专利名称：：p15发夹构建体及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及发夹dna构建体，及其用于在植物:体内特别是在甜菜植物中诱发转录后基因沉默机制(post-transcriptionalgenesilencing,ptgs)的应用，目的是获得对滤过性病毒如甜菜坏死黄脉病毒(beetnecroticyellowveinvirus,bnyw)有增强的抗性或耐受性的植物。本发明还涉及对'例如甜菜坏死黄脉病毒和其后代有增强的抗性的转基因细胞和禾直物。
背景技术：
：人们对赋予植物以病毒抗性或耐受性这一领域深感兴趣。对于农作物，其收成损失很大比例上是由于病毒感染。—种被称作丛根病(rmzomania)的广泛传播的甜菜块根(万etovw扭^)疾病是由病毒引起的。该病毒是甜菜坏死黄脉病毒bnyw(1，2)，其借助土传真菌多粘菌cpofymj;x"6etoe)被转移到甜菜的根部(3)。在甜菜植物供工业使用的欧洲、美国和日本,这种疾病影响面积巨大，而且仍然在向西欧几个地区扩张(4，5)。自从1986年以来，大量的报道和出版物描述了使用分离出的在植物体内表达的病毒核苷酸序列来赋予植物以对某种特定感染性病毒的高度的耐受性，或者甚至赋予其以x寸大量相关病毒的广谱型抗性(6，7，8)。在大量养殖的种类，如马铃薯、南瓜、黄瓜或是西红柿中，基于基因工程的病毒抗性对策中，记录最多的对策是使用受控于植物调控元4牛下的病毒核苷酸序列，用于编码目标病毒的外壳蛋白(9)。但是，即使是外壳蛋白介导的抗性中，在转基因植物体内某一水平的抗性表达可能归因于不同的机理，如rna的共抑制作用，或者由于蛋白序列的产生而引发的蛋白质介导的抗性。总而言之，通过使用农杆菌(jgro^cten'wm)介导转化体系或者根据可成功应用于给定物种的组织培养物或细胞培养物的约束条件进行基因直接转移的方法"孰而将病毒序列转化入适合的植物细胞或组织培养中。(随后)再生整个植株，并表征转基因的表达。甜菜被认为是不适合细胞培养的物种，这限制了该物种中使用实用的基因工程的程度。尽管如此，现在关于对该植物的转化和再生的报道正在增加(38)。人们已经发表了一些通过在甜菜基因组中转化和表达bnyw外壳蛋白序列从而使之对bnyw产生耐受性的例子(u,w091/13159),虽然他们很少报道关于整个功能性转基因甜菜植物的数据(12)。其中，报道显示了有限的数据，这些数据是关于在感染条件下观测到的被编码bnyw外壳蛋白序列的基因转化了的转基因甜菜植物的实际抗性水平(13，14)。专利申请w091/13159描述了一整套技术，包括一种甜菜转化方法、和在由上述转化方法得到的转基因甜菜之中使用bnyw外壳蛋白序列表达作为抗性来源的方法。基于已经发表的信息，人们仍不能肯定外壳蛋白介导机制为通过完全抑制病毒的繁殖和扩散机制而给予甜菜植物对bnyw感染的完全免疫提供任何潜在可能性。识别一个在感染过程前期能显著阻碍病毒扩散的抗性机制将是成功开发这样一个转基因抗性的主要成果判据。此外，这种抗性将使得可利用的抗性机制多样化。因为该疾病在许多国家和地区以一定的速度扩张，其速度取决于各种当地环境和农业因素的共同作用，人们非常关注基因抗性机制的多样性和改进程度。这些机制，或单独作用或在共同作用，可能给予供工业使用的现有和将.会使用的各种甜菜以一个长期稳定的抗性策略。bnyw基因组包括五种正义rna，其中两种--rna1和rna2对于所有植物的感染起着关键性的编码作用，而其它三种(rna3、rna4、rna5)涉及甜菜(甜菜块根)的载体介导的感染。bnyw在细胞间的移动(cell-to-cellmovement)由位于rna2上的三种连续的、轻微重叠的病毒基因控制，这套基因被称作三重基因区段(thetriplegenel)lock，tgb),tgb根序地编码病毒蛋白p42、p13和p15(通过以千道尔顿(kda)为单位而算得分子量的指定的基因产物)。在下列描述中，通过下列术语来识别tgb基因和相应蛋白tgb-1、tgb-2、tgb-3，或通过它们编码的病毒蛋白编号p42、p13和p15来识别。tgb负体在其它真菌传杆状病毒属(furoviruses)或potex病毒属、carla病毒属和大麦病毒属(hordeivirases)(15,18,19,20,21和22)中也存在。附表l列出了有tgb-3序列的病毒，以及这些病毒的分子量，寄主和相关文献。早期结果显示p15的表达独立于病毒.rna的复制种类;(复制子)，.该复制子源自.bnywrna3。p15的这种独立表达能通过干扰bnyw在细胞间的移动而抑制bnyw的感染(16)。为了将含有tgb-3核酸序列的病毒导入植物细胞或植物中，人们提出将含有上述tgb-3核酸序列的核酸构建体以可操作地连接到在上述植物中有活性的一个或多个调控序列上(wo98/07875)。然而，尽管在转基因植物中野生型tgb-3病毒序列的表达使得上述病毒感染受阻，上述野生型序列的存在可能诱发对转基因植物或植物细胞的农业特性的有害作用。本发明基于该发现一些在本发明中揭露的某些突变的(基因修饰过的)tgb-3病毒序列在甜菜植物bnyw抗性的基因工程中是高度有用的。
发明内容发明目的本发明旨在提供如下更可靠的方式方法通过基因修饰或转化植物细胞，给予植物、特别是甜菜植物以病毒抗性，比如bnyw病毒抗性、尤其是极有益的bnyw抗性。此外，本发明旨在提供基因修饰过或转化过的植物细胞等可获得的细胞，这些细胞能再生出显示对植物病毒如bnyw的抗性或耐受性增强的植物。同时，本发明的另一目的在于提供有抗性的后代，如对bnyw有抗性的后代、种子和其它源自这类转化过的植物和植物细胞的可繁殖的器官或结构。发明概要在细胞间移动的tgb-3野生型序列的功能似乎至少部分涉及在寄主植物的元f牛(优选是胞间律丝的组成)和病毒源的元件(优选是另一种在细胞间移动的病毒蛋白)之间的"桥接"相互作用。tgb-3野生型序列的结构域(假设它和寄主元件相互作用)或tgb-3野生型序列(假设它和病毒元件相互作用)结构域的破坏会使得细胞间的移动受抑制。此外，上述tgb-3野生型序列中的特异性突变似乎允许所产生的突变体在转基因植物中生成，这种突变体将仍然和病毒元件相互作用，但是不和寄主元件相互作用。这些突变体可能竞争病毒感染前期产生的tgb-3野生型序列的病毒元件上的结合位点，并且通过抑制病毒向邻近细胞的移动而中断感染。尤为有利的是，上述序列中至少一种氨基酸将另一种不同的氨基酸的取代是在富含亲水氨基酸的区域发生的，这些亲水氨基酸通常出现在蛋白天然结构的表面。优选点突变允许实现一种或两种氨基酸取代另外不同的一种或两种氨基酸。附表1列出了上述含tgb-3野生型序列的病毒的优选例子，以及相应tgb-3肽的分子量、病毒寄主和文献。同样列出了bnyw的特异性野生型p15核苷酸序列和氨基酸序列(17，该文献中附带了供参考的野生型序列)。通过为本领域的熟练技术人员所熟知的常规方法可以实现上述点突变。当上述含有点突变的突变体(带有功能性紊乱的tgb-3序列，优选带有功能紊乱的p15基因的bnyw突变体)在复制子的转化体中表达时，测试其促进病毒突变体在细胞间移动的能力。这些突变体不能促进这类移动，并且当从复制子表达tgb-3序列、优选p15基因的突变形式时，用共接种的野生型tgb-3病毒、优选与野生型bnyw共接种的野生型tgb-3病毒，来测试它们抑制感染的能力。发明者意外地发现，根据本发明基因修饰方法(优选点突变)可以获得基因修饰过的tgb-3病毒序列(优选修饰过的bnywp15序列.)，将其植入植物或植物细胞的基因组内后，这一序列能阻碍病毒感染，同时不产生有害效应。"能阻碍病毒感染植物或植物细胞"意味着通过上述基因修饰过的tgb-3病毒序列转化植物或植物细胞获得对上述病毒感染的高水平的耐受性成为可能，尤其是人们将有可能形成一个快速和完整的阻滞植物体内病毒的繁殖和扩散机制、优选阻滞bnyw病毒在甜菜植物(甜菜块根)中的繁殖和扩散机制。这些甜菜植物包括可能被bnyw感染的饲料甜菜(/o必ct"6ee,)、瑞士食用甜菜(sw/mc/wno和塔波甜菜(rawe5e^)。上述耐受性或抗性易于通过为本领域的熟练技术人员所熟知的方法测定。优选tgb-3野生型病毒序列的基因修饰方法是涉及病毒在细胞间移动的野生型病毒序列中部分序列的点突变。本发明同样涉及用上述方法(基因修饰和筛选)获得(回收)的修饰过的tgb-3病毒核苷酸和氨基酸序列，更优选用上述方法获得(回收)的bnywp15的被修饰的核苷酸和氨基酸序列。优选上述bnywp15的核苷酸和氨基酸序列从下列核苷酸或相应的氨基酸序列中选择卿//服'7:atggtgcttgtggtt^^agtaggrttatctaatattgtattgtacatagttgccggttgt60mvlvvav"snivlyivagcgttgttgtcagtatgttgtactcaccgtttttcagcmcgatgttamgcgtccagctat120vvvsmlyspffsndvkassygcgggagcmtttttmggggagcggctgtatcatggacaggmttcgtttgctcmttt180agaifkgsgcimdrnsfaqfgggagttgcgatattccaaagcatgtagccgagtccatcactmggttgccaccmagag240gscdipkhvaesitkvatkecacgatgttgacataatggtaaaaaggggtgmgtgaccgttcgtgttgtgactctcacc300hdvdimvkrgevtvrv.vtltgamctatttttatmtattatctagattgtttggtttggcggtgtttttgttcatgata360etifiilsrlfglavflfmitgtttmtgtctatagtttggttttggtatcatagatm399clmsivwfwyhr承郷/z服'3:atggtgcttgtggttaaagtagatttatctmtattgtattgtacatagttgccggttgt60mvlvvkvdlsnivlyivagcgttgttgtcagtatgttgtactcaccgtttttcagcmcgatgttmagcgtccagctat120vvvsmlyspffsndvkassygcgggagcmtttttaaggggagcggctgtatcatggg:^gmttcgtttgctcmttt180agaifkgsgcim^^nsfaqfgggagttgcgatattccamgcatgtagccgagtccatcactaaggttgccacc嵐gag240gscdipkhvaesitkvatkecacgatgttgacatmtggtaaamggggtgaagtgaccgttcgtgttgtgactctcacc300hdvdimvkrgevtvrvvtltgmactatttttataatattatctagattgtttggtttggcggtgtttttgttcatgata360etifiilsrlfglavflfmitgtttmtgtctatagtttggttttggtatcatagataa399clmsivwfwyhr承卿j"服5..atggtgcttgtggtt嵐gtagatttatctmtattgtattgtacatagttgccggttgt60mvlvvkvdlsnivlyivagcgttgttgtcagtatgttgtactcaccgtttttcagcmcgatgttmagcgtccagctat120vvvsmlysp.ffsndvkassygcgggagcmttttt线gggagcggctgtatcatggacaggmttcgtttgctcaattt180agaifkgsgcimdrnsfaqfgggagttgcgatattccaaagcatgtagccgagtccatcactmggttgccaccaaagag240gscdipkhvaesitkvatkecacgatgttgacatmtggtaaaaaggggtgmgtgaccgttcgtgttgtgactctcacc300hdvdimvkrgevtvrvvtltgaaactatttttataatattatctagattgtttggtttgg^xg^xtttttgttcatgata360etifiilsrlfglgqflfmitgtttmtgtctatagtttggttttggtatcatagatm399clmsivwfwyhr本在下列描述中，各种修饰过的bnywtgb-3序列此后将被称为"p15突变体"，通过下列关系识别bnp15-am，对应seqidno:1;bnp15-ala4，对应seqidno:3;bnp15陽asp9，对应seqidno:5。seqidnol、3、5的核苷酸和相应的氨基酸序列可与seqidno:7对比，后者是已经在文献17中描述了的野生型p15核苷酸和氨基酸序列(seqidno:8)。本发明还涉及含有上述修饰过的核苷酸序列或其片段的载体，这些序列或片段可以与一种或多种在植物或植物细胞中有活性的调控序列相连接。优选所述载体是己经含有上述在植物或植物细胞有活性的调控序列的质f立。载体也可以是仅仅是含有所研究的核苷酸序列的核苷酸序列盒，该所研究的核苷酸序列将被插入植物的基因组(在本例中是修饰过的bnywtgb-3序列或其片段)。所述序列盒与一个或多个启动子、终止核苷酸序列以及可能的调控序列相连接，该调控序列足以获得所研究的序列的高效表达。但是该载体进一步(基本上)不含其它原核的或质粒的核苷酸序列(参见专利ep1174513)。本发明还涉及用于诱导对含有tgb-3序列的病毒的抗性的方法，优选所述病毒是附表l中列出的病毒，更优选是bnyw病毒。所述方法包括下列步骤一制备核酸构建体，其含有根据本发明的方法进行基因修饰的核酸序列，或含有这种被修饰过的序列的片段的核酸序列；并且该序列被可操作地连接到一个或多个在植物或植物细胞有活性的调控序列上；一用该核酸构建体转化植物细胞；一尽可能地由转化后的植物细胞再生转基因植株。优选上述方法被用于诱导甜菜植物或甜菜细胞对bnyw的抗性。所述方法包括下列步骤一制备核酸构建体，其含有根据本发明的方法进行基因修饰的核酸序列，或含有这种被修饰过的序列的片段的核酸序列；优选制备核酸构建体，其含有选自由seqidno:l、seqidno:3和seqidno:5所构成的组的核酸序列，或含有这些序列组中任一序列的片段，并且该构建体被可操作地连接到一个或多个可在植物或植物细胞中有活性的调控序列上；一用该核酸构建体转化甜菜植物细胞；一尽可能地由转化后的甜菜植物细胞再生转基因甜菜植物。本发明还涉及获得或回收的转基因植物或转基因植物细胞，其对含tgb-3序列的病毒感染具有抗性，尤其是对附表l中列出的病毒、特别是bnyw病毒具有抗性。上述植物或植物细胞含有这样一种核酸构建体其含有tg6-3的被修饰的核酸序列，并且可操作地与在植物或植物细胞中有活性的一个或多个调控序列相连接。优选所述修饰过的核酸序列选自由seqidno:1、seqidno:3和seqidno:5所构成的组，被可操作地与在植物或植物细胞中有活性的一个或多个调控序列相连接。更优选细胞是气孔细胞(stomatalcell)，且调控序列含有在细胞中有活性的启动子序列和终止子序列。上述启动子序列组成型序列或可以从外源启动子序列中获得，优选选自由35s花椰菜花叶病毒(qm/折owe/"moraz'cwms)启动子和/或多聚遍在蛋白(polyubiquitin)拟南芥(xm6/cojasz'saa//aw)启动子所构成的组。优选启动子序列是一种根特异性启动子，其主要能在植物的根组织中有活性，尤其是在甜菜植物的根组织中，比如来自尸m^om'aamferaom7的戸r启动子或血红蛋白(haemoglobin)基因。本发明的另一方面涉及根据本发明获得的转基因植物的转基因植物组织，比如果实、茎、根、块茎和种子，或是根据本发明由转基因植物或植物细胞获得的可繁殖结构(优选选自由愈伤组织、芽或胚所构成的组)。本发明采用的方法中使用到的植物转化、组织培养和再生的技术是为本领域的技术人员所熟知的技术。优选这些技术是在国际专利申请wo95/101778、w091/13159(对应欧洲专利申请ep-b-0517833)、wo98/07875列出的技术。这些专利已经列于参考文献中。保护细胞原生质体(guardcellprotoplasts)是用于甜菜植物转化的优选组织。根据本发明，优选这些技术用于制备转基因^t菜植物和植物细胞。在根据本发明用突变的或基因修饰的tgb-3(p15).序列(seqidno:1、3、5)转化的甜菜植物中，人们发现在生物测定中植物展示出明显的bnyw高抗性，并且这一发现被田间实验所证实。用seqidno:3转化的植物对bnyw的高抗性尤为明显。突变pi5蛋白的产生能诱发抗性。westernblot.分析证实，在用seqidno:3的序列转化的高抗性植物体内，突变p15蛋白的表达被强烈地抑制，但仍然存在。这一现象标志着获得的沉默机制还不足以有效地降解每一种p15的mrna。将能过度生成p15的未通过ptgs沉默的转基因植物产生的p15的数量和ptgs机制被激活的抗性植物产生的p15的数量相比较。对植物材料更详细的分子量的表征证实了小分子rna的存在，这些分子能与bnywtgb-3(p15)野生型序列的正义链和反义链互补。通常人们认为这些正义和反义小分子rna毫无疑问地和转录后基因沉默(ptgs)诱导的抗性机制相关。对感染bnyw病毒的抗性植物的northernbolt分析证实，其与易感对比组相比，bnywrna2缺失。由于在抗性植物中产生的小分子p15rna的高度同源依赖性的序列特异性，这些转录激活了全部rna2的降解过程。在这些植物中产生ptgs机制，而没有被基因构建体自身的改变引发，更大的可能性是源自插入的重排。发明者意外发现，含有根据本发明的突变的tgb-3(p15)序列、或其正向和反向片段的发夹构建体能有效地引发ptgs，实现例如bnyw的rna2的降解。尤其是seqidno:3的tgb-3突变序列(尽可能进一步例如是经修饰的序列以抑制翻译)和片段或其一部分证实，其以高度复制的方式非常有效地引发ptgs。因此，本发明的另一个方面涉及这些双链自身互补(自补)的rna分子；以及涉及核酸构建体特别是植物细胞中的dna构建体或核苷酸序列、载体、用于表达它们的表达盒;以及涉及基于此的方法和用途。本发明提供的是核酸构建体，尤其是dna构牵体，其可改变tgb-3移动蛋白的表达。上述核酸构建体含有第一dna序列，其能在细胞中"表达"含有如(修饰过的)seqidno:l、3或5的序列、或(所述修饰过的)seqidno:l、3或5的片段或部分的突变bnywtgb-3的有义片段；以及第二dna序列，其能在所述细胞中"表达"含有(修饰过的)seqidno:1、3或5的序列、或(所述修饰过的)seqidno:1、3或5的片段或部分的所述突变bnywtgb-3的反义片段。其中"表达"主要是指"转录"或"(m)rna片段的形成"(见下段)。转录之后接着可能是"翻译"。但是，通常翻译受到抑制(见下文)。"—(修饰过的)"是指正在讨论的序列将被进一步修饰，如用于抑制翻译。例如，术语"seqidno:3"是指seqidno:3的序列，以及"修饰过的"seqidno:3的序列比如seqidno:10。本发明提供的是此类基因修饰的tgb-3病毒序列，该序列含有(修饰过的)seqidno:3序列或其片段，并含有上述(修饰过的)seqidno:3的反义序列或上述(修饰过的)seqidno:3片段的反义序列，其中当在细胞中被转录时tgb-3病毒序列能形成双链自补的rna分子。本发明提供的是例如基因修饰过的tgb-3病毒序列，其含有选自下组的序列(a)含有seqidno:3和seqidno:3反义序列的核苷酸序列；(b)含有seqidno:3片段和所述seqidno:3片段的反义序列的核苷酸序列；(c)含有基因修饰过的seqidno:3和所述修饰过的seqidno:3的反义序列的核苷酸序列；以及(d)含有基因修饰过的seqidno:3片段和所述修饰过的seqidno:3片段的反义序列的核苷酸序列，其中所述基因修饰过的tgb-3病毒序列当在细胞中转录时能形成双链自补的rna分子。优选有义和反义序列被包含在单一核酸序列、单一dna链或分子中。它们也可以存在于在两种不同的核酸序列、能碱基配对并形成双链自补的rna分子的dna链或分子内/上。当被转录时，根据本发明的基因修饰的tgb-3病毒序列可产生带有核苷酸序列的rna分子或核酸序列，所述核酸序列含有1)有义核苷酸序列，其至少有约10个连续的核苷酸(nt)，更优选约15个，尤其优选至少约50、100、150、200、250、300、350个，最优选约400个连续的核苷酸--例如，修饰过的seqidno:3或其片段的序列一其具有与p15bnywwt序列(seqidno:7)至少一部分大约75~100%的序列同源性，以及2)反义核苷酸序列，其足以与该有义序列互补。因此，当足量表达(转录)时，被表达的(被转录的、优选未被翻译的)rna分子能形成双链自补的rna分子。