatgcgcgt cataatttagseq id no：12ctcatctctg actggacgtg
[0158]
【实施例1-2：arog醛缩酶突变文库的制备】
[0159]
基于实施例1-1中制备的载体，使用易于出错的pcr试剂盒(clontechpcr随机突变试剂盒)制备arog醛缩酶突变文库。使用seq id no：11和seq id no：12作为引物在每1000bp可能发生0至3个突变的条件下进行pcr反应。具体而言，在94℃预热30秒后，通过在94℃下重复变性30秒和在68℃下退火1分30秒的25个循环来进行pcr。使用由此获得的pcr产物作为大引物(50至125ng)，通过在95℃下重复变性50秒、在60℃下退火50秒和在68℃下聚合12分钟的25个循环进行pcr，并用dpni处理所得产物，通过热冲击法转化大肠杆菌(e.coli)dh5α，并将其接种到含有卡那霉素(25mg/l)的lb固体培养基上。选择20种这样转化的菌落获得质粒，并分析核苷酸序列。结果，证实了以2个突变/kb的频率在不同位置引入突变。收集了大约20,000个转化的大肠杆菌(e.coli)菌落并提取了质粒，这些质粒被命名为“ptopo-arog文库”。
[0160]
【实施例2：制备文库的评估和变体的选择】
[0161]
【实施例2-1：选择具有增加l-亮氨酸产生能力的突变菌株】
[0162]
将实施例1-2中制备的ptopo-arog文库通过电穿孔转化到野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032中，然后将其接种到含有25mg/l卡那霉素的营养培养基(表2)上，以选择10,000个插入突变基因的菌株菌落。每个选定的菌落被命名为
atcc13032/ptopo_arog(mt)1到atcc13032/ptopo_arog(mt)10,000。
[0163]
以下列方式评估每个菌落的发酵效价，以便在获得的10,000个菌落中鉴定其中l-亮氨酸产量增加、且芳族氨基酸中的l-酪氨酸和l-苯丙氨酸减少的菌落。
[0164]
【表2】
[0165][0166]
将每个菌落用铂环接种到含有25μg/ml卡那霉素的25ml高压灭菌生产培养基(表2)中的250ml角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养60小时。培养完成后，通过高效液相色谱法(hplc，shimazdu lc20a)测定l-亮氨酸的产量，以及芳族氨基酸中的l-酪氨酸和l-苯丙氨酸。
[0167]
在由此获得的10,000个菌落中，选择了与野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)菌株(atcc13032)相比具有最改善的l-亮氨酸生产能力的4个菌株，它们是：atcc13032/ptopo_arog(mt)2256、atcc13032/ptopo_arog(mt)6531、atcc13032/ptopo_arog(mt)8316和atcc13032/ptopo_arog(mt)9426。所选菌株中产生的l-亮氨酸(leu)、l-酪氨酸(tyr)和l-苯丙氨酸(phe)的浓度如下表3所示。
[0168]
【表3】
[0169]
菌株名称leu(g/l)tyr(g/l)phe(g/l)atcc130320.871.281.87atcc13032/ptopo_arog(mt)22561.250.430.57atcc13032/ptopo_arog(mt)65311.230.150.19atcc13032/ptopo_arog(mt)83161.310.540.63atcc13032/ptopo_arog(mt)94261.270.310.34
[0170]
如以上表3所示，证实了在arog基因中具有突变的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032/ptopo_arog(mt)2256与亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032相比显示出增加了约1.4倍的l-亮氨酸产生能力。此外，经证实，atcc13032/ptopo_arog(mt)6531、atcc13032/ptopo_arog(mt)8316、atcc13032/ptopo_arog(mt)9426与亲本菌株相比，l-亮氨酸生成能力提高了约1.4倍。此外，确认atcc13032/ptopo_arog(mt)2256、atcc13032/ptopo_arog(mt)6531、atcc13032/ptopo_arog(mt)8316、atcc13032/ptopo_arog(mt)9426的所有4种菌株均显示l-酪氨酸产量降低了2.4至8.5倍，l-苯丙氨酸产量减少了3至10倍。
[0171]
【实施例2-2：确认l-亮氨酸产量增加，芳族氨基酸产量减少的突变菌株的突变】
[0172]
为了确认所选择的4个突变菌株的arog基因突变，使用表1中列出的seq id no：11和seq id no：12的引物，基于每个突变菌株的dna，在94℃变性5分钟，然后在94℃变性30秒，在55℃退火30秒，在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进
行pcr，然后进行dna测序。
[0173]
作为测序的结果，确认在atcc13032/ptopo_arog(mt)2256菌株中，arog基因的第649、650和651个核苷酸，即cgc被gcg取代。这表明可以编码一种变体(以下简称r217a)，其中精氨酸(arog醛缩酶的第217个氨基酸)被丙氨酸取代。arog醛缩酶突变体(r217a)的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的arog醛缩酶突变体的核苷酸序列如seq id no：3和4表示。
[0174]
此外，在atcc13032/ptopo_arog(mt)6531菌株中，证实作为arog基因的第928和第929个核苷酸的aa被gc取代。这表明可以编码用丙氨酸取代赖氨酸(即arog醛缩酶的第310个氨基酸)的变体(以下简称k310a)。arog醛缩酶突变体(k310a)的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的arog醛缩酶突变体的核苷酸序列如seq id no：5和6表示。
[0175]
在atcc13032/ptopo_arog(mt)8316菌株中，确认cgc(即arog基因的第1207至1209个核苷酸)被gcg取代。这表明可以编码用丙氨酸取代精氨酸(即arog醛缩酶的第403个氨基酸)的变体(以下简称r403a)。arog醛缩酶突变体(r403a)的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的arog醛缩酶突变体的核苷酸序列由seq id no：7和8表示。
[0176]
