专利名称：包含gp41衍生的抗原的病毒体样小泡的制作方法
包含gp41衍生的抗原的病毒体样小泡
本发明涉及适合于诱导对人免疫缺陷病毒(hiv)的免疫应答的新 病毒体样小泡，包含所述的病毒体样小泡的药物组合物，治疗方法和 诱导对人免疫缺陷病毒的免疫应答的试剂盒。
hiv为逐步破坏免疫系统的逆转录病毒并且最终导致获得性免疫 缺陷综合征(aids)。
hiv以许多补体形式存在，如大家族中的成员。
通过对病毒基因组测序，研究人员已经能够图示hiv的家族树。 在树的根部，有三族称作m, n和0， m族导致目前的aids大范围流行。
将m族分成9个遗传亚型，也称作9个进化枝(命名为a-k，其中 无e或i)。进化枝的最初定义基于大部分位于hiv包膜蛋白内的短的 基因组序列(env: gpl60)。
这9个进化枝具有不均匀的地理分布模式。进化枝c在南美，印 度和中国的地区传播。进化枝a和d通常出现在东非而进化枝b常见 于北美和南美以及西欧。根据统计学，4个进化枝a， b， c和d占世 界上全部感染的90%以上而进化枝c自身代表了在世界上占主导的 hiv(>60%)。
到目前为止，疫苗的研发集中于进化枝b林，其在工业化国家中 具有占主导的传染性，但在全球仅导致约12%的感染。
大部分针对hiv-l的疫苗手段靶向病毒包膜(env)糖蛋白，因为 它们为在病毒体上并且由hiv-1感染细胞表达的主要表面抗原。天然 hiv-l包膜糖蛋白为含与三种gp41糖蛋白非共价结合的三种gpl20蛋 白的异三聚体。
而鉴定的三种最有效的hiv-l中和抗体bl2， 2g12和2f5对所述 的天然三聚体具有高度亲和力。
研发作为候选疫苗的重组蛋白的尝试日益增加，这些疫苗为优于天然包膜糖蛋白复合物，诸如gpl20/gp41的抗原模拟物。
然而，由于gpl20/gp41与免疫系统分子之间的众多(至少15种) 分子同源性，所以可能发生导致可能有害的自身免疫现象的许多潜在 的交叉反应性事件。
描述了各种策略来减緩那些交叉反应性以便获得与人蛋白无或 仅有低交叉反应性的抗-hiv疫苗，如us 6, 455， 265和wo 2005/010033 中所述的导入gp41蛋白不同部分中的突变和/或缺失。
然而，对能够诱导对hiv感染且特别是hiv-1型感染的通用免疫 应答的疫苗仍然存在需求。
还存在对研发非进化枝b疫苗，诸如，例如，进化枝c抹的需求。
还存在对研发具有能够进行交叉进化枝抑制的广抑制谱的疫苗 的需求。
对能够诱导对hiv感染的体液和/或细胞免疫应答的疫苗存在需求。
对能够在粘膜表面水平和血液水平上诱导对hiv感染的免疫应答
的疫苗存在需求。
对适合于诱导粘膜slga抗体和能够干扰hiv通过粘膜进入和粘 膜下的早期细胞感染的系统性igg抗体的疫苗存在需求。
对适合于抑制或减少hiv通过各种机制，诸如转胞吞作用通过粘 膜组织进入的疫苗存在需求。
本发明的目的在于满足上述所有那些需求。
因此，本发明在其第一个方面之一中涉及病毒体样小泡，其至少 包含gp41衍生的抗原或其类似物，所述的gp41衍生的抗原位于所述 小泡的外表面和/或包嚢在其内部，并且为便利性构型以便赋予所述的 病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(hiv)的gp41蛋白的免疫应答的能力。
特别地，hiv可以属于1型。
本发明人令人意外地观察到通过肌内或鼻内给家兔免疫接种病 毒体，如包含附着在外表面上的gp41衍生的抗原的小泡可以诱导粘膜表面水平的免疫应答和全身免疫应答。
更具体地说，本发明人已经观察到在来自肌内或鼻内免疫接种后
家兔的子宫颈阴道和肠分泌物中存在特异性抗体抗-gp41蛋白(粘膜 iga和igg)。
在那些家兔的血清中也鉴定了特异性igg抗-hiv抗体。 另外，那些特异性抗体能够在不同实验中抑制hiv的转胞吞作用。 本发明人还观察到可以在免疫接种了肌内和/或鼻内给予的本发
明疫苗的雌性猕猴阴道分泌物和直肠洗涤液中获得抗体抗-gp41(粘膜
iga和igg)。
那些分泌物和洗涤液显示出明显抑制人体上皮模型上各种初级 进化枝(b和c)的hiv转胞吞作用。
因此，本发明的hiv疫苗表现出在血液中以及在为生殖道和肠/ 直肠粘膜组织的主要进入部位上引起免疫应答(ctl和/或抗体)的能 力作为特性。
该特性特别有利，因为hiv感染可以包括有利于病毒转移和传播 入体内的粘膜表面上的转胞吞作用步骤。
精液和子宫颈阴道分泌物可能将hiv传播至胃肠道，肛门直肠和 泌尿生殖道，因为它们包含无细胞的hiv颗粒和大量hiv感染的单核 细胞。
还认为在hiv感染的受试者的早期病毒复制的主要部位为肠和其 它粘膜部位。这主要是因为大部分易感细胞(肠cd4 t细胞)居留于粘 膜组织内，并且在接触hiv后前几周内，这些细胞被破坏。
在本发明的含义中，"病毒体样小泡"这一表述是指包含至少部 分病毒体脂质和融合蛋白或其片段的小泡，所述的片段具有完整融合 蛋白的融合活性和特征，至少在用于与靶细胞的生物膜融合的程度上。
w0 2004/07800已经提出了病毒体样小泡作为与所述小泡的外表 面交联的疟疾抗原的载体。
在本发明的含义中，"gp41衍生的抗原"这一表述是指在任何或 包含任何修饰(氨基酸突变或化学修饰)的hiv林中天然存在的gp41蛋白的任何部分或片段以及完整蛋白，所述的修饰基本上不会影响其 抗原特性。
本发明的病毒体样小泡的抗原特性是从包嚢在所述小泡内部和/
或位于其表面上的gp41-抗原的简便构型得出的。
w0 2004/045582中描述了病毒体样小泡的制备，该小泡可以包含 gp4l/gp120蛋白，但不涉及该蛋白的抗原特性，而仅涉及其融合特性。
本发明在其另一个方面中涉及包含本发明病毒体样小泡的药物
组合物。
本发明在其另一个方面中还涉及至少一种本发明的病毒体样小 泡在制备旨在诱导针对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的适应性免疫应 答和/或先天性免疫应答的药物组合物中的应用。
根据本发明的一个实施方案，本发明的目的在于诱导igg和粘膜 iga。粘膜iga可以混合于iga与分泌性iga应答之间。
根据本发明的另一个实施方案，本发明的目的在于抑制或降低 hiv转胞吞作用，特别是在粘膜水平上。
在本发明的含义中，"适应性免疫应答"表述是指依赖于免疫系 统成分的活化的免疫应答，所述的免疫系统成分是指在抗原或病原体 方面的特异性和i己忆。
这种应答可以对抗原或病原体具有高度特异性并且在二次和随 后遇到抗原或病原体时更有效。
这种适应性免疫应答可以依赖于淋巴细胞，诸如t-细胞或b-细 胞活化。
在本发明的含义中，"先天性免疫应答"这一表述是指依赖于非 特异性识别系统并且在随后遇到抗原或病原体时不会改变的应答。
这种系统可以依赖于免疫细胞，诸如，例如，单核细胞，巨噬细 胞或天然杀伤(nk)细胞。
本发明在其另一个方面中还涉及治疗和/或预防hiv感染的方法， 至少包括对有此需要的个体给予有效量的本发明的病毒体样小泡的步 骤。本发明在其另一个方面中还涉及用于诱导对人免疫缺陷病毒的
gp41蛋白的免疫应答的试剂盒，包括
-至少第一种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第一种gp41衍 生的抗原，和