例如人工发夹rna结构，其具有通过在包含有义和反义核苷酸序列的区域间经碱基配对而形成的双链rna茎部。"足量"是指足以诱发ptgs、优选诱发完全的基因沉默的数量。根据本发明的自补发夹构建体也被称为突变的(bnyw)p15发夹构建体(hpl5)。优选有义和反义核苷酸序列彼此互补。期望的是，在互补区域，有义和反义rna片段之间的错配率低于50%。更期望的是错配率低于30%,优选低于约20%的错配率，更优选错配率低于约10%，更优选低于约5%、4%、3%、2%或1%的错配率。优选有义核苷酸序对或dna序列的全长至少有约10个核苷酸、15个核苷酸，更优选至少有约20个核苷酸、25个核苷酸，尤其优选至少有约50个核苷酸，更优选至少有约100个核苷酸，更优选至少有约150个核苷酸，更优选至少有约200个核苷酸、250个核苷酸、300个核苷酸，特别优选至少有约350个或者400个核苷。优选有义核苷酸序列的全长越长，对在全长核苷酸序列(本例中尤其指对应于seqidno:3的序列或其一部分)和耙标基因中的相应序列(本例中如bnywp15野生型序列)间序列同源性的要求变得越宽松。优选有义核苷酸序列全长与bnywp15野生型序列或其一部分之间的序列同源性应当至少为75%，更优选至少为约80%，尤其优选至少为约85%为合适，尤其优选至少为约90%，更优选至少为约95%，尤其优选至少为约99%乃至更高(但是优选低于100%)。优选的突变tgb-3序列，pl5-ala4(seqidno:3)与野生型p15相比有3个突变的碱基相当于99.24%的同源性或序列同源性。本发明的另一个优选序列seqidno:10与野生型p15相比有5个突变的碱基，相当于98.74%的同源性(见图8)。然而，优选有义核苷酸序列通常含有约io个连续核苷酸的序列，更优选约20个核苷酸，更优选约50个核苷酸，特别更优选约100个核苷酸，更优选约150个核苷酸，含有约150个连续核苷的序列与耙标核酸(本例中为bnywp15序列)的序列同源性为100%。优选地，对于计算序列同源性和设计相应的有义核苷酸序列，间隙应当尽可能小，尤其对于较短的核苷酸序列而言。相对于野生型p15序列，优选修饰的有义tgb-3序列至少含有下列修饰在核酸位点3处突变的野生型p15基因，其中鸟嘌呤(g)被胞嘧啶(c)取代；另一个特异性取代含有在核酸位点158处的突变，其中腺嘌呤(a)被胞嘧啶(c)取代；再一个特异性取代是指向位点160和161处的突变，其中ag被gc取代、同时附加在397位点处t被c取代(见图8，seqidno:io)的突变。这些在位点3处的修饰抑制了翻译的启动，而在397位点处的修饰破坏了翻译终止信号。根据本发明的另一个优选修饰过的有义tgb-3序列是seqidno:3，其与野生型p15基因相比含有下列修饰在核酸位点158处的突变，其中a被c取代；另一个特异性取代指向在160和161位点处的突变，其中ag被gc取代。反义核苷酸序列的长度主要由有义核苷酸序列的长度确定，优选其长度等同于后者的长度。但是，可以使用与有义序列长度相差约10%到50%、优选相差约10%到15%的反义序列。相似地，反义区域的核苷酸序列主要由-有义区域的核苷酸序列确定，优选其等同于有义区域的核苷酸序列的互补序列。尤其是对于较长的反义区域，使用与有义核苷酸序列的互补序列同源性较低的反义序列也是可行的，但相对与有义核苷酸序列的互补序列，优选反义序列至少有约75%的同源性，优选至少约80%，尤其优选至少约85%，特别优选至少约90%的同源性，特别优选至少约95%的同源性。尽管如此，优选反义核苷酸序列通常包括具有大约10个、15个连续核苷酸(nt)的序列，优选约20个核苷酸，更优选约50个核苷酸，特别优选约100个核苷酸，最优选约150个核苷酸(与此时有义核苷酸序列相应部分的互补序列有100%的同源性)。很明显，与有义核苷酸序列互补序列有100%同源性的连续核苷的伸展长度不能大于有义核苷酸序列本身。同样，间隙数量应当尽可能小，尤其对于较短的反义核苷酸序列而言。此外，优选反义序列与靶标序列互补序列有75—100%的同源性。根据本发明，核苷酸序列或dna构建体中的有义和反义核苷酸序列的顺序不是关键因素。优选在根据本发明修饰过的tgb-3病毒序列中的有义和反义序列被连接用或间隔用核苷酸序列所分散，该连接用或间隔用核苷酸序列通常是内含子。该内含子优选是植物内含子，更优选是甜菜植物内含子。优选高度转录的内含子，更优选是高度转录的甜菜基因。优选高度转录的基因是核糖体rna基因(24，25)。更优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列中有义tgb-3片段含有(修饰过的)seqidno:l、3或5，或者含有其部分或片段。例如，根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列可以至少含有(修饰过的)seqidno:l、3或5的核苷酸100到核苷酸399、核苷酸150到核苷酸399、或核苷酸163到核苷酸399。最优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列中有义tgb-3片段含有(修饰过的)seqidno:3、或其部分或片段。例如，根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列可以至少含有含有(修饰过的)seqidno:3的核苷酸100到核苷酸399、核苷酸150到核苷酸399、或核苷163酸到核苷酸399。更优选根据本发明的dna构建体中有义tgb-3片段可以由(修饰过的)seqidno:3或其部分(片段)组成。例如，其可以至少由(修饰过的)seqidno:3的核苷酸100到核苷酸399、核苷酸150到核苷酸399、或核苷酸163到核苷酸399组成。更优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列中有义tgb-3片段被进一步突变，使之含有至少一种用于抑制翻译的翻译终止密码子。优选破坏了在根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列中的所述有义tgb-3片段的终止密码子。翻译启动密码子同样可以被修饰以抑制翻译的启动。例如，seqidno:3的atg启动密码子被修饰成atc,而taa终止密码子被修饰为caa(见图8)。该特定序列是指"修饰过的"seqidno:3。本领域的技术人员可以构思出许多其它可行方式。根据本发明优选的构建体是dna构建体或是核苷酸序列，其中根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列中的有义tgb-3片段含有seqidno:10。更优选的是dna构建体，其中根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列中的有义tgb-3片段含有seqidno:10。优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列含有seqidno:9或13。更优选基因修饰过的tgb-3序列由seqidno:9或13组成。优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列可操作地连接到一个启动子上，优选在根部有活性的异源启动子。优选的在植物根部组织有活性的启动子序列是来自尸m^om'a朋^raom'z'的par启动子和血红素蛋白基因。最优选的是在甜菜植物根部有活性的甜菜根特异性启动子。任选地，涉及转录终止和/或多聚腺苷酸化的dna区域或其它调控序列(如增强转录的序列)可以被可操作地连接到根据本发明的dna构建体上。同样地，本发明还涉及一种载体，尤其是一种表达载体或表达盒，其含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列，并且可操控地连接到一种或多种调控序列上。本发明还涉及一种双链自补的rna分子，该分子被根据本发明的基因修饰过的tgb-3序列表达，或者被根据本发明的载体或表达盒表达。本发明的另一方面涉及一种用基因修饰过的tgb-3序列、和/或根据本发明的载体、和/或根据本发明的rna分子转化的寄主细胞。寄主细胞优选是植物细胞、更优选甜菜属细胞，最优选甜菜植物细胞。本发明还涉及转化的植物，优选是转化的甜菜属植物，最优选是转化的甜菜植物。这些植物的基因组中含有根据本发明的dna构建体、和/或根据本发明的载体，并且/或者植物细胞中含有根据本发明的rna分子。优选使用含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的dna构建体和/或含有同样序列的载体来转化植物材料如植物细胞和/或植物组织。优选根据本发明的修饰过的tgb-3序列稳定地整合于植物细胞的基因组上。作为另一种选择，也可以以游离基因的形式存在。本发明因此同样涉及转化过的或基因修饰过的植物细胞，这些细胞含有如根据本发明的dna构建体、和/或载体、和/或rna分子。同样也可以使用根据本发明的rna分子本身来给予bnyw抗性或耐受性(见下文)。本发明的另一个方面涉及由使用根据本发明的dna构建体、载体和/或rna分子转化过的寄主细胞、优选植物细胞再生而得到的的转基因植物，优选是甜菜植物，其显示出变化的tgb-3移动蛋白表达。优选与对照组(未转化或未用本发明的p15发夹结构转化)相比，(bnyw)tgb-3(p15)分子的表达显著下降。这里给出一个bnywp15表达(显著)下降的例子。在根据本发明的p15发夹rna分子存在时，bnywp15表达将低于p15发夹rna分子不存在时的表达，优选仅为根据本发明的p15发夹rna分子不存在时或编码它的基因修饰过的tgb-3病毒序列不存在时的表达的约25%，更优选约10%，更优选约5%。优选bnywp15的表达下降到不能被检测到的水平。p15蛋白的存在能借助使用p15的抗体通过westernblotting测定。可替换的方式是，这种蛋白质的水平借助质谱仪确定，这一技术为人们所熟知。最佳的情况是完全没有p15蛋白或蛋白部分产生，这意味着它的所有mrna被降解或至少已经失活。有利的情况是来自病毒的p15野生型基因表达在用根据本发明的方式方法转化的植物细胞和植物中沉默。有利的情况是，用根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列、dna构建体、载体或rna分子转化了的植物或植物细胞中，病毒的复制不存在。