在atcc13032/ptopo_arog(mt)9426菌株中，证实作为dahp基因的第1385个和第1386个核苷酸的aa被cg取代。这表明可以编码谷氨酸(即arog醛缩酶的第462个氨基酸)被丙氨酸取代的突变体(以下简称e462a)。arog醛缩酶突变体(e462a)的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的arog醛缩酶突变体的核苷酸序列由seq id no：9和10表示。
[0177]
因此，在以下实施例中，进行了实验以确定突变(r217a、k310a、r403a、e462a)是否影响棒杆菌属(corynebacterium)微生物中l-亮氨酸和芳族氨基酸的产生。
[0178]
【实施例3：确认l-亮氨酸、l-酪氨酸和l-苯丙氨酸产生选定突变菌株的能力】
[0179]
【实施例3-1：制备含有arog醛缩酶突变的插入载体】
[0180]
为了将实施例2中选择的突变引入菌株中，制备插入载体。使用定点诱变制备引入arog(r217a，k310a，r403a，e462a)突变的载体。以野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032的染色体为模板，使用seq id no：13和14以及seq id no：15和16的引物对进行pcr以产生r217a突变，并使用seq id no：13和17以及seq id no：15至18的引物对产生k310a突变。此外，使用seq id no：13和19以及seq id no：15和20的引物对进行pcr以产生r403a突变，并且使用seq id no：13和21以及seq id nos 15和22的引物对来产生e462a突变。具体而言，在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。所用引物的具体序列如表4所示。
[0181]
【表4】
[0182]
seq id no：序列(5'
→
3')seq id no：13gtgaattcga gctcggtacc cagttgaatg ctaccaacttgseq id no：14cacgagcaag agcctcgtac gctgcaccag ctgggseq id no：15ggtcgactct agaggatccc cgctgttatt actgtgcctgseq id no：16gaactcccca gctggtgcag cgtacgaggc tcttgctcgseq id no：17gggtgatacc aggaccaatc gcgatgccga ttgggttagseq id no：18ctctaaccca atcggcatcg cgattggtcc tggtatcacseq id no：19ctgggtgggt gcccaatgcc gcgtggacct cgaagaag
seq id no：20gggcttcttc gaggtccacg cggcattggg cacccacseq id no：21aagcttagtt acgcagcatc gctgcaacga ggaaagccseq id no：22gttggctttc ctcgttgcag cgatgctgcg taactaagc
[0183]
利用将所得pcr产物用smai限制性内切酶切断的线性pdcm2载体(韩国专利公开kr 10-2020-0136813a)和in-fusion酶融合dna片段之间的末端15个碱基的相同序列而克隆而制备了取代arog的氨基酸的载体，即'pdcm2-arog(r217a)'、'pdcm2-arog(k310a)'、'pdcm2-arog(r403a)'，和“pdcm2-arog(e462a)”。此外，通过变体的组合制备了用于取代arog的217、310、403和462位氨基酸的载体，'pdcm2-arog(r217a、k310a、e462a)'和'pdcm2 arog(r217-a、k310a、r403a、e462b)'。arog醛缩酶变体(r217a、k310a、e462a)的氨基酸序列和编码其的arog醛缩酶变体的核苷酸序列由seq id no：23和24表示。此外，arog醛缩酶变体(r217a、k310a、r403a、e462a)的氨基酸序列和编码其的arog醛缩酶变体的核苷酸序列由seq id no：25和26表示。
[0184]
【实施例3-2：atcc13032菌株的变体引入及其评估】
[0185]
通过电穿孔将实施例3-1中制备的pdcm2-arog(r217a)，pdcm2-arog(k310a)，pdcm2-arog(r403a)，pdcm2-arog(e462a)，pdcm2-arog(r217a，k310a，e462a)和pdcm2-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)载体转化进atcc13032，在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对选定的一代菌株进行次级交叉，并选择引入靶基因突变的菌株。通过使用表1中列出的seq id no：11和seq id no：12的引物进行pcr，然后分析核苷酸序列，确认将arog基因突变引入最终转化的菌株中。共生产了5个菌株，分别命名为atcc13032_arog_r217a，atcc13032_arog_k310a，atcc13032_arog_r403a，atcc13032_arog_e462a，atcc13032_arog_(r217a，k310a，e462a)和atcc13032_arog_(r217a，k310a，r403a，e462a)。
[0186]
对烧瓶发酵效价进行评估，以评价上述制备的6种菌株中l-亮氨酸和芳族氨基酸的产生能力。将上述制备的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032和atcc13032_arog_r217a、atcc13032_arog_k310a、atcc13032_arog_r403a、atcc13032_arog_e462a、atcc13032_arog_(r217a、k310a、e462a)和atcc13032_arog_(r217a、k310a、r403a、e462a)各一个铂环接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养60小时以产生l-亮氨酸。培养完成后，用hplc测定l-亮氨酸，l-酪氨酸和l-苯丙氨酸的产生。每种测试菌株的培养基中的亮氨酸浓度如下表5所示。
[0187]
【表5】
[0188][0189]
如上表5所示，证实atcc13032_arog_r217a、atcc13032_arog_k310a、atcc13032_