-至少第二种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第二种gp41衍 生的抗原，
所述的第一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。 病毒体样小泡
适合于本发明的病毒体样小泡至少包含病毒体脂质并且表现出 融合膜特性。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含单层脂双层。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以为双-或多层脂质体。
按照一个实施方案，病毒体样小泡可以具有一般在100-600 nm 的直径且特别是ioo nm-300 nm直径且特别是200 nm-400 nm。
本发明的病毒体样小泡可以为具有约150 nm平均粒径的球形单 层脂质体。
病毒体样小泡包含掺入脂双层中的融合蛋白或其片段。 "融合蛋白或其片段"这一表述是指能够诱导和/或促进病毒体 样小泡膜与靶细胞生物膜之间的融合反应的蛋白或其片段。
例如，融合蛋白可以为流感膜糖蛋白，诸如血凝素(ha)。
按照一个实施方案，可以使用至少两种不同的融合蛋白或其片 段，它们可以展示出不同的融合特性。
按照另一个实施方案，不同的融合特性可以为，例如，对温度， 离子浓度，酸性，细胞类型和组织类型特异性的不同易感性。
按照一个实施方案，病毒体样小泡可以包含在两种不同温度下介 导融合的融合蛋白。按照另一个实施方案，不同的病毒血凝素(ha)融合蛋白可以用于 构建病毒体样小泡。
作为实例，来自x-31和pr8/34病毒体的ha分子能够在不同温 度下催化两种不同的融合反应。
具有不同融合特性的融合蛋白可以来源于不同的流感林，如其它 病毒，诸如水疱性口炎病毒(vsv) el蛋白，塞姆利基森林病毒(sfv)e1 蛋白或仙台病毒f蛋白。
特异性融合机制能够靶向主要组织相容性复合物i类(mhc i)或 ii类(mhc ii)的病毒体样小泡。
位于病毒体样小泡外表面上的抗原可以在内体中内体融合时降 解并且可以由mhc ii类受体呈递给免疫系统。
包囊在病毒体样小泡内部的抗原可以在融合过程中被递送至胞 质溶胶中并且可以进入mhc i类途经。
因此，病毒体样小泡可能能够诱导体液和/或细胞免疫应答。
特别地，病毒体样小泡可能能够诱导iga，诸如分泌性iga以及
igg。
制备方案是本领域技术人员众所周知的。例如，在wo 2004/045582 或ep 0 538 437中描述了用于本发明的合适的方案，将这两篇文献引 入本文作为参考。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以获自病毒体小泡 本身或获自由病毒体小泡与脂质体小泡融合产生的小泡。
可以通过任何本领域技术人员公知的方法，如bron等在methods enzymol. 22 0: 313-331， 30 19 93中描述的方法制备病毒体小泡， 将该文献引入本文作为参考。
例如，可以在使用八乙二醇一^h二烷基醚增溶完整流感病毒，沉 积核壳(病毒糖蛋白和脂质仍然保留在上清液中)和使用疏水性树脂 (big-beads sm2)除去上清液中的洗涤剂后由最初的病毒膜脂质和刺 突糖蛋白重构病毒体小泡(stegmann等traffic 1: 598-604， 1987)。
可以使用等量的用非离子型洗涤剂八乙二醇一十二烷基醚增溶的那些病毒的蛋白制备含来自不同病毒林的has的病毒体小泡。
在使用bio-beads sm2除去洗涤剂后，可以形成含不同类型融合
蛋白的病毒体样小泡。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以获自病毒体小泡
与脂质体小泡的融合体。
因此，按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含病毒
体和脂质体脂质。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含脂双层，其 包含选自阳离子脂质，合成脂质，糖脂类，磷脂类，磷酸甘油脂类， 鞘糖脂类，如半乳糖神经酰胺，鞘脂类，胆固醇及其衍生物的脂质。
这类脂质可以用于更好地模拟病毒膜并且膜筏微域，以便有利于 最佳gp41寡聚体，诸如二-，三-或四聚体。
按照另一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以包含有利于 gp41衍生的抗原折叠的脂质，以便更有效地模拟所述抗原的天然折 叠。
磷脂类特别可以包括具有不同脂肪酰组成的磷脂酰胆碱，鞘磷 脂，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸，心磷脂和 磷脂酰肌醇。
阳离子脂质可以选自d0tma (n- [1- (2， 3- 二油酰氧基)丙 基]-n，n,n-三甲铵氯化物)，d0tap(n-[1-(2， 3-二油酰氧基)丙 基]-n， n， n-三甲铵氯化物，d0dac (n， n-二油酰基-n， n， -二甲铵氯化 物)，ddab(双十二烷基二甲铵溴化物)和十八酰胺或其它脂肪族胺类等。
可以将用于本发明的脂质配制成与dope (二油酰基磷脂酰乙醇胺) 的混合物形式的小的单层脂质体，所述的dope被广泛用作促进内体膜 破裂的辅助脂质。
按照一个实施方案，脂质体的脂质体脂质可以包括popc/ddab。 按照另一个实施方案，还可以使用辅助乳化剂以便改善小泡的刚 性和/或密封性。作为辅助乳化剂的实例，可以提及的有胆齒醇和衍生物，例如带
电荷或中性的胆固醇，如硫酸胆固醇；具有固醇主链的衍生物，例如 植物来源的衍生物，如植物甾醇(谷甾醇，a甾醇，…)；神经酰胺类； 及其混合物。
可以在与病毒体融合前将gp41衍生的抗原掺入脂质体小泡内部。 可以通过本领域公知的任何方法如下所示将至少一种抗原和/或 佐剂包嚢入脂质体，包括monnard等biochim. biophys.; acta 1329: 39-50; 1997， wagner等j. liposome res,, 12(3) 271-283， 2002 或oberholzer等biochim. biophys. acta 1416: 57-68i 1999所述 的方法以及许多其它众所周知的方法。
在一个具体的实施方案中，可以通过用于制备纯脂质小泡的冷冻
/融化技术达到脂质体包嚢的高效率。
按照本发明的一种实施方案，可以对病毒体-脂质体融合体反应 的反应产物进行核孔挤压步骤以便减小其大小。
实如，通过200 nm孔挤压可以产生近似原始大小一半的小泡。
大部分颗粒可以在100-300 nm。
在重新调整大小后，脂质体-病毒体融合体的产物可以为病毒体
能仍然能够，经历第二个与生物膜的融合步骤，'以、便递送;i的抗原:
如下所述gp41衍生的抗原可以位于本发明小泡的外表面和/或包 嚢在其内部。
按照一种实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含靶向 部分，它使所述的小泡靶向至特定的细胞或组织。
合适的靶向部分可以选自细胞表面受体，趋化因子，生长因子， 抗体或抗体片段，具有与黏着分子，诸如整联蛋白互补的特异性或比
电荷的肽序列。
小泡二脂双层或j着于其上。'- 、 、