本发明的另一方面涉及根据本发明转化了的植物后代，这些后代的细胞至少一部分中的基因组内含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列、和/或载体，并且/或者这些后代的细胞至少一部分中含有kna分子。优选这一物质(修饰的病毒序列、载体和/或rna分子)基本上会在植物所有的细胞中存在。优选根据本发明的转化后的植物的后代显示出bnywtgb-3移动蛋白表达的变化。同样的策略能适用于表1中所列出的每个病毒，但是，这里描述的p15序列将仅仅以bnyw病毒为耙标。植物组织后代的例子有果实、茎、根、块茎和种子。根据本发明的另一方面涉及转化后的植物的种子，优选是根据本发明的转化的甜菜植物的种子。本发明还涉及(无性)可繁殖的结构，例如来自根据本发明转化的植物的愈伤组织、芽、胚。优选这些后代、种子、可繁殖的结构等在其细胞的至少一部分、优选所有的细胞的基因组中，含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列和/或载体、和/或根据本发明的rna分子。有利的情况是，这些植物材料能再生成有bnyw抗性的植物或植物材料。本发明还涉及这些种子或无性繁殖的结构用于再生植物、优选甜菜植物的应用，该植物对例如bnyw有抗性并且/或者显示出对bnyw的耐受性增加的特性。本发明还涉及一种改变植物或植物细胞中全部rna2、特别是(bnyw)tgb-3移动蛋白的表达的方法，包括下列步骤一在植物细胞中，尤其是甜菜植物的细胞中导入根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列(dna构建体)和/或含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的载体，来获得转化了的植物细胞。其中，在所述植物细胞中能形成双链rna分子的rna分子的表达改变了在所述植物或细胞中全部rna2、尤其是bnywtgb-3移动蛋白的表达，并且优选改变了所述植物或所述细胞中位于上述同样rna分子上的任何其它病毒蛋白的表达。本发明的另一方面涉及一种诱导植物或植物细胞中全部rna2、特别是的bnywtgb-3移动蛋白的转录后基因沉默ptgs的方法。这种方法包括下列步骤一在植物细胞中、尤其是甜菜植物的细胞中导入根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列(dna构建体)和/或含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的载体，来获得转化了的植物细胞。其中，在所述植物细胞中能形成双链rna分子的rna分子的表达引发ptgs机制。在前文中描述的本发明的方法中，优选全部rna2分子被充分降解。本发明的再一方面还涉及一种给予植物或植物细胞以对例如bnyw等列于表1中的植物病毒的抗性或更大耐受性的方法。这个方法包含下列步骤—在植物细胞中、尤其是甜菜植物的细胞中导入根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列(dna构建体)和域含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的载体，来获得转化了的植物细胞。其中，在所述植物细胞中能形成双链rna分子的rna分子的表达导致所述植物对诸如bnyw等植物病毒的抗性和/或增强的耐受性。本发明的再一方面还涉及一种在植物或植物细胞中引起极端抗性(高水平的免疫力)的方法。该方法包括下列步骤一在植物细胞中、尤其是甜菜植物的细胞中导入根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列基因修饰过的tgb-3病毒序列(dna构建体)和/或含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的载体，来获得转化了的植物细胞。其中，在所述植物细胞中能形成双链rna分子的rna分子的表达能够诱导植物的极端抗性(高水平的免疫力)，该植物的至少一部分或全部细胞中含有根据本发明的dna构建杯和/或载体。本发明的又一方面还涉及一种能显著降低或咀碍病毒、尤其是例如bnyw等列于表l的病毒在植物内扩散的方法，该方法包括下列步骤一在植物细胞中、尤其是甜菜植物的细胞中导入根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列(dna构建体)和/或含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的载体，来获得转化了的植物细胞。其中，在所述植物细胞中能形成双链rna分子的rna分子的表达能降低或阻碍病毒在转化后的植物或植物细胞扩散。病毒扩散的减少或受阻是通过减少、/阻碍病毒(在全部或某种细胞类型中)复制、病毒通过植物的传输来实现的；或者通过仅仅限制病毒对某种组织内的传播(如，在维管束和薄壁组织中和非韧皮细胞中)来实现的。有利的情况是，在用根据本发明的发夹构建体转化的植物根部，测量出病毒扩散受阻或减少到0.2个od4。5值(参见实施例7)或更少。更优选最犬od4q5值为0.1。最优选最大od405值为0.05、0.01或接近0(低于测试阈值的水平)。可替代地，根据本发明的rna分子可以被导入植物细胞，以改变bnywtgb-3移动蛋白的表达，从而诱发tgb-3移动蛋白的ptgs，实现给予植物或植物细胞以对bnyw的抗性或更高耐受性的目的，实现诱导植物或植物细胞极端抗性的目的，或实现阻碍或减少病毒在植物内扩散的目的。根据本发明的方法可以进一步包括从转化了的植物细胞再生转基因植物的步骤。本发明的方法(至少)包括制备合适的构建体和用该构建体转化植物细胞以实现上述效应(见段落)的步骤。优选发现与对该病毒的天然耐受性/抗性源相比(如为本领域技术人员所熟知的抗性源'rizor','holly'或5etomar招/wasubspmfln'ft'ma！accessionwb42)，根据本发明转化的植物被提供了对bnyw的更高水平的抗性。用根据本发明能形成一个发夹结构的基因修饰的tgb-3序列进行转化的植物转化显示出能阻碍和/或明显减少病毒在根部的扩散。有利的情况是，将因此防止病毒到达长距离的运输系统。有利的是，根据本发明进行的植物转化能防止和/或明显降低病毒在树皮组织中的复制。优选本发明的方法能减少病毒容量以保持其在土壤中的感染潜力。根据本发明的病源抗性进一步显示出与天然源表现出的抗性的不同。优选这种病源抗性能和天然抗性机制组合。有利的情况是，不同来源(天然的和病源的)的抗性组合能使得根部抗性多样性的稳-定性进一步增强，同时帮助确保对一种或多种病变(至少一种)的长ffi的抗性。图1显示了根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列(图la和b，seqidno:9)。该序列有一个有义突变p15核苷酸序列(seqidno:10，与野生型相比的修饰用粗下划线标出)和一个反义p15核苷酸序列(粗斜体，seqidno:12)，并用一个有91个碱基对构成的内含子序列(粗下划线，seqidno:ll)所分隔。在图lb中的几个核苷酸以斜体标出(双下划线)，这几个既不属于p15也不属于内含子，但仍然作为克隆技术的残基出现并封闭限制性位点。含有seqidno:9的构建体也被称作hpl5构建体2。表2显示了根据本发明的tgb-3病毒序列(图2a和b，seqidno:13)。该序列有一个有义突变p15核苷酸序列和一个反义p15核苷酸序列(粗斜体)，并以一个有550个碱基对构成的内含子序列(粗下划线，seqidno:14)所分隔。在图2b中的几个核苷酸以斜体标出(双下划线)，这几个既不属于p15也不属于内含子，但仍然作为克隆技术的残基出现并封闭限制性位点。这里的有义和反义序列与图lb中的一致。含有seqidno:13的构建体被称作hpl5构建体3。图3显示了野生型p15序列(seqidno:7和8)。图4是pfgc5941载体的示意图。bnpl5-ala4基因以正向和反向被导入该载体，并被矮牵牛花的査耳酮合酶a基因(chsa)的内含子序列所分散。camv35s启动子camv的启动子35s;ocs3:章鱼碱合酶基因的多聚腺嘌呤信号；mas3:甘露碱合酶基因的多聚腺嘌呤信号；bar:basta除草剂抗性基因；km:卡那霉素抗性基因；rb、lb:t—dna左右边界。图5是ps140和ps142载体的示意图。其中bnpl5-ala4基因以正向和反向被导入该载体，并分别被有550个(图5aps140,构建体3)和91个(图5b，ps142,构建体2)核苷酸的甜菜内含子序列所分散。camv35s启动子camv的启动子35s;nos3':月因脂碱合酶终止子；kan:卡那霉素抗性基因；rb、lb:.t—dna左右边界。图6是由构建体1(有矮牵牛化内含子的hpl5)获得的ptgs数据的统计分析。每个柱状图代表了个数(y轴)和每片感染的叶子的病变尺寸(一y轴)。/:没有病变；v:病毒stl234;tp:缓冲液；hp:发夹。在y轴1、10、20、30、100。在—y轴，从左至!j右v;v ma缓冲液；v hpgf;v hpl5。图7是由构建体1、2、3分别获得的ptgs数据的统计分析。/:没有病变；v:病毒stl234;tp:缓冲液；—hp:发夹；hpl5:构建体1;ps140:构建体3;ps142:构建体2。在y轴1、10、20、30、40。在一y轴4。在x轴，从左到右v;v ma缓冲液；v hpgf;v hpl5(构建体l);v ps140(构建体3);v ps142(构建体2)。图8强调突出了seqidno:10和在seqidno:7中列出的野生型p15bnyw序列之间的差别。图9给出了elisa测试的结果，用于测试在bnyw感染的土壤中生长的植物根部病毒颗粒的存在。biotestrz2007-001a。thpr:peg(聚乙二醇)转化。图10给出了elisa测试的结果，用于测试在bnyw感染的土壤中生长的植物根部病毒颗粒的存在。biotestrz2007-002a。thpr:peg(聚乙二醇)转化。aghp:农杆菌转化。图12代表农杆菌介导的转化实验中使用的ps143载体。具体实施例方式在根据本发明的一个优选实施方式中，一个分子内含有有义和反义修饰过的tgb-3核苷酸序列，这意味着在单个rna分子中含有有义突变的tgb-3rna片段和反义突变的tgb-3rna片段。