arog_r403a、atcc13032_arog_e462a、atcc13032_arog_(r217a、k310a、e462a)和atcc13032_arog_(r217a、k310a、r403a、e462a)显示l-亮氨酸的产率比亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032提高约1.35倍至1.55倍。此外，证实l-酪氨酸的收率降低了2.5至8.5倍，l-苯丙氨酸的收率降低了约3.5至14倍。
[0190]
【实施例4：亮氨酸产生菌株中arog选择性突变产生亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能力的确认】
[0191]
即使棒杆菌属(corynebacterium)的野生型菌株能够产生亮氨酸，也只能产生非常微量的亮氨酸。因此，进行了一项实验以制备源自atcc13032的亮氨酸产生菌株，并引入选定的突变以确认产生亮氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的能力。具体实验如下进行。
[0192]
【实施例4-1：l-亮氨酸产生菌株cj l-8109的制备】
[0193]
作为生产高浓度l-亮氨酸的菌株，制备来自atcc13032的菌株包含：(1)突变(r558h)，其中leua基因的1673个核苷酸g被a取代，并且leua蛋白的第558个氨基酸精氨酸被组氨酸取代；(2)突变(g561d)，其中leua基因的1682和1683个核苷酸gc被at取代，第561个氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代；和(3)突变(p247c)，其中leua基因的第739和740个核苷酸cc被tg取代，并且第247个氨基酸脯氨酸被半胱氨酸取代。
[0194]
具体地，将含有leua基因突变的载体pdcm2-leua(p247c，r558h，g561d)通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032，并且在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对所选择的初级菌株进行二次交叉，并选择引入leua基因突变的菌株。通过使用表6的seq id no：27和seq id no：28的引物，在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的条件下进行pcr，确认将p247c，r558h，g561d突变引入最终转化的菌株中，并分析核苷酸序列。将用载体pdcm2-leua_(p247c，r558h，g561d)转化的atcc13032_leua_(p247c，r558h，g561d)株命名为“cj l-8105”。
[0195]
【表6】
[0196]
seq id no：序列(5'
→
3')27tatgcttcac cacatgactt c28aaatcatttg agaaaactcg agg
[0197]
为了提高这样制备的cj l-8105菌株中l-亮氨酸的产生能力，制备了其中编码支链氨基酸氨基转移酶的基因ilve突变体(v156a)的菌株(韩国专利第10-2143964号)。具体而言，通过电穿孔将含有ilve基因突变的pdcm2-ilve(v156a)载体转化到谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cjl-8105中，并在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对所选择的原代菌株进行二次杂交，并选择引入ilve基因突变的菌株。通过使用表7的seq id no：29和seq id no：30的引物，在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的条件下进行pcr，确认将突变引入最终转化的菌株中，并分析核苷酸序列，从而确认v156a突变的引入。用pdcm2 ilve(v156a)载体转化的菌株命名为“cj l-8108”。/p》
[0198]
【表7】
[0199]
seq id no：序列(5'
→
3')29gtcacccgat cgtctgaag 30gtcttaaaac cggttgat
[0200]
为了在这样制备的cjl-8108菌株中增加l-亮氨酸的产生能力，制作了引入了具有减弱的柠檬酸合酶活性的glta突变体(m312i；seq id no：41)的菌株。具体而言，通过电穿孔将含有glta基因突变的pdcm2-glta(m312i)载体转化到谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cj l-8108中，并在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对所选择的初级菌株进行二次交叉，并选择引入glta基因突变的菌株。通过使用表8的seq id no：31和seq id no：30的引物，在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的条件下进行pcr，确认将突变引入最终转化的菌株中，并分析核苷酸序列，从而确认m312i突变的引入。用pdcm2-glta(m312i)载体转化的菌株命名为“cj l-8109”。
[0201]
【表8】
[0202]
seq id no：序列(5'
→
3')31caatgctggc tgcgtacgc 32ctcctcgcga ggaaccaact
[0203]
【实施例4-2：cjl-8109菌株中arog醛缩酶变体的引入及其评价】
[0204]
用在实施例3-1中制备的载体pdcm2-arog(r217a)，pdcm2-arog(k310a)，pdcm2-arog(r403a)，pdcm2-arog(e462a)，pdcm2-arog(r217a，k310a，e462a)，pdcm2-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)载体转化亮氨酸产生菌株cj l-8109，在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对选定的一代菌株进行次级交叉，并选择引入靶基因突变的菌株。通过使用seq id no：11和seq id no：12的引物进行pcr并分析核苷酸序列来确认arog基因突变引入最终转化的菌株中，从而确认arog醛缩酶突变引入菌株中。制备的cjl-8109_arog_r217a命名为cj l-8110，cj l-8109_arog_k310a命名为cj l-8111，cjl-8109_arog_r403a命名为cj l-8112，cj l-8109_arog_e462a命名为cj l-8113，cjl-8109_arog_(r217a，k310a，e462a)命名为ca13-8114，cjl-8109_arog_(r217a，k310a，r403a，e462a)命名为cj l-8115。
[0205]