按照另一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含额外的抗原。
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以进一步包含i-io
种额外的抗原并且特别是2-4种额外的抗原。
额外的抗原可以选自hiv衍生的肽类且特别是衍生自如 env(gpl20， gp41) ， gag(p9， p17， p24)和pol (p66， p32)基因编码的 结构蛋白和如nef，rev或tat基因编码的调节蛋白的肽类及其混合物。
gp41衍生的抗原
适合于本发明的gp41衍生的抗原可以为gp41蛋白的任何部分， 和完整的gp41蛋白及其类似物。
在本发明含义中，"其类似物"这一表述就gp41衍生的抗原而 言是指与所述的gp41衍生的抗原氨基酸序列具有基本上(至少85%，
特别是至少90%且更特别是至少95 y。)氨基酸序列同一性或同源性(即
被例如相同家族，类似极性或电荷的氨基酸残基置换的氨基酸残基) 并且特别是就针对gp41蛋白的免疫球蛋白的结合抗原部分而言具有 类似或保守生物特性的肽。
按照一个实施方案，适合于本发明的gp41衍生的抗原对于细胞 膜可以不具有融合特性。
按照一种实施方案，位于本发明的病毒体样小泡外表面的gp41 衍生的肽可以
-与所述的病毒体样小泡脂质共价连接，或
-通过不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜结构域的肽跨膜结 构域嵌入所述病毒体样小泡的脂双层。
因此，共价连接的gp41衍生的抗原可以包含使所述的gp41衍生 的抗原定位于本发明的病毒体样小泡外表面所需的任何修饰。
适合于本发明的gp41-抗原的修饰和使所述修饰的gp41-抗原与 病毒体样小泡外表面交联的方法可以是wo 2004/078099中所述的那些 方法。
按照一个实施方案，gp41衍生的抗原可以通过交联脂质或磷脂与病毒体样小泡外表面共价连接。
按照另一个实施方案，gp41衍生的抗原可以通过与碳水化合物交 联与病毒体样小泡外表面共价连接。
按照一个实施方案，共价连接的gp41衍生的抗原可以包含至少 一个位于n-或c-末端的交联残基。
例如，交联残基可以选自半胱氨酸(cys)或赖氨酸(lys)。
按照另一个实施方案，共价连接的gp41衍生的抗原可以进一步 包含在所述的位于n-或c-末端的交联残基与相应的n-或c-末端gp41 衍生的抗原端之间的至少一个间隔残基。
合适的间隔残基可以选自例如gly(甘氨酸)，ala(丙氨酸)， ser(丝氨酸)，asp(天冬氨酸)，lys (赖氨酸)，gln(谷氨酰胺)，his(组 氨酸)，ile(异亮氨酸)和leu(亮氨酸)残基.
2-12，特别是3-10且更特别是4-8个间隔残基可以连接而形成 间隔序列。
合适的间隔序列可以选自，例如gly-gly或lys-gly。
例如，可以通过使用易于掺入脂双层的两亲peg衍生物，磷脂酰 乙醇胺(pe)，磷脂酰胆碱(pc)，磷脂酰丝氨酸，胆固醇或其混合物使 gp41衍生的抗原与病毒体样小泡的表面交联。
可以通过任何本领域技术人员公知的方法使gp41衍生的抗原与 本发明的病毒体样小泡的脂质交联。
交联可以在脂质溶液中操作并且随后可以将脂质-肽缀合物掺入 病毒体才羊小泡。
按照本发明的一个实施方案，例如，可以使gp41衍生的抗原与 本发明的小泡脂质通过双官能琥珀酸酯连接基，特别是y-马来酰亚氨 基丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯或n-y-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰 亚胺-酯连接。
按照一个实施方案，gp41衍生的抗原且更特别是嵌入的gp41衍 生的抗原可以不具有其肽跨膜结构域。
合适的嵌入的gp41衍生的抗原可以具有被不同肽跨膜结构域置换的其肽跨膜结构域。
这种修饰的gp41衍生的抗原可以为嵌合蛋白。
在本发明含义中，"嵌合蛋白，，这一表述是指可以包含来自蛋白 质的一个或多个区和来自一种或多种其它不同蛋白质的一个或多个区 的蛋白质。
为了本发明的目的，任何蛋白质的任何跨膜结构域均可以适合于 使gp41衍生的抗原嵌入本发明的病毒体样小泡的脂双层。
按照一个实施方案，可以使用有利于寡聚化的跨膜结构域(就获 得二聚体，三聚体或四聚体而言)，诸如来自病毒的生长因子受体或包
膜蛋白的跨膜。
作为可以集合成本发明的跨膜结构域的实例，可以提及的有获自 细胞表面受体，如cd4受体(例如seq id no 5中所示)，细胞因子受 体，例如il-1受体，egf受体，vegf受体，任何g-蛋白偶联受体， 任何酪氨酸激酶受体，来源于诸如弹状病毒家族或痘病毒家族的病毒 这类病毒包膜蛋白的病毒跨膜结构域的跨膜结构域。用于本发明的合 适的病毒蛋白可以为，例如水泡性口炎病毒蛋白g(vsv-g)。
这类跨膜结构域是本领域众所周知的并且易于由本领域技术人 员鉴定。
可以通过本领域技术人员公知的任何遗传工程技术获得适合于本发 明的嵌合蛋白，诸如描ii/fr "molecular cloning a laboratory manual" (2nd ed.) sanbrook等1990， coldspring harbor laboratory, coldspring harbor press n. y. (sanbrook)中的技术。
按照另一个实施方案，可以为病毒体样小泡外表面提供一-，二-， 三-且更特别是四聚化形式及其混合物形式的gp41衍生的抗原。
因此，可以通过本领域技术人员公知的任何常规方案调节用于制 备本发明的病毒体样小泡的gp41衍生的抗原的量以便获得所需的单-或多聚化形式。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于其外表面的n-或c-末端。按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的c-末端。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原位于外表面的n -末端。
按照一个实施方案，可以使gp41衍生的抗原包囊在本发明病毒 体样小泡内部。
可以通过本领域众所周知的方法用病毒体包囊gp41衍生的抗原。
例如，可以通过将离心到溶于含八乙二醇一癸基醚(oeg)的pbs 的pbs-oeg(磷脂酰胆碱(pc)，砩脂酰乙醇胺(pe)溶液中的血凝素沉淀 溶解制备如之前由j.j. skehe和g. c. schild(the polypeptide composition of influenza a viruses. virology 44 (1971) 396—408) 所述获得的纯化a型流感/新加坡血凝素的溶液。
可以将gp41衍生的抗原和磷脂类加入到血凝素-溶液中，混合， 超声处理，然后离心。随后如上所述通过例如4吏用biorad sm bio-beads除去洗涤剂形成病毒体。
按照另一个实例，可以使用诸如上述或如christodoulides等 microbiology 144: 3027-3037 (1998)中所述的方法将gp41衍生的抗 原包嚢入脂质体，此后使所述的脂质体小泡与病毒体小泡融合。