有利地，根据本发明的rna分子能够折叠，从而其内含有的所述rna片段形成双链发夹rna分子。这里使用的术语"发夹rna"，是指任何自我退火(self-annealing)的双链rna分子。在最简单的代表形式中，一个发夹rna含有双链主干，该主干由退火rna链构成，主干由一个单链rna环连接，并被称为"锅柄rna"。但是，术语"发夹rna"也倾向于包括更多复杂的二级rna结构(该结构中含有自退火的双链rna序列)，但是也包括内部凸起和环。采用的这种特异性二级结构将由rna分子的自由能决定，并可通过合适的软件比如foldrna(23)来预测不同情况下产生的二级结构。可替代地，有义和反义的修饰过的tgb-3核苷酸序列可以在两种分离的分子或核苷酸序列内/上出现。这些分子或核苷酸序列能被同步地和/或连续地提供给一个植物细胞，优选在提供第一和第二核苷酸序列之间花费的时间较短，这样做的目的是，当转录时，双链rna分子能通过碱基配对而形成。优选根据本发明的dna序列能稳定地整令到正用根据本发明的基因修饰的tgb-3病毒序列和/或含有该基因修饰的tgb-3病毒序列的载体转化的植物细胞的基因组中。可替代地，含有根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列的转基因可以被定位于游离体或自复制的载体上。自复制载体的例子有病毒，尤其是双生病毒。根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列也可以被直接转化进入质体基因组。文献中，美国专利第5,451,513、5,545,817和5,545,818号，pct申请wo95/16783以及mcbride等人(proc.natl.acad.sci.usa91:7301-7305，1994)，详细描述了质体转化技术，在此将其并入本文以引为参考。叶绿体转化的基本技术包括例如通过使用基因枪法或原生质体转化(例如氯化钙或peg介导的的转化)，在合适的靶标组织中导入克隆的质体dna区域，该区域侧翼为可选择的标记物和相连的所研究的核苷酸序列。l一1.5kb的侧翼区域有利于与质体基因组进行同源性重组，从而允许进行原质体系(叶绿体基因组)的特异性区域的置换或修饰。用于植物的转化或再生的方法是众所周知的。例如，ti质体载体已被用于传递外源dna、以及指导dna摄取，脂质体，电穿孔，微注射和微导弹技术。此外农杆菌属的细菌可以用于转化植物细胞。—系列转化载体可用于植物转化，它们为本领域普通的技术人员所熟知。同时，根据本发明的dna或核苷酸构建体(含有基因修饰过的tgb-3病毒序列)能用于和任何一种这样的载体连接。载体的选择取决于优选的转化技术。转化中通常使用的选择性标记包括";^//基因，它给予对卡那霉素和相关抗生素的抗性(messing&vierra.gene19:259-268(1982);bevan等人，nature'304:184-187(1983));&『基因，能给予对除草剂草丁膦的抗性(white等人，nucl.acidsres18:1062(1990);spencer等人.theor.appl.genet79:625-631(1990));zzp/z基因，能给予对抗生素潮霉素的抗性(blochinger&diggelmann，mo1cellbiol4:2929-2931);j/斤基因，能给予对甲安非他命的抗性(bourouis等人，emboj.2(7):1099-1104(1983));ers尸s基因，能给予对草甘膦的抗性(美国专利no.4,940,935和5,188,642));aac0:)基因，能编码庆大霉素的抗性(专利号wo94/01560);或者本领域技术人员所熟知的；^和!7m'基因(messing&vierra.gene19:259-268(1982);bevan等人，nature'304:184-187(1983))。许多载体可用于借助根瘤农杆菌的植物细胞的转化或基因修饰。这些载体通常都携带至少一个t-dna边界序列并包括诸如pbin19(bevan,nucl.acidsres.(1984))的载体。典型的适用于农杆菌介导转化的载体包括二元载体pcib200和pcib2001，以及二元载体pcib10和潮霉素选择性衍生物(例如参见美国专利5,639,949)。与其它技术相比，使用根瘤农杆菌来转化植物技术的优势是有低复制数和最小重排(-率)。不使用根瘤农杆菌的转化包括了在所选用的载体中对于t-dna序列的要求，因此，除了上述含t-dna序列的载体以外，也使用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过直接的基因转移的转化、粒子轰击、原生质体导入(例如peg法和电穿孔法)、花粉介导的转化，植物rna病毒介导的转化、微注射、创伤转化和/或酶降解的胚胎组织和/或不成熟的胚、脂质体介导的转化等。载体的选择很大程度上依赖于被转化的物种的优选种类和使用的选择性标记。典型的适用于非农杆菌转化的载体包括pcib3064、psog19和psog35(参见，例如并入本文.以引为参考的美国专利5,639,949)。表达系统的组分被修饰，例如用来增加有义和反义rna片段的表达。这里使用的术语"表达盒"是指一个dna序列，该序列能在合适的寄主细胞中f旨导特定核苷酸序列的表达，并含有可操控地连接到所研究的核苷酸序列(该序列能可操控地连接到终止信号上)的启动子。含有所研究核苷酸序列的表达盒，在本例中为根据本发明的基因修饰的tgb-3病毒序列，可以是嵌合型。这意味着它的组成的至少一个相对于其它组成的至少一个是异源的。这种表达盒也可以是自然存在的，但是已经以对异源表达有用的重组体形式而获得的。但是，典型地，表达盒通常相对寄主细胞是异源的，sp，表达盒的特定dna序列不会在寄主细胞中自然发生，而必须通过转化活动被导入寄主细胞或寄主细胞前体中。表达盒同样含有其它要求的或筛选的序列，用于转基因的表达(并可能是翻译)。这种序列包括如，但不局限于，转录终止子、增强表达的外来序列如内含子、活性序列和用于将基因产物靶向特定细胞器官和细胞间隔的序列。这些表达盒易于转移到上述植物转化载体上。以下描述典型的表达盒的各种组成。"调控元件"指涉及实现核苷酸序列表达的序列。调控元件通常含有可操作地连接到所研究核苷酸序列的启动子和终止信号。它们同样也包含要求能正确翻译所研究核苷酸序列的序列。在本例中，基因修饰的tgb-3病毒序列的有义核苷酸序列的翻译能较好地通过假设的翻译起始密码子和/或终止密码子(见下文)的修饰被抑制。核苷酸序列在表达盒中的表达可以处于组成型启动子的控制下，或受到诱导的启动子的控制，该诱导的启动子仅在寄主细胞暴露于某种'特定外在刺激时才会启动转录。在多细胞生物中，例如植物，启动子也可能对特定器官或组织或某一发育阶段具有特异性。可操控ftk连接到根据本发明的有义和/或反义核苷酸序列的启动子可以是被转化的细胞的天然启动子。可替换地，启动子可以是异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调控启动子；组成型启动子或可诱导的启动子。合适的启动子为本领域熟练的技术人员所熟知。在本发明中，优选在根组织中有活性或主要在其中有活性的异源性大的启动子。各种转录终止子可用于表达盒。这些终止子负责终止转基因以外的转录和正确的多聚腺嘌呤化。合适的转录终止子是那些已知在植物内起作用的终止子，包括camv35s终止子、tm/终止子、蛋白石合成酶终止子和pearbcse9终止子等。大量序列被证实能增强在转录单元内的基因表达，以及这些序列能被用于连接本发明的基因修饰的tgb-3序列来增加它们在转基因植物中的表达。例如，各种内含子序列如玉米^/a/基因的内含子已经显示出能增强表达。此外，已知许多来自病毒的不被翻译的引导序列同样能增强表达。优选至少一种"植物表达的"启动子可操控地被连接到有义和/或反义核苷酸序列上(见上文)。优选根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列中有义和反义核苷酸序列受到同样的启动子的控制。正如这里使用的，术语"植物表达的启动子"是指这样一种dna序列，该序列能控制(启动)植物细胞中的转录。这包括植物来源的任一启动子，但是也包括非植物来源的任一启动子，后者能指导植物细胞或组织的转录，即，某些病毒或细菌来源的启动子如camv35s、地下苜蓿病毒启动子4或7、或者t-dna基因启动子。下列描述的一些选项涉及启动子选择和排列，其取决于根据本发明的基因修饰过的有义和反义tgb-3核苷酸序列是否被包含在单一的核苷酸序列或dna链内。根据本发明的基因修饰过的tgb-3病毒序列中的有义和反义核苷酸序列优选受控于一个单一的启动子，特别是当两者都包含在单一核苷酸序列中时。但是，它们也可以分别受控于各个不同的启动子(例如当提供两种不同的序列时)。最理想的是，有义dna序列能可操作地连接到第一启动子上，反义则可操作地连接到第二启动子上。第一和第二启动子可能是相同的启动子或者是不同的启动子。启动子可以是分歧的或双向的启动子，能在启动子各侧启动任意一端的dna序列的转录。当有义rna片段和反义rna片段被包含在或被表达为两个rna分子(两个独立的rna链)，例如该有义dna序列和反义dna序列可以被可操作地连接到双向的启动子上。可替代的方案是，有义dna序列可以被可操控地连接到第一启动子上而反义dna序列被可操控地连接到第二启动子。第一和第二启动子可以是相同的启动子或者是不同的启动子。反义序列可以是上述dna分子的有义修饰过的tgb-3序列的互补dna链(在本例中dna分子有两条链)。在这种情况下，有可能使得一个启动子可操控地连接到上述有义或所述反义dna序列上、在上述启动子和上述有义或反义dna序列之间的第一位点特异性重组位点、以及在上述有义或上述反义dna序列的3'-端的第二位点特异性重组位点，其中，当位点特异性重组酶存在时，上述第一和第二位点特异性重组位点能够使得上述第一或第二dna序列在上述第一第二位点特异性重组位点之间发生颠倒。作为所述颠倒的结果，上述第一启动子能表达上述反义dna序列(或有义序列，这取决与哪个dna最早连接在启动子上)。优选植物细胞还含有能识别上述位点特异性重组位点的位点特异性重组酶。优选根据本发明的dna构建体或序列在编码有义和反义rna片段的dna序列之间还含有离开有义和反义修饰过的tgb-3病毒核苷酸序列的连接物或间隔物核苷酸序列。如果没有间隔序列，rna分子将仍能形成双链rna;尤其是，如果有义和反义核苷酸序列大于10个核苷酸时，部分有义和/或反义核苷酸序列将被用于形成环，使得在具有有义和反义核苷酸序列之间的区域碱基配对且形成双链rna。