评价了这样制备的cjl-8110、cjl-8111、cjl-8112、cj l-8113、ca13-8114、cjl-8115和atcc13032、cj l-8109菌株的产亮氨酸能力。烧瓶培养以与实施例2相同的方法进行，培养完成后用hplc测定亮氨酸和芳族氨基酸的产生，培养结果如下表9所示。
[0206]
【表9】
[0207][0208]
如表9所示，产生l-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cjl-8110、cj l-8111、cj l-8112、cjl-8113、ca13-8114和cj l-8115的菌株在arog基因中具有额外的r217a、k310a、r403a和e462a突变，与亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032相比，亮氨酸产量增加了约4至5倍。此外，生产l-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cjl-8110、cj l-8111、cj l-813、ca13-8114和cj l-8115菌株与亲本菌株谷氨酸棒杆菌(cj l-8109)相比，l-亮氨酸生产能力提高了约1.2至1.6倍，l-酪氨酸生产能力和l-苯丙氨酸生产能力降低了约10至20倍。从以上结果可以证实，arog醛缩酶氨基酸序列中217、310、403和462位的氨基酸是对于产生l-亮氨酸和l-酪氨酸和l-苯丙氨酸(芳族氨基酸)而言重要的位置。
[0209]
由此制备的菌株ca13-8114于2021年1月18日根据布达佩斯条约保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(kccm)，保藏号为kccm12931p。
[0210]
【实施例5：确认产生异亮氨酸的菌株中arog选择突变的亮氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸产生能力】
[0211]
为了确认所选突变是否显示出对异亮氨酸的影响，异亮氨酸是作为亮氨酸的代表支链氨基酸，进行了实验以通过将突变引入产生异亮氨酸的棒杆菌属(corynebacterium)的产生异亮氨酸的菌株中来确认异亮氨酸的产生能力。具体实验如下。
[0212]
【实施例5-1：产l-异亮氨酸菌株ca10-3101的制备】
[0213]
产l-异亮氨酸菌株从野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032开发而成。具体而言，为了解除苏氨酸(生物合成途径中异亮氨酸的前体)的反馈抑制，用组氨酸取代编码高丝氨酸脱氢酶的基因hom的第407个氨基酸精氨酸(us 2020-0340022 a1)。具体而言，为了制备引入hom(r407h)的菌株，使用基于谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032的染色体的seq id no：33和34或seq id noc:35和36的引物对作为模板进行pcr。本文所用的引物序列如下表10所示。
[0214]
【表10】
[0215]
seq id no：序列(5'
→
3')33tcgagctcgg taccccgctt ttgcactcat cgagc 34cacgatcaga tgtgcatcat cat 35atgatgatgc acatctgatc gtg 36ctctagagga tccccgagca tcttccaaaa ccttg
[0216]
pfuultra
tm
高可靠性dna聚合酶(stratagene)用作pcr反应的聚合酶，通过在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟的28个循环来进行pcr。结果，在hom基因的突变周围分别获得了5'上游区域中的dna片段(1000bp)和3'下游区域中的脱氧核糖核酸片段(1000bp)。基于两个扩增的dna片段作为模板，使用seq id no：34和seq id no：35的引物，在95℃变性5分钟，然后在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合2分钟的28个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。
[0217]
结果，扩增了包括hom基因突变的dna片段(2kb)，其编码高丝氨酸脱氢酶变体，其中407位的精氨酸被组氨酸取代。使用pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化扩增产物，并将其用作制备载体的插入dna片段。同时，用限制性内切酶smai处理纯化的扩增产物后，在65℃下热处理20分钟的pdcm2载体与插入dna片段(扩增产物)的摩尔浓度(m)的比例设定为1:2，并且根据制造商的手册使用infusion cloning kit(takara)克隆载体，从而制备用于将hom(r407h)突变引入染色体的pdcm2-r407h载体。
[0218]
将如此制备的载体通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032并进行二次交叉，得到在染色体上包含hom(r407h)突变的菌株，并将该菌株命名为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032 hom(r407h)。
[0219]
为了释放对l-异亮氨酸的反馈并增加所制备的atcc13032 hom(r407h)中的活性，制备了一种引入作为编码l-苏氨酸脱水酶的基因的ilva突变体(t381a，f383a)的菌株。更具体地说，为了制备引入ilva(t381a，f383a)突变的菌株，使用seq id no：37和38或seq id no：39和40的引物对进行pcr，基于谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032的染色体作为模板。本文中使用的引物序列示于下面的表11中。
[0220]
【表11】
[0221]
seq id no：序列(5'
→
3')37tcgagctcgg tacccatgag tgaaacatac gtgtc 38gcgcttgagg tactctgcca gcgcgatgtc atcatccgg 39ccggatgatg acatcgcgct ggcagagtac ctcaagcgc 40ctctagagga tcccccgtca ccgacacctc caca
[0222]
pfuultra
tm
高可靠性dna聚合酶(stratagene)用作pcr反应的聚合酶，通过重复在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下聚合1分钟的28个循环来进行pcr。结果，在ilva基因的突变周围分别获得了5'上游区域的dna片段(1126bp)和3'下游区域的dna片段(286bp)。基于两个扩增的dna片段作为模板，使用seq id no：37和seq id no：40的引物，在95℃变性5分钟，然后在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合2分钟的28个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。