按照另一个实施方案，当包嚢入本发明的病毒体样小泡时，还可 以如上所示提供单-或多聚化形式的gp41衍生的抗原。
按照一个实施方案，可以用于本发明的gp41衍生的抗原可以选 自任何hiv进化枝。
用于本发明的合适的hiv进化枝可以为例如来自a， b， c或d进 化枝的hiv。
更具体地说，gp41衍生的抗原可以来自hiv c型进化枝。 合适的gp41衍生的抗原可以部分包含天然存在的gp41衍生的抗
(诸如环化)，其实施依赖于本领域技术人员。
按照一个实施方案，可以聚集以便实施本发明的gp41衍生的抗原可以为如获自hiv-1林hxb2的seq id no 1中所示序列的全部或部 分表示的氨基酸序列肽或其类似物。
在一个实施方案中，gp41衍生的抗原可以为来源于hiv gp41糖 蛋白的野生型氨基酸序列的gp41改造的环蛋白。
作为可以用于实施本发明的gp41衍生的抗原的实例，可以提到 的有通过在免疫显性区中导入某些突变(缺失，置换和/或插入)获得的 gp41衍生的抗原，以便降低与人白细胞介素-2(il-2)的同源性，从而 避免或降低引起自身免疫反应风险。这类gp41衍生的抗原特别描迷在 w0 2005/010033中，将该文献引入本文作为参考。
在本申请中，"突变，，是指通过物理方式，化学方式(共价或非 共价修饰)和/或生物方式(通过置换，缺失和/或插入一种或多种氨基 酸的突变)对多肽区的任何修饰(任选地还原成单个氨基酸残基)，从而 产生所述区的组成氨基酸的功能性潜能的改变，称作"突变区"。作 为实例，可以进行突变而导致l系列氨基酸改变成d系列，二硫键， 氢键，静电作用和/或疏水作用特性的消除，获得和/或调节，蛋白质 形成杂络物能力的改变，或就寡聚蛋白质而言寡聚化状态或寡聚体稳 定性的改变。
免疫显性区的改变可以导致在环中引入亲水性和非或弱免疫原 性的柔性接头和任选地引入突变或该环的一部分被它们置换。
gp41衍生的抗原在其免疫显性区中还可以包括至少一种突变，这 在体外产生与宿主蛋白且特别是与il-2的b型和/或t型交叉反应。
某些对影响这种抗原性改变具有决定性的突变披露在us 6， 455， 265和w0 2005/010033中，将这些文献的教导完整地引入本文 作为参考。
按照一个实施方案，适合于本发明的gp41衍生的抗原可以为称 作pl的肽并且可以为由选自seq id no 2, seq id no 3的序列全部 或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。
肽pi相当于存在于位于病毒颗粒表面上的hiv包膜蛋白胞外域 gp41中的氨基酸序列，此后该病毒与靶细胞发生相互作用。作为实例，在hiv-1 hxb2林中，该序列由野生型gp41蛋白的649位氨基酸到683 位氨基酸组成。
如w0 2005/010033中所述或如上所述，用于本发明的gp41衍生 的抗原还可以包括修饰，诸如将n-或c-末端上的部分氨基酸序列截短 或添加肽序列以便产生嵌合蛋白。
作为适合于本发明的gp41衍生的抗原的实例，可以预见肽p1序 列包含在c-末端位置上添加lys-gly-cys间隔区，例如seq id no 4
佐剂
按照一个实施方案，可以通过使那些病毒体样小泡与至少一种佐 剂结合增加本发明的病毒体样小泡的免疫调节作用。
可以将所述的佐剂包嚢在所述的小泡内部和/或掺入其脂双层和 /或与之自由合并。
按照一个实施方案，病毒体样小泡还可以包含至少一种增强和/ 或介导免疫应答的佐剂，所述的免疫应答选自先天性免疫应答和/或适 应性免疫应答。
适应性免疫应答可以选自tv和/或l2免疫应答。
可用的佐剂可以通过活化抗原呈递细胞(apc),巨噬细胞和/或刺 激特异性组淋巴细胞来增强免疫应答。
可以集合成本发明的佐剂可以是适合于活化在树突细胞(dc)或 其它抗原呈递细胞中和其上表达的病原体识别受体(prr)的配体。
活化tol 1样受体(tlr)的配体还可以集中用于本发明的目的。那 些受体为prr家族中的成员并且在各种先天性免疫细胞，包括dc，巨 噬细胞，肥大细胞和中性白细胞上广泛表达。
作为活化tlr的配体的实例，可以提及的有就tlr4而言为来 自大肠杆菌(a c^/)的lps，红豆杉醇，rsv融合蛋白和宿主热激 蛋白60和70;就tlr2而言为金黄色葡萄球菌(i^flj^r/ococc^ a"re^)的肽多糖，来自结核分枝杆菌"6erci//^2、)的脂蛋白和啤酒糖酵母(^c力ar咖/ces cerer/wae)酵母多糖和高度纯化的 尸.g//^/>a7hlps;就tlr3而言为dsrna;就tlr5而言为鞭毛蛋白； 就tlr7而言为合成化合物咪唑并喹啉类；而就tlr9而言为某些类型 的富含cpg的dna。
用于本发明的其它有用的佐剂可以为t辅助细胞表位。 t辅助细胞表位为通常来源于在抗原呈递细胞(apc)胞吞途经内 已经进行蛋白水解降解和加工的外源性蛋白的肽。在那些细胞中，转 运至胞吞途经内体的ii类主要组织相容性复合物(mhc ii)与那些肽类 结合。这种转运至apc表面的复合物可以与t淋巴细胞的cd4 特异性 t细胞受体发生相互作用。
根据助细胞表位，t细胞应答可以属于l和/或th2类型。 有利于ctl应答的tm表位和有利于体液应答的th2表位为本领域
公知的o
作为l广定向应答表位的实例，可以提及的有w0 2005/049647中
鉴定的蜂毒素衍生的肽类。
作为其它th2-定向应答表位的实例，可以提及pandr辅助性t细 胞表位(padre)。改造该表位以便以高度亲和力结合最常见的hla-dr 分子并且起强力免疫原的作用。已经证实padre htl表位可增进为刺 激细胞免疫应答而设计的疫苗的效力(alexander j.等，immunol res. 1998;18 (2): 79-92)。
按照一个实施方案，可以用于本发明的病毒体样小泡的佐剂可以 选自铝盐；磷酸铝凝胶；分枝杆菌，诸如bcg，母牛分枝杆菌(m. vaccae ) 或小棒杆菌(corynebacterium parvum); 肽类；匙孑l蜮血蓝蛋白； 胞壁酰二肽和三肽衍生物；单磷酰脂质a;白细胞介素-2(il-2)， il-12， gm-csf;来自趋化因子家族的配体，诸如rantes (激活后可调 节的正常t细胞表达和分泌的)；gram 菌的脂蛋白；酵母细胞壁成分； 双链rna; grant菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含u的单链病毒rna;含 cpg的dna;细胞因子信号传递小干扰rna的阻抑物(s0cs sirna)，蜂 毒素衍生的肽类，pandr表位(padre)及其混合物。药物制剂
按照一个实施方案，本发明的病毒体样小泡可以用于制备指定诱
导针对人免疫缺陷病毒gp41蛋白的适应性免疫应答和/或先天免疫应 答的药物组合物。
这类药物组合物可以包含悬浮于药学上可接受的载体，例如含水 载体的病毒体样小泡的溶液。
可以使用各种含水载体，例如水，緩沖水，0. 4%盐水，0. 3%甘氨 酸，透明质酸等。可以通过常规的众所周知的灭菌技术给药物组合物 灭菌或可以将其进行无菌过滤。
可以将所得水溶液作为包装应用或将其冻干，可以在给药前将该 冻干制剂与无菌溶液合并。