人们期望不存在与间隔区域相关的对长度的限制或序列的要求，只要这些参数不干预带有有义和反义核苷酸序列的rna区域形成双链rna的能力。在优选的具体实施方式中，间隔区域的长度变化为5—1000个碱基。在一个优选的具体实施方式中，由有义和反义区域形成的发夹rna以及合适的间隔区域是一个人工发夹rna。"人工发夹rna"或者"人造茎环rna结构"是指这种发夹rna不是在自然界中天然存在的。优选的间隔物或连接物核酸序列是一个内含子序列，优选是能沿正向增强耙标核酸(在本文中指bnywp15或bnywrna2)表达的减少效率。效率的增强可以用在植物中沉默发生频率的增加来表示，或通过bnywp15或rna2表达的减少水平的提高来表示。优选内含子核苷酸序列来自植物基因，如假定的核糖体rna基因或高度转录的植物基因。这些内含子可以从任一植物基因中获得，但是更优选来自双子叶植物基因，例如来自矮牵牛花基因，但最优选来自甜菜基因。也有可能仅仅使用这些(植物)内含子的一部分，例如至少含有拼接信号(见下文)的边缘。所有这些内含子和其一部分在本发明中被称为"内含子片段"或"内含子序列"。这种内含子核酸序列的适宜长度5—1000个碱基，更优选50—600个碱基，更优选90-550个碱基。优选的内含子序列含有seqidno:ll或14，更优选由seqidno:11或14组成。内含子加工取决于合适的5'-端和3，-端拼接结合的序列，并且这些序列至少应是内含子序列的保留序列。用于连接的共同序列来自动植物mrna,但是仅仅几个核苷酸被认为是不变的。人们发现在下文中描述的甜菜内含子(seqidno:11和14)高度适合，但是较短的序列表现出比较长序列略高的性能。含有能够形成例如发夹结构的有义和反义核苷酸序列的、通过嵌合基因转录生成的rna分子能够被直接导入植物细胞。这种rna分子例如可以通过下列步骤制得一克隆能够被转录成rna分子的dna区域，其中该rna分子带有一种核苷酸序列，该核苷酸序列含有至少io个连续的核苷酸并与所研究核酸的核苷酸序列同源性为75—100%的有义核苷酸序列；以及反义核苷酸序列，该反义核苷酸序列包括至少10个连续核苷酸、优选为约15个、20个、更优选为至少约50个核苷酸、更优选为至少约100个、更优选为至少约150个、更优选为至少约200个、25q个、300个核苷酸、特别优选为至少约350个或约400个核苷酸，并且和至少有约10个连续核苷酸的有义序列的互补序列有约75-100%的同源性。借此rna能通过在带有有义和反义核苷酸序列的区域之间碱基配对而形成双链rna，导致例如发夹rna结构，这个过程在一种启动子的控制下实现，该启动子适合被依赖dna的rna多聚酶在体外转录反应中识别，但不受限于t7—多聚酶特异性启动子；一通过添加其它合适的dna依赖性rna多聚酶、'以及生成rna分子必要的试剂实现体外转录反应；—分离rna分子。体外转录方法以及其它体外生成rna的方法是为人们熟知的方法，同时可使用商品试剂盒。将rna直接导入植物细胞的方法也为本领域熟练技术人员所熟知，包括但不受限于电穿孔、微注射和诸如此类的方法。本发明还进一步提供一个有bnyw抗性或耐受性的植物，在其至少一部分细胞、优选几乎所有细胞的基因组中，含有根据本发明的基因修饰的tgb-3病毒序列和/或含有根据本发明的基因修饰的tgb-3病毒序列的载体，当这些物质被转录时生成能引发ptgs机制从而破坏bnywrna2的rna分子。本发明还提供有bnyw玩性或耐受性的植物，在其部分细胞、优选几乎所有细胞的基因组中，含有根据本发明的rna分子以实现上述效应。"植物"是指任一植物或植物在任一发育阶段的部分结构。这里包括插枝、细胞或组织培养物和种子。在本发明中，术语"植物组织"包括但不受限于整个植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈伤组织和由植物细胞形成结构性和/或功能性单位的细胞组。后者也被称为无性繁殖结构，意味这它们能再生成完整植株。获得的转化植物、植物组织和植物材料能被用于传统的种植和植物繁育或再生方案，从而获得更多由同样特性(病毒抗性或耐受性)的转化植物，或将根据本发明的dna构建体导入其它各种相同或相关的植物中。此处"病毒抗性或耐受性"是指与敏感的细胞或植物相比，抗性或耐受性细胞或植物不易感染一种或几种病毒、或者容易感染的可能性减少。在本案中，显然是针对对bnyw的抗性尤其是极端抗性而言。抗性或耐受性，举例而言，是指病毒感染的常见症状如bnyw感染不出现或不明显；或者是病毒在细胞内的积累或复制受到抑制或减少；或者是病毒的移动，如在细胞间的移动受阻或减少。本发明涉及调控方法，最理想的是改变且能明显降低或乃至完全抑制病毒(bnyw)p15rna2基因在细胞、尤其是植物细胞或植物中的表达。ptgs将抑制位于rna2上的每个基因的表达。人们发现常用的方法缺乏预见性。本方法部分解决了该问题，并提供了可复制使用的更有效的植物体内病毒抗性调控性。将通过参考下列实施例来进一步描述本发明。提供这些实例的目的仅仅是例证而非限制，除非另有说明。在此验证的bnyw和bnywp15的原则同样适用于列于表1的病毒。实施例实例l:bnyw抗性转基因植物的表征建立三种相互独立的转基因甜菜块根系，用于表达蛋白bnp15-ala4(由seqidno:3编码)。其中两个系被证实对bnyw有抗性。p15蛋白被证实在易感系上的表达显著高于在抗性系上的表达。仅仅在bnyw抗性系上测得sirna(表2)。-因此ptgs引发了bnyw的抗性。为进一步验证该假设，用病毒接种体感染(stras1234提供了rna1、rna2、rna3和rna4)每个体系的叶子。感染处理后的抗性植物的叶子极少乃至完全没有病变，相反易感植物的叶子上出现了大量病变。在抗性植物系中测得p15-特异性性sirna分子，而在任何易感植物中均未测得。未能测得p15基因序列的修饰或转录终止子序列的修饰。实施例2:p15发夹构建体为了研究ptgs诱发性的(突变)p15序列的功能性，构建二元农杆菌载体，使之沿正向和反向含有基因修饰过的p15基因(如(修饰过的)seqidno:3)，并被矮牵牛花内含子或甜菜内含子所分散。下面给出了三种hpl5构建体(见图4、5)的相关结果。在构建体l中的内含子序列来自矮牵牛花(见图4)，而构建体2和3的内含子序列来自甜菜。构建体2和3仅在内含子长度上有区别ps140载体上使用的内含子有550个核苷酸，而ps142载体仅使用91个核苷酸的内含子(分别见图5a、b)。创建根据本发明的dna构建体以及在根瘤农杆菌(如(卸甲)gv3101品系)中克隆这些构建体的方法和技术是本领域技术人员所熟知的。通过包括在终端特异性限制位点的pcr产生p15有义和反义片段和内含子。和载体主干混合，基于片段终端的这些特异性位点的兼容性，仅片段的重组/插入是有可能的。片段1右端的限制位点和片段2左端的限制位点是一样的。对于上述每个构建体，创建了包含gfp序列(前400个核苷)(取代基因修饰过的p15.序列)的发夹同源体，其被用作对照组(发夹对照物，被称为hpgf)。ma缓冲液(10mmmgcl2，200pm乙酰丁香酮)作为处理对照组。实例3:实验方案将番杏(7wrago"z'fl、大果甜菜(seto和甜菜块根(5etovw/ga&)(保持有bnyw人工叶接种的植物)的叶片材料农杆菌浸润(agro-infiltrated)，随后用bnyw感染(stras1234或stras12(提供rna1和rna2))。下文列出实验方案，上文列出了构建体。携带发夹构建体的根癌农杆菌在28。c下过夜培养。通过离心(15分钟，5000g)获得细胞团，并用含乙酰丁香酮(200nm)的10mmmgcl2缓冲液再悬浮，并将od600nm(600nm处吸光度)调节为1。在浸润前，细胞悬浊液在室温下静置3小时。在4叶期，通过向幼苗叶片(如大果甜菜、甜菜块根、番杏、本生烟草(mcori训a、昆诺藜(cae"o;w&ww《wf"oo)的幼苗叶片)注射农杆菌溶液而进行农杆菌浸润法(agro-infiltration)。用2毫升的去针注射器挤压针刺后的叶片的上表面。除了子叶，每片叶片都进行了浸润。在农杆菌浸润四天后，通过机械接种使得处理的叶片被感染。机械接种的方式是将叶片表面事先用金刚砂打磨叶片，然后用10—25微升的接种溶液(l微克病毒rna(stras1234或stras12)，0.04%硅藻土、磷酸钾缓冲液50mm，ph7.5)处理。大果甜菜10ul接种溶液/叶片甜菜块根25!il接种溶液/叶片番杏25ul接种溶液/叶片本生烟草20yl接种溶液/叶片来自大果甜菜、甜菜块根、番杏和本生烟草的叶片都经过处理(参见上述)，在接种后10_13天后观察丛根病症状。实施例4:hpl5mrna表达对bnyw复制的影响a:用矮牵牛花内含子构建。下列例子描述了在甜菜中使用根据本发明的hpl5构建体的一些结果。在图6中总结了构建体1(图4)的结果。在用表达hpgf构建体的悬液以农杆菌接种浸润方法处理的甜菜叶片、以及用ma缓冲液浸润的叶片上观察到萎黄色病变。这些病变与那些没有进行浸润和接种的叶片上观察到的情况相似。在用表达hpl5构建体(构建体1)的悬液浸润的并用农杆菌接种的叶片上没有出现的病变。即使有，这些病变太小并认为是相当于那些没有充分浸润的叶片区。这些初步结构指出，hpl5构建体适合在甜菜块根中诱发ptgs，从而诱导出bnyw抗性。b:用甜菜内含子构建。重复上述实验，并使用更大量的甜菜植物以及使用构建体2和3，两者的差别仅在内含子长度上。用ma缓冲液浸润或用表达hpgf同源体的根癌农杆菌悬液浸润的叶片上发现大量的病变，病变的直径在3—4毫米。而使用hpl5(构建体2、3)借助农杆菌浸润接种法处理的植物叶片上完全没有病变，或非常少的病变，其最大直径为l毫米。图7中的结果显示构建体2(91个核苷酸的内含子)似乎对bnyw有更高的抗性。c:对p型分离种感染的防御。在法国pithiviers附近发现的p型bnyw含有五个正义rna。这一分离物使得甜菜高致病。人们认为p26蛋白的表达使得丛根病症状更加恶化(26)。使用p型bnyw作为病毒接种体重复在b部分中描述的结果。用表达hpl5的根癌农杆菌悬液借助农杆菌浸润接种法处理的叶片上没有病变。以发夹构建体为介导诱导ptgs被认为是一种获得对病毒感染的抗性的好的来源，尤其是对bnyw。即使是对对于最具攻击性的分离物，植物也能获得抗性。假设(植物体内)hpl5构建体的表达导致dsrna的形成，dsrna被识别并通过dicer酶酶切为数段21—23个核苷酸的片段(sirna))。