[0223]
结果，扩增了包括ilva基因突变的dna片段(1.4kb)，该基因编码苏氨酸脱氢酶变体，其中381位的苏氨酸被丙氨酸取代，383位的苯丙氨酸被丙氨酸取代。使用pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化扩增产物，并将其用作制备载体的插入dna片段。同时，用限制性内切酶smai处理纯化的扩增产物后，在65℃下热处理20分钟的pdcm2载体与插入dna片段(扩增产物)的摩尔浓度(m)的比例设定为1:2，并且根据制造商的说明书使用infusion cloning kit(takara)克隆载体，从而制备用于将ilva(t381a，f383a)突变引入染色体的pdcm2 ilva载体(t381b，f383b)。将如此制备的载体通过电穿孔转化到谷氨酸棒杆菌
(corynebacterium glutamicum)atcc13032-hom(r407h)中，并进行二次交叉，以获得在染色体上包括ilva(t381a，f383a)突变的菌株，该菌株被命名为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)ca10-3101。
[0224]
【实施例5-2：arog醛缩酶变体在ca10-3101菌株中的引入及其评价】
[0225]
用实施例3-1中制备的载体pdcm2-arog(r217a)，pdcm2-arog(k310a)，pdcm2-arog(r403a)，pdcm2-arog(e462a)，pdcm2-arog(r217a，k310a，e462a)和pdcm2-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)转化作为l-异亮氨酸生产菌株的ca10-3101，在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对选定的一代菌株进行次级交叉，并选择引入靶基因突变的菌株。通过使用seq id no：11和seq id no：12的引物进行pcr并分析核苷酸序列，证实了将arog基因突变引入最终转化的菌株中，从而确认了arog醛缩酶突变引入菌株。
[0226]
将这样制备的菌株命名为ca10-3101_arog_r217a，ca10-3101_arog_k310a，ca10-3101_arog_r403a，ca10-3101_arog_e462a，ca10-3101_arog_(r217a，k310a，e462a)和ca10-3101_arog_(r217a，k310a，r403a，e462a)。
[0227]
对制备的菌株ca10-3101_arog_r217a，ca10-3101_arog_k310a，ca10-3101_arog_r403a，ca10-3101_arog_e462a，ca10-3101_arog_(r217a，k310a，e462a)，ca10-3101_arog_(r217a，k310a，r403a，e462a)和atcc13032，ca10-3101的l-异亮氨酸生成能力进行了评价。通过将亲本菌株和arog醛缩酶突变菌株接种到含有25ml异亮氨酸生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养60小时来制备l-异亮氨酸。
[0228]
本实施例中使用的生产介质的组成如下。
[0229]
＜生产培养基＞
[0230]
葡萄糖10％，酵母提取物0.2％，(nh4)2so
4 1.6％，kh2po
4 0.1％，mgso4·
7h2o 0.1％，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，生物素200μg/l，ph 7.2
[0231]
培养完成后，使用高效液相色谱(hplc)测量l-异亮氨酸和副产物的产生，并且测试的每种菌株的培养基中l-异亮氨酸和副产物的浓度如下表12所示。
[0232]
【表12】
[0233][0234][0235]
如表12所示，与亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)ca10-3101相比，在arog基因中具有额外r217a、k310a、r403a和e462a突变的l-异亮氨酸生产菌株显示出l-异亮氨酸的生产能力增加了约1.1至1.2倍，并且l-酪氨酸的生产能力和l-苯丙氨
酸的生产能力降低。
[0236]
根据以上结果，可以确认arog醛缩酶的氨基酸序列中的217、310、403和462位的氨基酸是对于生产作为芳族氨基酸的l-异亮氨酸、l-酪氨酸和l-苯丙氨酸而言重要的位置。
[0237]
【实施例6：确认产生缬氨酸菌株中arog选择突变体的缬氨酸产生能力】
[0238]
为了确认所选突变是否对l-缬氨酸(l-缬氨酸是亮氨酸的代表支链氨基酸)有影响，还将所选突变引入到产生缬氨酸的菌株kccm11201p的棒杆菌属(corynebacterium)中，以确认缬氨酸的产生能力。具体实验如下。
[0239]
【实施例6-1：在kccm11201p菌株中引入arog醛缩酶变体及其评价】
[0240]
为了确定突变是否有效增加缬氨酸的产生能力，使用了产生l-缬氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)kccm11201p(us 8465962 b2)。用实施例3-1中制备的载体pdcm2-arog(r217a)、pdcm2-arog(k310a)、pdcm2-arog(r403a)、pdcm2-arog(e462a)，pdcm2-arog(r217a，k310a，e462a)和pdcm2-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)转化作为缬氨酸-产生株的kccm11201p，在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对选定的一代菌株进行次级交叉，并选择引入靶基因突变的菌株。通过使用seq id no：11和seq id no：12的引物进行pcr并分析核苷酸序列来确认arog基因突变引入最终转化的菌株中，从而确认arog醛缩酶突变引入菌株中。这样制备的菌株分别命名为kccm11201p-arog(r217a)，kccm11201p-arog(k310a)，kccm11201p-arog(r403a)，kccm11201p-arog(e462a)，kccm11201p-arog(r217a，k310a，e462a)和kccm11201p-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)。