药物组合物可以包含接近生理条件所需的药学上可接受非辅助 物质，诸如ph调节和緩冲剂，张度调节剂，湿润剂等，例如乙酸钠， 乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钾，失水山梨糖醇单月桂酸酯，油酸 三乙醇胺酯等。
这类制剂通常可以包含药学上可接受浓度的盐，緩冲剂，抗氧化 剂，防腐剂，相容性载体，如上所述的佐剂和任选的其它治疗剂。
可以通过注射或通过粘膜途经或其组合给予本发明的病毒体样 小泡，且特别是包含它的药物组合物。
注射途经可以为，例如，腹膜内，真皮内，皮下血管内或肌肉途经。
可以使用任何粘膜途经，诸如泌尿生殖道，例如阴道途经，胃肠 道途经，肛门直肠途经，呼吸道途经，上部粘膜组织，口腔-鼻部途经 及其混合途径。
在一个实施方案中，可以将本发明的药物组合物制成口服剂型， 诸如片剂，胶嚢(各自包括定时释放和緩释制剂)，丸剂，粉末，颗粒， 酏剂，酊剂，溶液，混悬液，糖浆剂和乳剂。
所有这些剂型均为制药领域普通技术人员众所周知的。在一个实施方案中，病毒体样小泡可以用于制备以疫苗形式给药 的药物组合物。可以使用本领域中标准的任何免疫接种方案。
按照一个实施方案，本发明的药物组合物可以包含小泡，其包 含位于所述小泡外表面的gp41衍生的抗原；和小泡，其包含包囊在所 述小泡内部的gp41衍生的抗原，它们作为免疫疗法中同时，单独或依 次应用的联用制剂。
按照另一个实施方案，本发明的药物组合物可以进一步包含额外 的病毒体样小泡，其包含不同于所述gp41衍生的抗原的抗原，它们作 为在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
所述的不同可以如上所述。
本发明的药物组合物可以包含有效量的本发明病毒体样小泡。 有效量为单独或与额外剂量共同可以刺激所需反应的病毒体样 小泡用量。有效量可以依赖于各种因素，诸如给药途径，是单剂量还 是多剂量给药和个体患者参数，包括年龄，身体情况，大小，体重和 疾病阶段。这些因素为本领域技术人员众所周知的并且可以不经过度 实验确定。
因此，按照一个实施方案，药物组合物可以包含单独或与至少一 种如上所述佐剂组合的本发明病毒体样小泡。
本发明的另一个方面还涉及治疗和/或预防hiv感染的方法，至 少包括对有此需要的个体给予有效量的本发明病毒体样小泡的步骤。
按照一种实施方案中，可以如上所述通过注射或粘膜途经或其组 合给予本发明的病毒体样小泡。
按照另一个实施方案，可以按照本发明使用的病毒体样小泡可以 为病毒体样小泡，其包含位于外表面的gp41衍生的抗原；和病毒体 样小泡其包含包嚢在所述小泡内部的gp41衍生的抗原，它们作为免疫 疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
按照另一个实施方案，可以将可以用于本发明方法的病毒体样小 泡与不同于所述gp41衍生的抗原的额外抗原联合给药。
作为可以集中用于本发明的额外抗原的实例，可以提及的有上述不同的抗原。
本发明在其另一个方面中还涉及用于诱导对人免疫缺陷病毒
gp41蛋白免疫应答的试剂盒，包括
-至少第一种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第一种gp41衍 生的抗原；和
-至少第二种本发明的病毒体样小泡，其至少包含第二种gp41衍 生的抗原，
所述的第一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。 按照一个实施方案，第一种gp41衍生的抗原可以为由选自seq id
no 2， seq id no 3的序列全部或部分表示的氨基序列肽或其类似物。 按照另一个实施方案，第二种gp41衍生的抗原可以为由seq id no
1所示序列全部或部分表示的氨基酸序列肽或其类似物。
通过下列实施例进一步理解本发明，提供这些实施例是为了例 证，而不应将其解释为限制本发明的范围。
进一步通过下列实施例例证本发明的各方面，在任何情况下均不 应将其视为限制本发明的范围。
图l:例证了来自(form) hxb2进化枝b病毒(seq id no 1， seq id no 3， seq id no 4)和来自hiv进化枝c (seq id no 2)的gp41 衍生的抗原序列。
3_2:例证了 cd4 分子跨膜结构域序列(seq id no 5)。 图3:例证了在第0， 14， 18， 23和28周时总抗体，igg和siga 在来自免疫接种实施例l的病毒体样小泡pi的家兔的子宫颈阴道分 泌物中的剂量，所述的实施例1的病毒体样小泡 pi不含佐剂(36 & 37，肌内途经)，含hrantes(61，鼻内途经)或含不耐热毒素(64 & 65， 鼻内途经)。
图4:例证了在第0， 14， 18, 23和28周时总抗体，igg和iga在来自免疫接种实施例1的病毒体样小泡pl的家兔的血清中的剂
量，所述的实施例1的病毒体样小泡 pl不含佐剂(36 & 37，肌内途 经)，含hrantes(61，鼻内途经)或含不耐热毒素(64&65，鼻内途经)。
图5:例证了通过ht-29细胞进行的hiv-1转胞吞作用的抑制，其 中使用感染了初级病毒的pbmc和如实施例2中所述获得的子宫颈阴道 分泌物(1/50稀释)(第14， 18和23周，不含佐剂36 & 37的病毒体 样小泡 pl,肌内途经；含hrantes 61 & 63，鼻内途经；或含不耐 热毒素64 & 65，鼻内途经)。
ii:例证了通过elisa测定的在第0, 4， 12和24周时在使用实 施例1的病毒体样小泡pl以40 pg/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴 道分泌物中igg的剂量。
垦2:例证了通过elisa测定的在第0, 4， 12和24周时在使用实 施例1的病毒体样小泡pl以40 ng/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴 道分泌物中iga的剂量。
h:例证了通过elisa测定的在第0， 4， 12和24周时在使用实 施例1的病毒体样小泡p1以40 itig/剂量进行疫苗接种的雌性猕猴阴 道分泌物中iga的剂量。
图9:例证了通过ht-29细胞进行的r5 hiv林的抑制(来自nih的 v29初级hiv进化枝b或来自nih的v25初级hiv进化枝c)，其中使 用来自如实施例4中所述获得的第25周的阴道分泌物(1/25稀释)感 染了 v29或v25的pbmc。
图io:例证了通过ht-29细胞进行的r5 hiv林的抑制(来自nih 的v29初级hiv进化枝b或来自nih的v25初级hiv进化枝c),其中 使用来自如实施例4中所述获得的第25周的直肠洗涤物(1/25稀释) 感染了 v29或v25的pbmc。
实施例 实施例1:
逸含祖f斧或面w w"衍j #拔##病#琳举小,g #浙务如wo 2004/045582中所述制备病毒体样小泡。
简言之，将32 mg卵磷脂酰胆碱(pc)和8 mg磷脂酰乙醇胺(pe) 溶于含ioo mm八乙二醇一癸基醚(oeg) (pbs/oeg)的2 ml pbs。
如所述的纯化a型流感/singapore血细胞凝集素(ha) (skehel和 schild， virology 44:396-408, 1971),在磷酸緩沖盐水(pbs)中以 100， 000 x g离心4 mg血细胞凝集素(ha)并且将沉淀溶于含100 mm 0eg 的1,33 ml pbs。