p15-特异性sirna将与risc(rna诱导的沉默复合体)构成一个复合体，其将转而靶向rna同源体、rna2、和某些bnyw亚基因组rna种类，并诱导后者的降解。因此，病毒将不再能在细胞间移动。实施例5:根据本发明的hp15构建体阻滞子叶细胞内的病毒复制在敏感的双染色体甜菜繁育系4d6834('4d')、天然抗性来源(holly-1-4accession('ho')和betovm/gan;sssp.man'rimawb42('bm'))、以及根据本发明转化的甜菜植物内，研究bnyw(a、b、p型)的出现和传播。在叶脉组织中，在韧皮筛和软组织中观察到病毒的外壳蛋白。这一发现表明(病毒)通过气孔进行长距离的移动。可在本发明的文献dcmcet,2006,博士论文第五章中查到具体的病毒感染和免疫检测的实验方案。天然抗性源如"ho"证明只有部分抗性，例如当病毒滴度较高时，抗性消失。根据本发明的抗性植物和'bm'基因型显示出对病毒扩散有同样的限制作用。但是，两者之间最大的差别在于，'bm'仍会使病毒在子叶细胞中复制。所以，在p.万etoe(真菌载体)中仍可获得病毒颗粒，说明在表皮中感染更优先。即使不如在敏感种中扩张得快，仍有可能进行病毒复制和保留之后的感染潜力，并保持感染数量的形成。根据本发明的抗性基因型的优势在于能防止表皮中病毒的复制。与"bm"相比，它将减少在土壤中维持感染潜力的病毒容量。实施例6:总结我们从上述实施例中得到结论:根据本发明的病原体衍生的hpl5抗性对bnyw有高效的抗性，即使是对更具攻击性的bnyw分离种。本发明的hpl5构建体成功地诱导了病原体衍生的植物抗性。所有测定的hpl5构建体都能通过ptgs降解rna2.。hpgf同源物从不引发ptgs机制(视觉观察)。bnywrna2的降解也从未被观察到(northernblot分析)。上述实施例涉及含有完整长度hpl5序列的hpl5构建体。但是，当pl5编码序列的片段(或部分)被按正向和反向克隆到合适的载体中时，同样也能获得阳性结果。例如，sirna(小干扰rna)同样靶向含有p15bnyw基因三分之二的构建体。上述结果显示，含有根据本发明的基因修饰过的bnywtgb-3序列或其片段或部分的p15发夹构建体高度适合于引发ptgs，这会形成bnyw抗性植物。优选依据下列标准选择转化植物，以使成功率最大化。筛选出含有单拷贝构造的转化株，并且分析植物对bnyw感染的抗性。能生成大量小rna的植物显示出非常高的和强有力的抗性水平。在ep1174513中描述的原理的农杆菌转化和/或植物转化是优选的转化技术，因为这些技术将使重排最小化。实施例7:在已感染的土壤中生长的转基因植物的elisa筛选构建体载体ps138(图11)被用于peg(聚二乙醇)直接基因转化；载体ps143(图12)用于农杆菌介导转化。两种质粒都含有p15-4(bnp15-ala4)和较短的内含子序列(91个碱基)的发夹结构，如图1a、b所示。在这些结构中，p15-4有义序列对应seqidno:3，pi5-4反义序列对应seqidno:12，并且内含子对应seqidno:11。peg转化依据在wo95/10178中描述的方法，在甜菜保卫细胞原生质体上实施peg转化。在0.2nm甲氧咪草烟(imazamox)上筛选原生质体和愈伤组织；在20nm甲氧咪草烟上筛选芽和植物。用thprxxx标记peg转化的幼苗。农杆菌介导的转化:农杆菌转化的起始物质包括出现在固体pgib培养基的藻酸盐培养平板上的、来自甜菜保卫细胞原生质体的愈伤组织(如wo95/10178的描述)。在补充有25mg/l链霉素和2mg/l四环素的lb培养基中过夜培养农杆菌菌株(hat8000)。在转化之前，将细菌培养物在4000转每分钟的速度下离心15分钟，将小球再悬浮于补充有100um乙酰丁香酮的pgo培养基，从而获得od55()1.0的接种浓度。至于接种，将细菌悬液和含有已经出现保卫细胞衍生的愈伤组织的藻酸盐一起浇铸在培养皿内。在10分钟后，移出藻酸盐，在将其置于共培养的培养基上(pgib培养基，补充有100ym乙酰丁香酮和0.9%seaplaqueagarose,ph5.8)之前用滤纸干燥。将培养物在27°(3黑暗环境中孵化1一2天，此后单个的愈伤组织被转移到选择性培养基中(补充有125mg/l头孢噻肟、0.2nm甲氧咪草烟和0.8。/。琼脂糖,ph5.8.)。两周后，长出的愈伤组织被转移到pbn培养基中(补充有0.2nm甲氧咪草烟)，并在25°c光照下培养。在20nm甲氧咪草烟上筛选出现的芽和植物。用aghpxxx标记农杆菌转化的幼苗。elisa筛选对于elisa筛选，使用含有一个或两个拷贝发夹构造的转化株。体外幼苗被转移到根部培养基。在6—8周后，拥有发育'较好的根系统的体外有根的转化株被转移到土壤/沙混合物中，该混合物内大量滋生着含有bnyw病原p型的、从法国pithiviers地区收集的甜菜多粘菌(尸ofymj;xa6etoe)。在18—19。c和70%相对湿度下培育四周，根部的土壤和沙被冲洗干净，根部下端部分被用于进行elisa测试。用滤纸干燥根的切片，称重并被转移到微试管中，并在-60°c下冷冻过夜，此后在2—3天内冻干样品。在冻干之后，样品被碾碎(2xl分钟，30rpm/s)。在各个试管中加入相应数量的萃取缓冲液。振荡试管直到粉末再悬浮，以3000转每分钟的速度离心10分钟。在分析中使用150nl的上层清液。每个幼苗的根部病毒含量通过三联抗体elisa法(atripleantibodysandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay，tas-elisa)分析，使用的是购自neogen(www.neogen.com)的抗病毒外壳蛋白的抗体。抗性植物分离值设置为0.2的004()5值。结果elisa值越低，在分析的植物根部出现的病毒数量就越少。两种生物测试(rz2007-001a和rz2007-002a)的结果总结在图9和图10中。下列甜菜植物作为阳性和阴性对照物4d6834,敏感对照物；dki8，从商品繁育材料中获得的抗性对照物；tmoc1867和mox63msfl，用pl5-ala4构建体转化的植物(有义构造，非发夹构造)。在m0x63msf1植物中，测得小rna片段。在这些植物中，在基因构建体本身没有被引发的情况下产生了ptgs机制，很可能起因于插入物的重排。这一现象可能解释了在这些植物中观察到的抗性高水平。总体而言，用根据本发明的p15发夹构建体转化的29个系中，有20个系证实对丛根病有抗性。只有下列系是敏感系thpr82,thpr90,aghp150,aghp155,thpr12,thpr15,thpr53,thpr239和thpr270。上述数据再次使我们确信，根据本发明的病原体衍生的hpl5抗性确实有较高的效率，即使是对高攻击性的bnyw分离种。例如，在生物测试rz2007-002a中，下列转化植物系有高度的免疫力thpr26，thpr118，thpr222和thpr289。优选有高水平免疫力的植物在od4。5的值小于0.05，更优选小于0.01或接近0。参考文献1.tamadat.&babat.,annalsofthephytopathoiogicaisocietyofjapan39,pp.325-332(1973)2.kuszalam.&putzc.,armajsofphytopathology9,pp.435-446(1977)3.keskinb.,archivfiirmicrobiology49,pp.348-374(1964)4.asherm.j.c.,rhizomaniainrhesugarjbeetcrop,ed.d.a.cookeandr.k.scott,chapman&hall,london,pp.312-338(1993)5.richard-molardm.,幼izojmaniein'工nstitutfranpaisdelajbetteraveindustriel2e.compte—randu'destravauxeitectu^sen1994,itb,parispp.225-229(1995).6.powella.p.etal.,science232,pp.738-743(1986)7.fritchenj.h.&beachyr.n.,arm._rev..mcroi)iojl47,'pp.739-763(1993)8.wilsont.m.a.,proc.natl.acad.sci.pp.3134-3141(1993)9.gonsalvesd.&slightomj丄,seminarsinvirology4,pp.397-405(1993)10.d'halluink.etal.,biotechncaogy10,pp.309-314(1992)11.kallerhofj.etal.,plantcellreports9,pp.224-228(1990)12.ehlersu.etal.,theoreticalandappliedgenetic81,pp.777-782(1991)13.krausj.etal.,fieldperformanceoftransgenicsugarbeetplantsexpresingbnyvvcoatproteinplants,fourthinternationalcongressofplantmolecularbiology,int.soc.forplantmolecularbiology,amsterdam(1994)14.maisse.etal.,proceedingsofthethirdinternationalsymposiumonthebiosafetyresultsoffieldtestisofgeneticallymodifiedplantsandmicroorganisms,monterey.,pp.129-139(1994)15.gilmeretal.,virology189,pp.40-47(1992)16.bleykasten-grosshansetal.,mol.plant—microbeinteract.10,pp.240-246(1997)17.bouzoubaaetal.,j.gen.virol.67,pp.1689-1700(1986)18.richards&tamada,annu.revendication.phytopathol.30,pp.291-313(1992)19.bouzoubaaetal.,j.gen.virol.68,,pp.615-626(1987)20.herzogetal.,j.gen.virol.18,pp..3147-3155(1994)21.scottetal.,j.gen.virol.75,pp.3561-3568(1994)22.koonin&dolja,crit.revendication..biochem.andmol.biol.28,pp.375-430(1993)23.zukerandstiegler,nucl.acidsres.:9,pp.133-148(1981)24.higgins,encyclopediaoflifesciences,pp.1-10(2001)25.raskaetal.,biologyofthecell96,pp.579-594(2004)26.tamadaetal.,proceedingofthe3rdsymposiumoftheinternationalworkinggrouponplantviruseswithfungalvectors,americansocietyofsugarbeettechnologists,denver:p.49(1996)表ltableseeoriginaldocumentpage37