[0241]
对所制备的缬氨酸菌株kccm11201p-arog(r217a)，kccm11201p-arog(k310a)，kccm11201p-arog(r403a)，kccm11201p-arog(e462a)，kccm11201p-arog(r217a，k310a，e462a)和kccm11201p-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)的产生能力进行了评价。烧瓶培养以与实施例2相同的方法进行，培养完成后用hplc测定缬氨酸产量，培养结果如下表13所示。
[0242]
【表13】
[0243][0244][0245]
如以上表13所示，与亲本谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)kccm11201p相比，在arog基因中具有另外的r217a，k310a，r403a和e462a突变的谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)kccm11201p-arog(r217a)，kccm11201p-arog(k310a)，kccm11201p-arog(r403a)，kccm11201p-arog(e462a)，kccm11201p-arog(r217a，k310a，e462a)和kccm11201p-arog(r217a，k310a，r403a，e462a)显示缬氨酸产生能力最多增加
1.11倍，l-酪氨酸产生能力和l-苯丙氨酸产生能力减少约10～20倍。
[0246]
根据以上结果，可以确认arog醛缩酶的氨基酸序列中217、310、403和462位的氨基酸是对于生产l-缬氨酸以及作为芳族氨基酸的l-酪氨酸和l-苯丙氨酸而言重要的位置。
[0247]
【参考例1：确认glta(m312i)突变对亮氨酸产生的效果】
[0248]
【参考例1-1：含glta突变的插入载体的制备】
[0249]
使用定点诱变来制备用于引入glta(m312i；seq id no：41)突变的载体。
[0250]
使用基于野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)染色体的seq id no：43和44和seq id no：45和46的引物对进行pcr。在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。利用将所得基因片段用smai限制性内切酶酶切的线性pdcm15载体和in-fusion酶融合dna片段之间的末端15个碱基的同源序列而克隆，制备了用异亮氨酸取代第312个氨基酸甲硫氨酸的pdcm2-glta(m312i)载体。
[0251]
【表14】
[0252][0253]
【参考例1-2：atcc13032菌株的变体引入及其评估】
[0254]
用参考例1-1中制作的载体pdcm2-glta(m312i)转化野生型atcc13032，并且在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对选定的原发菌株进行次级交叉，并选择引入靶基因突变的菌株。通过使用seq id no：31和seq id no：30(实施例4-1，表8)的引物进行pcr并分析核苷酸序列，确认将glta基因突变引入最终转化的菌株中，从而确认将突变(seq id no：42)引入菌株中。由此制备的菌株命名为atcc13032_glta_m312i。
[0255]
对烧瓶发酵效价进行评估，以评价上述制备的atcc13032_glta_m312i菌株的亮氨酸产生能力。将每个亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032和上述制备atcc13032_glta_m312i的一个铂环接种到含有25ml生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在30℃下以200rpm振荡培养60小时以产生亮氨酸。培养完成后，通过hplc测量亮氨酸的产生。每种测试菌株的培养基中的亮氨酸浓度如下表15所示。
[0256]
●
生产培养基：葡萄糖100g，(nh4)2so
4 40g，大豆蛋白2.5g，玉米浆固体5g，尿素3g，kh2po
4 1g，mgso4·
7h2o 0.5g，生物素100μg，盐酸硫胺素1,000μg，泛酸钙2000μg，烟酰胺3,000μg，caco
3 30g(基于1l的蒸馏水)，ph 7.0
[0257]
【表15】
[0258]
菌株名称亮氨酸(g/l)atcc130320.87atcc13032_glta_m312i1.25
[0259]
基于这些结果，证实了glta的m312i取代是增加亮氨酸产量的有效突变。
[0260]
【参考例2：确认ilva(t381a，f383a)突变对异亮氨酸产生的效果】
[0261]
【参考例2-1：peccg117-ilva(f383a)的制备】
[0262]
为了扩增作为编码苏氨酸脱水酶(seq id no：47)的基因的ilva(seq id no：48)，基于先前报道的引入f383a突变的ilva序列(world j microbiol biotechnol(2015)31:1369-1377)，在用于从启动子区域(起始密码子上游约300bp)扩增到终止子区域(终止密码子下游约100bp)的引物(seq id no：49和seq id no：50)的两端插入bamhi限制性内切酶位点。此外，引物(seq id no：51和seq id no：52)用于将f383a突变引入ilva。本文中使用的引物序列如下表16所示。
[0263]
【表16】
[0264]
seq id no：引物序列49引物1ggatccgact gagcctgggc aactgg 50引物2ggatccccgt caccgacacc tccaca 51引物3acatcacgct ggcagagtac ctcaa 52引物4ttgaggtact ctgccagcgt gatgt
[0265]
使用基于野生型谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032的染色体的引物对seq id no：49和52以及seq id no：50和51进行pcr。在95℃变性5分钟，然后在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。
[0266]
结果，在ilva基因突变附近获得了5'上游区域的dna片段(1460bp)和3'下游区域的dna片段(276bp)。
[0267]
基于两个扩增的dna片段作为模板，使用seq id no：49和seq id no：50的引物进行pcr。
[0268]
结果，包括ilva基因突变的dna片段(1531bp)被扩增，其中第383个苯丙氨酸被丙氨酸取代。将peccg117载体(韩国专利第10-0057684号)和ilva dna片段用限制性内切酶bamhi处理，使用dna连接酶连接，克隆得到质粒，质粒命名为peccg117-ilva(f383a)。