如7"炎4 末端位_￡丄^^7《腐^ 677-z"-c""邻w w 衍j^戎^ p"遞过#-末端2^磁磁^游遂接差与樺
腐教乙举麽w^械;^种谬潜合。
将磷脂酰乙醇胺(pe)溶于甲醇并且加入0. 1。/。(v/v)三乙胺。然后 将该溶液与预先溶于二甲亚砜(dmso) (20^1)的异双官能交联剂n-y-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥讀酰胺-酯(gmbs) (pierce chemical company, rockford， il)(比例pe: gmbs = 5: 1)混合。在室温下30 分钟过程中孵育后，在真空中用真空离心蒸发浓缩器离心将溶剂蒸发 1小时。然后将gmbs-pe溶于含100 me八乙二醇(oeg) (fluke chemicals, switzerland)的1 ml pbs (pbs-oeg)并且加入修饰的gp" 衍生的抗原pl(seq id no 4)(比例pe-gmbs:肽=5:1)。在该步骤中， 使礴脂酰乙醇胺-gmbs与修饰肽pi的游离c-末端半胱氨酸反应。在 30分钟孵育时间后，加入游离半胱氨酸以使游离gmbs失活(比例为半 胱氨酸gmbs = 10: 1)。
将肽pl-磷脂酰乙醇胺结合物(4 mg),磷脂酰胆碱(32 mg; lipoid, ludwigshafen, germany)和(ans)磷月旨酰乙醇胺(6 mg)溶 于2.66 ml pbs-oeg总体积。混合磷脂类和血细胞凝集素溶液并且超 声处理1分钟。
以100 000 g将该溶液离心1小时并且通过过滤对上清液灭菌。 通过除去洗涤剂形成病毒体(sm biobeads， biorad， glattbrugg, swi tzerland)。实施例2:
逸舍舆才但于斧4面# 餘i^拔^农iv
^嫂萝逸合#对家應瘦接并
准备3组新西兰白色雌性家兔接受如实施例1中所述制备的病毒 体样小泡。
通过肌内给予不含任何佐剂(家兔36和37)或通过鼻内给予含 hrantes (家兔61和63)或通过给予含不耐热毒素(hlt)(家兔64和65) 的病毒体样小泡。
应用下列给药方案。
在首次给予制剂前4周，家兔接受肌内注射失活的a型流感(ioo pl失活的a型流感，0,01 mg/ml)。
此后，家兔在0， 4和12周时接受病毒体样小泡给药(20jlig， 100 pl)并且在第16和22周时接受肌内加强注射(io pg)。
在第28周时处死动物并且采集各种样品用于研究抗体反应-功能。
将预先免疫的样品(在第o周前取)用作对照组。
在第14, 18， 23和28周时取血液和阴道分泌物。
将hlt病毒体样小泡进行疫苗接种的家兔用作针对hrantes病毒
体样小泡进行疫苗接种的家兔的对照组。
按照下列elisa方案测定总抗体，igg和iga水平。 将在碳酸氢盐緩沖液50 mm， ph 9. 6中的肽p1(100 ng/100 jnl/
孔，seq id no 3)用于在4r下包被nunc平板过夜。
用bsa 3°/。或牛奶5°^将平板饱和2小时/37匸，然后用pbs-tween
0， 5%緩冲液洗涤。
在37。c下将用bsa 3°/。按照1/1000稀释的血清或用bsa 3%按照
1/50稀释的子宫颈阴道分泌物的样品孵育2小时。
此后用pbs-tween 0. 5%緩冲液冲洗平板并且与初级抗体一起孵育。
为了检测总抗体，使用用辣根过氧化物酶(hrp) (1/4000)标记的抗-家兔总ig山羊抗体。
为了检测家兔iga,使用抗-家兔igg山羊抗体(vector， france) (1/20 000),随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素 -hrp (immunotech) —起孵育。
为了检测igg家兔抗体，使用抗-家兔iga山羊抗体(sigma) (1/20 000),随后与标记的抗-山羊抗体生物素(vector) (1/1000)—起孵育并 且使用链霉抗生物素-hrp(1/50 000)显示。
将2f5-igg单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人iga生物素 标记的山羊fab， 2， (1/5000) (caltag)—起孵育并且使用链霉抗生物 素-hrp(1/50 ooo)显示。
将2f5-iga单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人igg山羊fab， 2 (1/20 000)—起孵育并且使用链霉抗生物素-hrp (1/50 000)显示。
将抗体在37。c下孵育1小时。
通过添加底物tmb引起比色反应并且通过添加h2p04 1m终止。 在450 nm处读取光密度(0d)。
在图3(子宫颈阴道分泌物)和图4(血清)上例证了获得的结果。 在来自按照免疫接种条件在第14或18周时具有峰值的免疫接种 家兔的子宫颈阴道分泌物和血清中观察到存在抗体。
实施例3:
《^ ^,滋斧/2种^^礎神家慮#f f豕厉道为、泌^m/^it脊 應吞举^w^賴
对在可透性滤膜支持物(0. 45微米孔径)上生长为致密极化单层 达7天的上皮细胞系ht-29实施通过上皮细胞的hiv-1转胞吞作用和 用抗体中和转胞吞作用，从而在独立的室之间形成界面，上部浸浴了
上皮单层的上(腔)表面，而下部浸浴了基底外侧(浆膜)表面。
获得初级pbmc并且如lagaye等(j. virol, 2001， 75: 4780)所 述制备。然后使用植物凝集素(pha)将pbmcs活化48小时并且与初级 hiv-1进化枝c 一起孵育并且在感染后第7天时使用。将如实施例2中所述获得的含抗体的子宫颈阴道分泌物(1/50稀 释)(第14， 18和23周，不含佐剂的病毒体样小泡 pl， 36 & 37 i.m.， 含hrantes 61 & 63 i.n.或含不耐热毒素64 &65 i.n.)在18t下与 1. 106 hiv-1 pbmc—起孵育1小时。
为了引起病毒转胞吞作用，向上部室中加入含抗体的2.106 hiv-1 pbmc。 hiv-1 pbmc与上皮单层之间的接触导致hiv-1病毒体 快速萌发，随后它们从上部转胞吞至上皮细胞的基底外侧孔。
2小时后，通过用elisa (coulter, france或pasteur sanofi，
的抑制。分别^f在没有;道;泌物存在或在p1 ;特异性fab存在或有 对照iga 2f5存在下的p24水平测定为阴性对照和阳性对照。将阴性 对照值取为100%转胞吞作用并且用于表示结果。
将实验至少进行两次。
获得的结果如图5中所示。
结果表明来自免疫接种不含佐剂的(36和37)或含人rantes(61 和63)或含不耐热毒素(hlt) (64和65)的病毒体样小泡-pl的家兔的子 宫颈阴道分泌物能够抑制通过ht-29细胞的hiv-1进化枝c的转胞吞 作用。
在不使用佐剂和使用hlt情况下，使用来自笫18周的子宫颈阴 道分泌物观察到了 70-90%的抑制作用。
在使用hrantes的情况下，使用来自第23周的子宫颈阴道分泌 物观察到了 85-90%以上的抑制作用。
实施例4:
逸舍舁i在于,a4面^ w-^ 衍jw戎^廉^ #^萝逸合#对 錄麟颠凝并
准备年龄约为5岁的3组5-6只雌性猕猴接受如实施例1中所迷 制备的病毒体样小泡。
通过肌内给予(猕猴gl. 1-g1. 5)或通过鼻内给予(猕猴g2. 1-g2. 5)或通过肌内和鼻内给予(猕猴g3. 1-g3. 6)病毒体样小泡。 应用下列给药方案。
在首次给予制剂前4周，猕猴接受肌内注射失活的a型流感(ioo jlil失活的a型流感，o，ol mg/ml)。
此后，猕猴在0， 4, 12和24周时接受病毒体样小泡给药(40pg， 100 pl)。
在第25和26周时取直肠灌洗液和阴道分泌物。 按照下列elisa方案测定总抗体，igg和iga水平。 将在碳酸氢盐緩冲液50 mm， ph 9. 6中的肽p1(100 ng/100 jnl/
孔，seq id no 3)用于在4c下包被nunc平板过夜。
用bsa 2%/pbst 0. 1%将平板饱和1小时30分钟/37。c，然后用
pbs-tween 0， 1%緩冲液洗涤。
将未稀释的直肠灌洗液或用pbst 0. 1%稀释1/2的阴道分泌物在
4t下孵育过夜。
此后用pbs-tween 0. 1%緩冲液沖洗平板并且与用bsa 2%/pbst 0. 1%稀释的初级抗体一起孵育。
为了检测猕猴igg抗体，使用抗-猕猴igg山羊抗体 (rockland) (1/15 000)，随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素 -hrp (immunotech) —起孵育。
为了检测猕猴iga猕猴抗体，使用抗-猕猴iga山羊抗体 (rockland) 1/15 000)，随后与按照1/50 000稀释的链霉抗生物素 -hrp (immunotech) —起赙育。
将2f5-igg单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人igg山羊fab， 2(最终0. 1 pg/ml) (rockland 609106123)—起孵育并且使用链霉抗生 物素-hrp(1/50 000)显示。
将2f5-igg单克隆抗体用作阳性对照，随后与抗-人igg山羊fab， 2 (1/20 000)—起孵育并且使用链霉抗生物素-hrp (1/50 000)显示。
将抗体在37t下孵育1小时。
比色反应通过添加底物tmb引起并且通过添加h2p04 1m终止。在450 nm处读取光密度(od)。
在图6和7(igg和iga阴道分泌物)和图8(直肠灌洗液)上例证了 获得的结果。
结果表明90-95%的雌性猕猴具有良好的进入其生殖器分泌物的 特异性igg和iga抗体抗-gp41水平，并且95%以上具有进入其直肠洗 涤液的特异性iga抗体抗-gp41。
总之，在来自免疫接种雌性猕猴的阴道分泌物和直肠灌洗液中观 察到存在igg和iga抗体。
结果揭示出可以使用本发明的疫苗获得使用粘膜抗体的免疫应答。
另外，观察到iga和igg抗体甚至在免疫粘膜佐剂存在下肌内注 射进行的疫苗接种后也可以重新分布入生殖和肠区室。
实施例5:
^t《^《多滋辦4邦^^凝并錄换w厉道^必參和j:應演遂濕;^ ^t脊應在^^^命賴
对在可透性滤膜支持物(o. 45微米孔径)上生长为致密极化单层 达7天的上皮细胞系ht-29实施通过上皮细胞的r5 hiv-1林(来自nih 的初级hiv进化枝b的v29和来自nih的初级hiv进化枝c的v25)转 胞吞作用和用抗体中和转胞吞作用，从而在独立的室之间形成界面。
获得初级pbmc并且如lagaye等(j. virol， 2001, 75: 4780)所 述制备。然后使用植物凝集素(pha)将pbmc活化48小时并且与初级 hiv-1进化枝b (v29)或初级hiv-1进化枝c (v25) —起孵育并且在感染 后第7天时使用。
将如实施例4中所迷获得的来自第25周含抗体的(l/25稀释)或 直肠灌洗液(1/25稀释)在18匸下与1.106 hiv-1 pbmc 一起孵育1小 时。
为了引起病毒转胞吞作用，向上部室中加入含抗体的2.106 hiv-1 pbmc(v29或v25)。 hiv-1 pbmc与上皮单层之间的接触导致hiv-1病毒体快速萌发，随后它们从上部转胞吞至上皮细胞的基底外
侧孑l。
2小时后，通过用elisa(coulter， france或pasteur san0fi，
的抑制。分别将在没有阴道分泌物存在或在pl非特异性fab存在或有 对照iga 2f5存在下的p24水平测定为阴性对照和阳性对照。将阴性 对照值取为100%转胞吞作用并且用于表示结果。 将实验至少进行两次。
获得的结果如图9(阴道分泌物)和图io(直肠灌洗液)中所示。 结果表明所述抗体能够预防至少60%的hiv通过体外人粘膜上皮
模型进入并且在16只动物中有2只达98%。
因此，本发明的疫苗能够引起igg和粘膜iga免疫应答。粘膜免
疫应答能够显著减少来自不同hiv进化枝的hiv粘膜转胞吞作用。
权利要求
1. 至少包含gp41衍生的抗原或其类似物的病毒体样小泡，所述gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其内部并且为简便的构型以便赋予所述的病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(hiv)的gp41蛋白的免疫应答的能力。
2. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的gp41衍生的 抗原对于细胞膜不具有融合性。
3. 权利要求1或2所述的病毒体样小泡，其中所述的位于外表 面的所述gp41个汙生的抗原-与所述的病毒体样小泡的脂质共价连接；或 -通过不同于野生型gp41蛋白的野生型肽跨膜结构域的肽跨膜结 构域嵌入所述病毒体样小泡的脂双层。
4. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接的 gp41衍生的抗原包含至少一个n-或c-末端定位的交联残基。
5. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的交联残基选 自cys或lys。
6. 权利要求4或5所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接 的gp41衍生的抗原进一步包含至少一个在所述的n-或c-末端定位的 交联残基与相应n-或c-末端gp41衍生的抗原端之间的间隔残基。
7. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的间隔残基选 自gly, ala, ser, asp, lys, gln， his, ile和leu残基。
8. 权利要求3-7中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 脂质选自两亲peg衍生物，磷脂酰乙醇胺(pe)，磷脂酰胆碱，磷脂酰 丝氨酸，胆固醇或其混合物。
9. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的共价连接的 gp41衍生的抗原通过双官能琥珀酸酯连接基，特别是y-马来酰亚氨 基丁酸n-羟基琥珀酸亚胺酯或n-y-马来酰亚氨基丁酰氧基-琥珀酰 亚胺-酯与所述的脂质连接。