表2:在转基因植物中检测p15.特异性sirna的p15蛋白表达。r:对bnyw有抗性的植物系;.s:对bnyw敏感的植物系； :弱检测； :强检测；一未测出。
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权利要求1.一种基因修饰过的tgb-3病毒序列，其包括选自下组的序列(a)一种核苷酸序列，其含有seqidno3和seqidno3的反义序列；(b)一种核苷酸序列，其含有seqidno3片段和所述seqidno3片段的反义序列；(c)一种核苷酸序列，其含有基因修饰过的seqidno3和所述修饰过的seqidno3的反义序列；以及(d)一种核苷酸序列，其含有基因修饰过的seqidno3片段和所述基因修饰过的seqidno3片段的反义序列；其中，当在细胞中转录时，所述基因修饰过的tgb-3病毒序列能形成双链自补的rna分子。2.如权利要求1所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述有义和反义序列包含在一种核酸序列内。3.如权利要求1或2所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，还包含分散于有义和反义序列之间的内含子片段，其中，当在细胞中被转录时，所述tgb-3病毒序列能形成发夹rna分子。4.如权利要求3所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述内含子片段衍生自植物基因。5.如权利要求4所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述植物基因是甜菜基因。6.如权利要求3所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述内含子片段是高度转录基因的内含子片段。7.如权利要求6所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述高度转录的基因是核糖体rna基因。8.如权利要求6所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，所述高度转录的基因是高度转录的甜菜基因。9.如前述权利要求中任一项所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，在所述修饰过的seqidno:3序列中，所述seqidno:3序列的翻译启始密码子和/或终止密码子被修饰，以抑制翻译。10.如前述权利要求中任一项所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，含有seqidno:9或seqidno:13。11.如前述权利要求中任一项所述的tgb-3病毒序列，其特征在于，其由seqidno:9或seqidno:13组成。12.—种载体，其含有如前述权利要求中任一项所述的基因修饰过的tgb-3病毒序列。13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，其可操控地连接到一个或多个在植物细胞中有活性的调控序列上。14.一种通过如权利要求12或13所述的载体表达的双链自补rna分子。15.—种在植物或植物细胞中导入病毒抗性的方法，包括制备含有如前述权利要求中任一项所述的基因修饰过的tgb-3病毒序列的核酸构建体，该构建体可操控地连接到一个或多个在植物细胞中有活性的调控序列上，以及用所述核酸构建体转化植物细胞，由此在植物或植物细胞中导入病毒抗性。16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述病毒选自下组苹果茎痘病毒，蓝莓枯黄病毒，马铃薯病毒m，白三叶草花叶病毒，兰花叶病毒，大麦条斑花叶病毒，马铃薯帚顶病毒，花生丛簇病毒，甜菜土传病毒和甜菜坏死黄脉病毒病毒bnyw。17.—种在植物或植物细胞中诱发全部rna2、以及尤其是tgb-3移动蛋白转录后基因沉默机制的方法，包括下述步骤制备含有如前述权利要求中任一项所述的基因修饰过的tgb-3病毒序列的核酸构建体，该构建体可操控地连接到一个或多个在植物细胞中有活性的调控序列上，以及用该核酸构建体转化植物细胞，由此在所述植物细胞中的表达能形成双链自补的rna分子，并引发ptgs机制。18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述植物细胞是气孔细胞。19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述植物选自由苹果、蓝莓、马铃薯、苜蓿、兰花、大麦、花生和甜菜所构成的组。20.如权利要求17—19中任一项所述的的方法，其特征在于，还包括由转化过的植物细胞再生转基因植物。21.如权利要求17—20中任一项所述的的方法，其特征在于，所述调控序列含有在植物中有活性的启动子序列或终止子序列。22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述启动子序列是组成型序列或外来的启动子序列。23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述启动子序列选自由35s花椰菜花叶病毒启动子和拟南芥多聚泛素启动子所构成的组。24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述启动子序列是在植物根组织中有活性的启动子序列。25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述启动子序列是在甜菜植物的根组织中有活性的启动子序列。26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述在甜菜植物根组织中有活性的启动子是来自尸era5pom'aa7wferao"//的血红蛋白素基因的par启动子。27.—种具有病毒抗性的转基因植物或转基因植物细胞，其含有包含如权利要求l一ll中任一项所述的基因修饰过的tgb-3病毒序列的核酸构建体，所述构建体可操控地连接到一个或多个在植物细胞中有活性的调控序列上，或者含有如权利要求12—13中任一项所述的载体，或者含有如权利要求14所述的双链自补rna分子。28.如权利要求27所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，所述病毒选自下组苹果茎痘病毒，蓝莓枯黄病毒，马铃薯病毒m，白三叶草花叶病毒，兰花叶病毒，大麦条斑花叶病毒，马铃薯帚顶病毒，花生丛簇病毒，甜菜土传病毒和甜菜坏死黄脉病毒病毒bnyw。29.如权利要求27或28所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，其选自由苹果、蓝莓、马铃薯、苜蓿、兰花、大麦、花生和甜菜所构成的组。30.如权利要求27—29中任一项所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，所述调控序列包含在植物中有活性的启动子序列或终止子序列。31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述启动子在植物根组织中有活性。32.如权利要求30或31所述的转基因植物，其特征在于，所述启动子是来自pera^om'aamfersom7的血红蛋白素基因的par启动子。33.如权利要求27—32中任一项所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，所述转基因植物是甜菜植物，而所述转基因植物细胞是甜菜细胞。34.如权利要求27—33中任一项所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，所述调控序列含有启动子序列，所述启动子序列是组成型或外来的植物性的启动子序列。35.如权利要求27—34中任一项所述的转基因植物或转基因植物细胞，其特征在于，所述启动子选自由35s花椰菜花叶病毒启动子和拟南芥多聚泛素启动子所构成的组。36.—种衍生自如权利要求27—35中任一项所述的转基因细胞的转基因植物组织，其选自由果实、茎、根、块茎和种子所构成的组。37.—种从如权利要求27—35中任一项所述的转基因细胞获得的转基因繁殖结构，其选自由愈伤组织、芽或胚所构成的组。全文摘要本发明涉及基因修饰过的tgb-3病毒序列，该序列适用于诱发基因沉默。特别地，基于该序列的发夹构建体被证实能高效地诱发ptgs机制，从而使得全部rna2降解。而当植物相应地被转化后，病毒在植物体内的传播速率显著下降或者传播受阻。本发明涉及发夹式构建体、该构建体的应用，并涉及含有这些构建体的植物、植物细胞和植物组织。文档编号c07k14/08gk101437840sq200780015913公开日2009年5月20日申请日期2007年5月2日优先权日2006年5月3日发明者于贝尔·吉耶,埃洛迪·克莱因,埃马纽利·劳伯,戴维·吉尔默,热拉尔·若纳尔,肯·理查兹申请人:西斯凡德尔哈维公众公司