[0269]
【参考例2-2：将随机突变的附加引入peccg117-ilva(f383a)】
[0270]
为了获得编码l-苏氨酸脱水酶的基因的变体，使用随机诱变试剂盒制备ilva突变基因质粒(美国安捷伦科技公司)。使用基于ilva(f383a)的染色体的seq id no：49和seq id no：50的引物作为模板进行pcr。在95℃变性2分钟，然后在95℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合10分钟的条件下进行pcr。
[0271]
结果，除了第383个苯丙氨酸被丙氨酸取代的突变之外，还具有随机突变的能够编码l-苏氨酸脱水酶的ilva变体的dna片段(1531bp)被扩增。peccg117载体和ilva突变dna片段用限制性内切酶bamhi处理，使用dna连接酶连接，克隆得到一组质粒。
[0272]
【参考例2-3：cjile-301菌株的制备】
[0273]
将peccg117-ilva(f383a)引入谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032 hom(r407h)菌株中，并将所得质粒引入的菌株命名为hom(r407h)/peccg117-ilva(f383a)。此外，将参考文献2-2中获得的变异质粒组引入谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032 hom(r407h)菌株中，并接种到最小培养基上，测定死亡率。结果，死亡率为70％，存活的细胞接种并在种子培养基中培养。最后，选择与对
照atcc13032 hom(r407h)/peccg117-ilva(f383a)相比具有更好异亮氨酸生成能力的突变菌株，并命名为谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cj le-301。
[0274]
通过从cjile-301菌株中分离质粒对ilva基因进行测序，结果证实编码ilva基因的第1141个核苷酸a被g取代而ilva蛋白的第383位的f被a取代的变异之外，第381位的t进一步被a取代的变异蛋白，其由seq id no：54表示。
[0275]
【参考例2-4：引入ilva变体(t381a，f383a)】
[0276]
制备seq id no：49和seq id no：52的引物(实施例5-1，表16)以便将ilva变体(t381a，f383a)引入野生型菌株中。
[0277]
为了制备引入ilva变体(t381a、f383a)的菌株，基于从cjile-301菌株提取的质粒dna作为模板，使用seq id no：49和seq id no：52的引物进行pcr。
[0278]
pfuultra
tm
高可靠性dna聚合酶(stratagene)用作pcr反应的聚合酶，通过重复在95℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下聚合2分钟的28个循环来进行pcr。
[0279]
结果，获得了包括ilva基因(1311bp)的约100bp终止区的基因片段(1411bp)。
[0280]
使用pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化扩增产物，并将其用作制备载体的插入dna片段。同时，用限制性内切酶smai处理纯化的扩增产物后，在65℃下热处理20分钟的pdcm2载体与插入dna片段(扩增产物)的摩尔浓度(m)的比例设定为1:2，并根据制造商手册使用infusion cloning kit(takara)克隆载体，从而制备用于将t381a和f383a突变引入染色体的pdcm2-t381a_f383a载体。
[0281]
将如此制备的载体通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032 hom(r407h)并进行二次交叉，从而得到包括ilva(t381a、f383a；seq id no：53)染色体突变，菌株被命名为ca10-3101。
[0282]
ca10-3101菌株于2020年5月27日根据《布达佩斯条约》保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(kccm)，保藏号为kccm12739p。
[0283]
将kccm12739p菌株接种到含有25ml异亮氨酸生产培养基的250ml角挡板烧瓶中，然后在32℃下以200rpm振荡培养60小时以制备l-异亮氨酸。所使用的生产介质的组成如下。
[0284]
＜生产培养基＞
[0285]
葡萄糖10％，酵母提取物0.2％，(nh4)2so
4 1.6％，kh2po
4 0.1％，mgso4·
7h2o 0.1％，feso4·
7h2o 10mg/l，mnso4·
h2o 10mg/l，生物素200μg/l，ph 7.2
[0286]
培养完成后，使用高效液相色谱(hplc)测定培养基中l-异亮氨酸和l-苏氨酸的浓度，结果示于下表17中。
[0287]
【表17】
[0288][0289]
如表17所示，亲本菌株谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032 hom(r407h)不能产生l-异亮氨酸，但是atcc13032 hom(r407h)ilva(t381a，f383a)突变株
能够以3.9g/l的浓度产生l-异亮氨酸，从而证实l-异亮氨酸的生产率与亲本菌株相比显著提高。
[0290]
基于该结果，证实ilva(t381a，f383a)突变是用于增加异亮氨酸产量的有效突变。
[0291]
【参考例3：确认leua(p247c，r558h，g561d)对亮氨酸生成的效果】
[0292]
【参考例3-1：cjl-8100菌株的制备】
[0293]
具体地，通过电穿孔将包含kr 10-2018-0077008a中公开的leua基因突变的载体pdcm2-leua(r558h，g561d)转化到谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)atcc13032中，并且在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列的重组将载体插入染色体的菌株。再次对所选择的初级菌株进行二次交叉，并选择引入leua基因突变的菌株。通过使用seq id no：55和seq id no：66的引物，在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，以及在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的条件下进行pcr，确认将突变引入最终转化的菌株中并分析核苷酸序列，从而确认r558h和g561d突变的引入。用pdcm2-leua(r558h，g561d)载体转化的atcc13032_leua_(r558h，g561d)菌株命名为“cj l-8100”。