10. 权利要求3-9中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原不具有其肽跨膜结构域。
11. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 位于外表面的gp41衍生的抗原由其c-末端定位。
12. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原为单，二，三或四聚体及其混合物的形式。
13. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 抗原gp-41衍生的抗原选自hiv a， b， c或d型进化枝。
14. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 gp41衍生的抗原为由seq id no 1所述序列的全部或部分表示的氨基 酸序列的肽或其类似物。
15. 权利要求1-13中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 gp41 -时生的抗原为由选自seq id no 2， seq id no 3的序列的全部 或部分表示的氨基酸序列的肽或其类似物。
16. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述的 融合小泡包括包含脂质的脂双层，所述的脂质选自阳离子脂质，合成 脂质，糖脂类，磷脂类，磷酸甘油脂类，鞘糖脂类类，鞘脂类，胆固 醇及其衍生物。
17. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中它还包 含至少一种增强和/或介导免疫应答的佐剂，所述的免疫应答选自先天 免疫应答或适应性免疫应答。
18. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的适应性免疫 应答选自thi和/或th2免疫应答。
19. 权利要求17或18所述的病毒体样小泡，其中所述的佐剂选 自铝盐；磷酸铝凝胶；分枝杆菌，诸如bcg,母牛分枝杆菌(m raccae) 或小棒杆菌(譜，6a"e"'咖,陋)；肽类；匙孑l血蓝蛋白；胞 壁酰二肽和三肽衍生物；单磷酰脂质a;白细胞介素-2(il-2); il-12; gm-csf;来自趋化因子家族的配体，诸如rantes(活化表达和分泌的 正常t细胞时调节的)；gram 菌的脂蛋白；酵母细胞壁成分双链rna;grant菌的脂多糖；鞭毛蛋白；富含u的单链病毒rna;含cpg的dna; 细胞因子信号传递小干扰rna的阻抑物(s0cs sirna)，蜂毒素衍生的 肽类，pandr表位(padre)及其混合物。
20. 权利要求17-19中任意一项所述的病毒体样小泡，其中所述 的佐剂包嚢在所述的小泡内部和/或掺入所述小泡的脂双层和/或自由 地与所述的小泡合并。
21. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，进一步包含 组织或细胞-特异性靶向部分，其选自细胞-表面受体，趋化因子，细 胞因子，生长因子，抗体或抗体片段，具有与黏着分子互补的特异性 或比电荷的肽序列。
22. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的组织或细胞-特异性靶向部分被掺入所述小泡的脂双层中或附着于其上。
23. 上述权利要求中任意一项所述的病毒体样小泡，其中它包含 1-10个额外的抗原。
24. 上述权利要求所述的病毒体样小泡，其中所述的额外的抗原 选自f汴生子由env(gpl20， gp41) ， gag(p9， p17， p24)和pol(p66, p32)基因编码的结构蛋白和衍生物由nef,rev或tat基因编码的调节 蛋白的hiv肽类及其混合物。
25. 药物组合物，包含权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡。
26. 上述权利要求所述的药物组合物，其中它包括包含位于所 述小泡外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包嚢在所迷小泡内部 的gp41衍生的抗原的小泡，它们作为在免疫疗法中同时，单独或依次 应用的联用制剂。
27. 权利要求25或26所述的药物组合物，进一步包含额外的病 毒体样小泡，其包含不同于所述的gp41衍生的抗原的抗原，它们作为 在免疫疗法中同时，单独或依次应用的联用制剂。
28. 权利要求1-24中任意一项的至少一种病毒体样小泡在制备 打算用于诱导针对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的适应性免疫应答和/或先天免疫应答的药物组合物中的应用。
29. 治疗和/或预防hiv感染的方法，至少包括对有此需要的个体 给予有效量的权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡的步骤。
30. 上述权利要求所述的方法，其中通过注射或通过粘膜途经或 其组合给予所述的病毒体样小泡。
31. 上述权利要求所述的方法，其中所述的粘膜途经选自泌尿生 殖道，胃肠道，肛门直肠途经，呼吸道，上部粘膜组织，口腔-鼻途经 及其混合途径。
32. 权利要求29-31中任意一项所述的方法，其中所述的病毒体 样小泡包括包含位于外表面的gp41衍生的抗原的小泡和包含包嚢在 所述小泡内部的gp41衍生的抗原的小泡，它们作为在免疫疗法中同 时，单独或依次应用的联用制剂。
33. 权利要求29-32中任意一项所述的方法，其中将所述的病毒 体样小泡与不同于所述gp41衍生的抗原的额外抗原联合给药。
34. 用于诱导对人免疫缺陷病毒的gp41蛋白的免疫应答的试剂 盒，包括-至少第一种权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡，其至少 包含第一种gp41衍生的抗原；和-至少第二种权利要求1-24中任意一项的病毒体样小泡，其至少 包含第二种gp41衍生的抗原，所述的第 一种和第二种gp41衍生的抗原彼此不同。
35. 上述权利要求所述的试剂盒，其中所述的第一种gp41衍生的 抗原为由选自seq id no 2， seq id no 3的序列的全部或部分表示的 氨基酸序列的肽或其类似物，并且所述的第二种gp41衍生的抗原为由 seq id no 1中所述序列的全部或部分表示的氨基酸序列的肽或其类 似物。
全文摘要
本发明涉及至少包含gp41衍生的抗原或其类似物的病毒体样小泡，所述的gp41衍生的抗原位于所述小泡的外表面和/或包囊在其内部并且为简便的构型以便赋予所述的病毒体样小泡诱导对人免疫缺陷病毒(hiv)的gp41蛋白的免疫应答的能力。
文档编号c07k14/16gk101437841sq200780015961
公开日2009年5月20日 申请日期2007年3月2日 优先权日2006年3月3日
发明者m·邦塞尔, r·泽布里根, s·弗勒里 申请人:麦米提克斯公司;国家健康科学研究所;佩维昂生物技术有限公司