[0294]
下面参考例3中使用的引物序列示于表18中。
[0295]
【表18】
[0296]
seq id no：序列(5'
→
3')seq id no：55aacacgaccg gcatcccgtc gcseq id no：56aaatcatttg agaaaactcg aggseq id no：57gtgaattcga gctcggtacc caaatcattt gagaaaactc gaggcseq id no：58ggtgatcatc tcaacggtgg aacacaggtt gatgatcatt gggttseq id no：59aacccaatga tcatcaacct gtgttccacc gttgagatga tcaccseq id no：60ggtcgactct agaggatccc caagaaggca acatcggaca gcseq id no：61atccattcaa tggagtctgc g
[0297]
【参考例3-2：含有leua突变的插入载体的制备】
[0298]
制备了用于将p247c突变引入cj l-8100的载体，cjl-81000是一种l-亮氨酸生产菌株，其中两个突变(r558h，g561d)被引入leua。
[0299]
以cj l-8100菌株的染色体作为模板，使用seq id no：57和58或seq id no：59和60的引物对进行pcr。在94℃变性5分钟，然后在94℃下变性30秒，在55℃下退火30秒，并在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃聚合5分钟的条件下进行pcr。利用将得到的pcr产物用smai限制性内切酶消化的线性pdcm2载体和in-fusion酶融合dna片段之间的末端15个碱基的同源序列来克隆，制备了含有编码野生型菌株的leua氨基酸序列中第558个氨基酸精氨酸被组氨酸取代、第561个氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代的leua突变体的leua突变、且将leua的第247个氨基酸脯氨酸(pro)用半胱氨酸(cys)取代的pdcm2-leua(p247c，r558h，g561d)载体。
[0300]
【参考例3-3：将leua变体(p247c)引入cj l-8100菌株及其评价】
[0301]
将生产l-亮氨酸的菌株cjl-8100转化到参考例3-2中制备的pdcm2-leua(p247c，r558h，g561d)载体中，并在含有25mg/l卡那霉素的培养基中选择通过同源序列重组将载体插入染色体的菌株。再次对所选择的初级菌株进行二次交叉，并选择引入靶基因突变的菌
株。通过使用seq id no：55和seq id no：61的引物，在94℃变性5分钟，随后在94℃下变性30秒、在55℃下退火30秒和在72℃下聚合1分30秒的30个循环，然后在72℃下聚合5分钟的条件下进行pcr，确认将leua基因的突变引入最终转化的菌株中并分析核苷酸序列。作为序列分析的结果，证实了编码菌株染色体中的leua基因的第1673个核苷酸g被a取代、第1682和1683个核苷酸gc被at取代、第739和740个核苷酸cc被tg取代而leua蛋白的第558个氨基酸精氨酸被组氨酸、第561个氨基酸甘氨酸被天冬氨酸取代、第247个氨基酸脯氨酸(pro)被半胱氨酸(cys)取代的leua变体(p247c、r558h、g561d)的leua突变被导入菌株内。
[0302]
由此制备的cj l8100_leua_p247c被命名为“ca13-8105”，并于2020年4月29日根据《布达佩斯条约》保藏在国际保藏机构韩国微生物保藏中心(kccm)，保藏号为kccm12709p。
[0303]
包括上述三个突变的leua变体(p247c、r558h、g561d)的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的leua变体的核苷酸序列分别用seq id no：62和seq id no：63表示。
[0304]
对atcc13032、由此生产的cjl-8100和ca13-8105菌株的l-亮氨酸产生能力进行了评价。具体地，烧瓶培养以与实施例2-1相同的方式进行，培养完成后，使用hplc测量亲本菌株和突变菌株的l-亮氨酸产生，结果如表19所示。
[0305]
【表19】
[0306]
菌株名称l-亮氨酸(g/l)atcc130320.87atcc13032_leua_(r558h，g561d):cjl-81002.71cjl8100_leua_p247c:ca13-81053.52
[0307]
如表19所示，谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)cjl8100是一种l-亮氨酸生产菌株，与亲本菌株atcc13032相比，其l-亮氨酸生产能力提高了约130％。此外，在cj l8100菌株中进一步引入leua_p247c突变的ca13-8105菌株显示出与亲本菌株cj l8100相比提高了约150％的l-亮氨酸产生能力。
[0308]
基于该结果，证实leua(r558h，g561d，p247c)突变是用于增加亮氨酸产生的有效突变。
[0309]
本领域普通技术人员将认识到，本技术可以以其它特定形式体现而不背离其精神或本质特征。所描述的实施例仅在所有方面被视为说明性的，而不是限制性的。因此，本技术的范围由所附权利要求而不是由上述描述表示。属于权利要求等同性的含义和范围的所有变更均应纳入本技术的范围。
[0310]
【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】
[0311]
国际表格
[0312]
国际保藏机构对原始保藏的收条
[0313]
根据细则第7.1条发给
[0314]
至：cj第一制糖株式会社
[0315]
韩国，首尔市，中区，东湖路330，cj第一制糖中心，(邮)100-400
[0316][0317][0318]
【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】
[0319]
国际表格国际保藏机构对原始保藏的收条
[0320]
根据细则第7.1条发给
[0321]
至：cj第一制糖株式会社
[0322]
韩国，首尔市，中区，东湖路330，cj第一制糖中心，(邮)100-400
[0323][0324][0325]
【国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约】
[0326]
国际表格国际保藏机构对原始保藏的收条
[0327]
根据细则第7.1条发给
[0328]
至：cj第一制糖株式会社
[0329]
韩国，首尔市，中区，东湖路330，cj第一制糖中心，(邮)100-400
[0330][0331]